一種根瘤菌及其用圖
【專利說明】一種根瘤菌及其用途 【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種根瘤菌，還涉及所述根瘤菌 的用途。 【【背景技術】】
[0002] 根瘤菌可以與豆科植物結瘤共生固氮，根瘤菌通過固定空氣中的氮氣轉化為氨， 從而為豆科植物提供氮素營養(yǎng)，而豆科植物為根瘤菌提供養(yǎng)分，兩者形成共生體系。由于根 瘤菌對豆科植物的侵染具有專一性和有效性，因此需要選育適合豆科植物的根瘤菌才能達 到共生效果。接種根瘤菌是國際上公認的生物固氮技術，生物固氮不會對環(huán)境造成任何污 染，同時改善土壤，促進植物生長，是可持續(xù)農業(yè)發(fā)展的重要措施。
[0003] 降香黃檀為豆科植物，是國家二級重點保護野生植物，其木材木質堅硬，紋理漂 亮，是制作古典硬木家具的上乘材料，其根部心材和樹干心材能代降香，供藥用，為良好的 鎮(zhèn)痛劑。另外，在福建、貴州等地還可作為綠化樹。多年來我國林業(yè)部門在研究"降香黃檀" 的育苗工作中投入了大量的人力、物力、財力，雖得以成功，但成活率較低，通過使用根瘤菌 劑可以與降香黃檀形成共生固氮體系，提高降香黃檀的成活率并促進植株長勢，對今后降 香黃檀的人工種植栽培具有重要意義。 【
【發(fā)明內容】
】
[0004] [要解決的技術問題]
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種根瘤菌（Rhizobiumsp. )LX-JX01。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述根瘤菌菌劑的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述根瘤菌菌劑的用途。
[0008] [技術方案]
[0009] 本發(fā)明是通過下述技術方案實現的。
[0010] 本發(fā)明涉及一種根瘤菌（Rhizobiumsp.)LX-JX01，該菌株已于2015年8月21日 在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCCNo. 11265。
[0011] 本發(fā)明還涉及一種根瘤菌LX-JX01菌劑制備方法。
[0012] 該制備方法的步驟如下：
[0013] A、液體DM培養(yǎng)基制備
[0014] 將1~3克酵母膏、8~12克蔗糖、1~3克硝酸鉀、0.4~0.6克磷酸氫二鉀、 0. 4~0. 6克磷酸二氫鉀與0. 1~0. 2克氯化鈉溶于蒸餾水中，并用蒸餾水定容到1000ml; 再使用無機酸或無機堿將其溶液的pH值調節(jié)至6. 8~7. 2,得到所述的液體DM培養(yǎng)基；
[0015] B、固體DM培養(yǎng)基制備
[0016] 按照每升液體DM培養(yǎng)基為18~20克瓊脂，往步驟A制備得到的液體DM培養(yǎng)基 加入瓊脂，加熱至l〇〇°C使其瓊脂溶解，然后在溫度40°C下進行冷卻使其DM培養(yǎng)基成為固 體狀態(tài)，于是得到所述的固體DM培養(yǎng)基；
[0017] C、菌株活化
[0018] 將保存于溫度4°C冰箱中在固體DM培養(yǎng)基斜面上的菌株CGMCCNo. 11265轉接到新 鮮配制的固體DM培養(yǎng)基平板上，劃線出單菌落，然后在溫度4°C的冰箱中保存待用；
[0019] D、根瘤菌培養(yǎng)
[0020] 用滅菌接種環(huán)從步驟C的固體DM培養(yǎng)基平板上挑取兩環(huán)單菌落，接種到150ml滅 菌液體DM培養(yǎng)基中，在搖床中在溫度26~30°C與轉速160~200轉/分鐘的條件下振蕩 培養(yǎng)70~75小時，通過常規(guī)鏡檢確定無雜菌便得到所述的液體根瘤菌菌劑。
[0021] 根據本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述的無機酸選自硫酸、鹽酸或磷酸；所述的無 機堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸氫鈉。
[0022] 根據本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的液體DM培養(yǎng)基是由1. 8~2. 2克酵母 膏、9~11克蔗糖、1. 8~2. 2克硝酸鉀、0. 45~0. 55克磷酸氫二鉀、0. 45~0. 55克磷酸 二氫鉀與0. 14~0. 16克氯化鈉制備得到的。
[0023] 根據本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的液體DM培養(yǎng)基是由2克酵母膏、10克 蔗糖、2克硝酸鉀、0. 5克磷酸氫二鉀、0. 5克磷酸二氫鉀與0. 15克氯化鈉制備得到的。
[0024] 本發(fā)明還涉及采用所述制備方法制備得到的根瘤菌LX-JX01菌劑。
[0025] 本發(fā)明還涉及所述的根瘤菌LX-JX01菌劑在促進降香黃檀生長中的用途。
[0026] 本發(fā)明還涉及所述的根瘤菌LX-JX01菌劑在降香黃檀育苗中的用途。
[0027] 下面將更詳細地描述本發(fā)明。
