Egfr基因突變檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種EGFR基因突變檢測試劑盒，包括：（1）用于擴增樣本中EGFR基因Exon18、19、20和21四個外顯子的特異性引物；（2）用于測序PCR的測序引物；（3）4個裝有EGFR野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒按1:1比例混合的陽性質(zhì)控品管和1個裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管。本發(fā)明的各種引物長度在20?25個堿基之間，無特殊修飾；反應(yīng)液預(yù)混液采用獨特的配方及比例；不同外顯子的PCR擴增條件一致，且能在樣本濃度較低時檢測到目的基因，結(jié)果無非特異性擴增。
【專利說明】
EGFR基因突變檢測試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種試劑盒，具體設(shè)及一種腫瘤相關(guān)基因 EGFR基因突變檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類表皮生長因子受體(Epidermal growth factor rec邱tor,EGFR)基因定位于 7pl3-q22區(qū)，全長200Kbp，由28個外顯子組成，編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為170000化，具 有酪氨酸激酶(tyrosine kinase, TK)活性，是一種細胞膜表面的糖蛋白受體，是傳遞細胞 外信號到細胞核內(nèi)的重要途徑蛋白。EGFR與其配體結(jié)合后形成同源二聚體，也可與其他TK 受體形成異源二聚體，導(dǎo)致胞內(nèi)TK區(qū)的激活，啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)，將信號傳到細胞核內(nèi)， 最終引起一系列相關(guān)基因活化，導(dǎo)致腫瘤細胞增殖、調(diào)亡抑制，促使腫瘤細胞轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致 放、化療耐受，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。多個文獻報道顯示，EGFR在胃癌、 膜腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗癌W及膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中存在突變 或過表達，并在其發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。
[0003] 目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤細胞EGFR基因突變的主要形式：（1)點突變:主要集中在EGFR-TK 區(qū)，導(dǎo)致翻譯后的氨基酸變異或翻譯提前終止；（2)基因擴增:指基因整體拷貝數(shù)量的增加；
[3] 基因片段插入或缺失，主要見于巧巾情況，一是20號外顯子的小片段插入;二是19號外顯 子內(nèi)部出現(xiàn)短序列的缺失-框內(nèi)缺失;S是EGFR突變變異體m的出現(xiàn)，運是由于基因重排或 選擇性mRNA剪切導(dǎo)致細胞膜外配體結(jié)合區(qū)2-7外顯子缺失?；谏鲜鐾蛔冃问疆a(chǎn)生變異的 不完整蛋白可W自身激活TK，并引發(fā)下游信號通路的激活。
[0004] EGFR是結(jié)直腸癌和肺癌祀向治療的主要祀點之一。目前針對EGFR的祀向治療策略 主要有兩大類:一類是針對EGFR受體胞外區(qū)的單克隆抗體，如：西妥昔單抗和帕尼單抗;另 一類是抑制EGFR胞內(nèi)區(qū)TK的小分子化合物.雖然兩類藥物的作用部位不同，但通過競爭性 阻滯配體與EGFR的結(jié)合及阻斷下游信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終產(chǎn)生相似的效果，即阻滯腫瘤細胞 在Gl期、促進調(diào)亡、抑制新生血管形成、抑制侵襲和轉(zhuǎn)移，從而起到治療腫瘤的作用。目前臨 床上常見的EGFR TK抑制劑有吉非替尼(gefitin化，ZD1839)、埃羅替尼(erlotin化，OSI-774)、邸B-569。
[0005] 由于EGFR祀向藥物費用昂貴，很多患者沒有機會獲得運些最新的治療。另外，即使 有條件獲得運種治療，多數(shù)患者也不一定能獲得理想的療效。所W，準確預(yù)測EGFR祀向治療 的意義非常重大。