[0028] 本發(fā)明涉及一種根瘤菌（Rhizobiumsp.)LX-JX01，該菌株已于2015年8月21日 在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCCNo. 11265。
[0029] 本發(fā)明人于2010年5月從廣西憑祥市中國林科院熱林中心苗圃中采集了黃壤土 樣品，從中分離得到一株降香黃檀根瘤菌。
[0030] -、根瘤菌的獲得
[0031] 將常規(guī)表面消毒的降香黃檀種子經過浸泡、晾干處理后種植到所述的黃壤土中， 在60天后植株結瘤固氮。將根瘤取下，采用常規(guī)方法進行表面消毒，然后使用常規(guī)根瘤菌 分離培養(yǎng)基（文獻：許月蓉，"分離根瘤菌用的選擇培養(yǎng)基"，《土壤》、1988年03期）采用稀 釋涂布方法從中分離得到根瘤菌。經平板純化與后續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)鑒定、回接結瘤驗證，確定 將一株在固體分離培養(yǎng)基上生長的菌株命名為LX-JX01，該菌株與降香黃檀有共生結瘤固 氮的作用，初步確定該菌株是降香黃檀根瘤菌。
[0032] 二、根瘤菌的鑒定
[0033] 1、常規(guī)鏡檢
[0034] 分離得到的降香黃檀根瘤菌經過革蘭氏染色法染色結果為陰性。在通常甘露醇固 體平板培養(yǎng)基中在恒溫28 °C的條件下培養(yǎng)7天，可長出肉眼可見的直徑約2_表面光滑、邊 緣整齊的白色圓形菌落；在搖瓶中在所述的液體DM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，采用常規(guī)鏡檢，其形 態(tài)一頭空心不著色，其它部分是著色均勻的淺粉色，根據形態(tài)特征和習性可以確定它屬于 慢生型根瘤菌。
[0035] 2、1防rDNA序列測定：
[0036] 將分離得到的降香黃檀根瘤菌送到北京三博遠志生物技術有限責任公司進行測 序。經過比對，所鑒定的菌株與大豆根瘤菌的相似度為98%，所以斷定這個菌株為根瘤菌 屬。
[0037] 根瘤菌CGMCCNo. 11265菌株16SrRNA基因序列測定結果見附錄1。
[0038] 所鑒定的菌株與大豆根瘤菌（Rhizobiumjaponicum)同源性最高。
[0039] 3、生理生化鑒定
[0040] ①牛肉膏-蛋白胨檢測
[0041] 將根瘤菌LX-JX01菌株接種到牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基中在恒溫箱中在溫度28 °C下 培養(yǎng)5天。培養(yǎng)液澄清，菌體未見生長，與未接種菌株的對照相同，這表明該菌株不能在牛 肉霄-蛋白胨培養(yǎng)基上生長。
[0042] 牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基組成如下：5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化鈉、1000ml蒸餾 水，ρΗ7· 2。
[0043] 在這個步驟以及后續(xù)步驟所使用的恒溫培養(yǎng)箱是目前市場上銷售的產品。
[0044] ②ΒΤΒ反應
[0045] 將根瘤菌LX-JX01菌株在ΒΤΒ平板上在恒溫箱中在溫度28°C下培養(yǎng)7天。平板顏 色變藍，說明該菌株在BTB平板上產堿，屬于慢生型菌株。
[0046] BTB反應培養(yǎng)基組成如下：10g甘露醇、0· 8g酵母浸膏粉、0· 25g磷酸氫二鉀、0· 25g 磷酸二氫鉀、〇.2g硫酸鎂、0.lg氯化鈉、15-20g瓊脂、1000ml蒸餾水，lml以重量計0.25% 溴麝香草酚藍，PH6. 8-7. 0。
[0047] ③石蕊牛奶反應
[0048] 將根瘤菌LX-JX-01菌株接種到石蕊牛奶培養(yǎng)基中，在溫度28°C下培養(yǎng)7天，培養(yǎng) 基顏色變藍，并形成乳清環(huán)，表明該菌株產堿，屬于慢生型菌株。
[0049] 石蕊牛奶培養(yǎng)基組成如下：100ml脫脂牛奶，4ml2. 5%石蕊溶液，低壓滅菌。
[0050] ④3-酮基乳糖反應
[0051] 根瘤菌LX-JX01菌株的反應呈陰性，菌落周圍未出現黃褐色沉淀，表明該菌株為 非土壤桿菌。
[0052] 3-酮基乳糖培養(yǎng)基組成如下：10g乳糖、lg酵母浸膏粉、1000ml蒸餾水、15-20g瓊 脂，ρΗ7· 2。
[0053] 綜合以上鑒定結果表明，根瘤菌菌株CGMCCΝ〇11265為大豆慢生型根瘤菌 (Rhizobiumjaponicum)〇
[0054] 本發(fā)明涉及一種根瘤菌LX-JX01菌劑制備方法。
[0055] 該菌劑的制備方法的步驟如下：
[0056] A、液體DM培養(yǎng)基制備
[0057] 將1~3克酵母膏、8~12克蔗糖、1~3克硝酸鉀、0.4~0.6克磷酸氫二鉀、 0. 4~0. 6克磷酸二氫鉀與0. 1~0. 2克氯化鈉溶于蒸餾水中，并用蒸餾水定容到1000ml; 再使用無機酸或無機堿將其溶液的pH值調節(jié)至6. 8~7. 2,得到所述的液體DM培養(yǎng)基。
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