[0006] EGFR基因突變的檢測主要有Sanger測序法、ARMS、FI甜等。其中FISH技術(shù)主要適用 于拷貝數(shù)變異的檢測，同時由于操作過程繁瑣，該方法W逐漸顯現(xiàn)其局限性;ARMS技術(shù)是目 前國內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，但只能檢測已知的位點，且要將樣本分成多個管進行實驗才 能實現(xiàn)分型，對樣本量要求高；而Sanger測序法是DNA序列分析的經(jīng)典方法，最直接的、可檢 測已知和未知突變的一種方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認為是基因分型 的金標準，其主要優(yōu)點是測序長度較長，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點，包括一些新的少見的突變形 式及突變的確切類型，如點突變、片段缺失。所W探索一種Sanger測序法檢巧化GFR基因的技 術(shù)具有重要的臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，提供一種EGFR基因突變檢測試劑盒，可直接 利用含人體某組織部位的石蠟包埋樣本通過Sanger測序法檢測出樣本中EGFR基因主要突 變位點型別，檢測位點包括EGFR基因18、19、20和21四個外顯子的主要突變位點，包括但不 限于18號外顯子上c.2156G〉C，p.G719A突變位點；19號外顯子上c.2235-2249dell5， P .E746A750de化LREA缺失突變位點；20號外顯子上C. 23960T，pT790M突變位點；21號外顯 子上C. 2573T〉G，PL858R突變位點。
[0008] 本發(fā)明的EGFR基因突變檢測試劑盒具體包括： (1)用于擴增樣本中EGFR基因 Exonl8、19、20和21四個外顯子的特異性引物，具體序列 如下：
(2 )用于測序PCR的測序引物，分別用于對EGFR基因 Exonl 8、19、20和21四個外顯子進行 測序分析，具體序列如下：
(3)4個裝有EGFR野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒按1:1比例混合的陽性質(zhì)控品管和1個裝有 PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管；其中突變型質(zhì)粒包括18號外顯子上c.2156G〉C，p.G719A突變位點； 19號外顯子上c.2235-2249dell5，p.E746A750del化REA缺失突變位點；20號外顯子上 C. 23960T，PT790M突變位點；21號外顯子上C. 2573T〉G，PL858R突變位點;PCR反應(yīng)預(yù)混液由 W下組份組成：

其中l(wèi)〇x PCR buffer中含有500 mM KCiaoo mM Tris-HCl (pH 8.3),100 mM (N也） 2S〇4,和 15 mM MgCl2;5x Q solution 中含有IM Tricine [p冊.7(with KOH)]，8〇/〇 (v/v) Glycero巧P5% (v/v) DMS0;25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和 25mM dGTPso
[0009] 本試劑盒主是根據(jù)EGFR基因的Exonl8、19、20和21四個外顯子的保守序列分別設(shè) 計EGFR基因四個外顯子的特異性引物，分別將Exonl8、19、20和21號外顯子使用PCR的方法 進行擴增，純化回收擴增產(chǎn)物。本發(fā)明的各種引物長度在20-25個堿基之間，無特殊修飾。反 應(yīng)液預(yù)混液采用獨特的配方及比例。不同外顯子的PCR擴增條件一致，且能在樣本濃度較低 時檢測到目的基因，結(jié)果無非特異性擴增。具體操作流程包括： (1)引物設(shè)計:利用引物設(shè)計軟件，如Primer Premier 5，從EGFR基因 DNA序列中挑選特 定的序列，然后根據(jù)堿基互補特點，設(shè)計EGFR基因 Exonl8、19、20和21四個外顯子的特異性 引物，用于擴增樣本中DNA。測序引物的設(shè)計與用于擴增樣本中DNA的特異性引物的設(shè)計類 似，不過測序引物只需要一段即可，引物序列分別是SEQ ID N0s:9-12。長度在21-25個堿基 左右。
[0010] (2)PCR擴增:利用試劑盒中含特定序列的引物PCR擴增臨床樣本中的DNA。
[0011] (3)瓊脂糖凝膠電泳及膠回收：將擴增得到的目的基因 EGFR的Exonl8、19、20和21 四個外顯子片段回收用于測序。
【附圖說明】
[0012] W下是附圖的說明，W便于理解上述發(fā)明的目的和具體特征。
[OOU]圖訪EGFR基因的Exonl8、19、20和21四個外顯子的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié) 果。
[0014]附圖1中各標記的具體表示如下： 1:1號樣本;2:2號樣本;3:3號樣本;4:4號樣本;5:5號樣本;6:6號樣本；18: EGFR基因第 18號外顯子；19:EGFR基因第19號外顯子；20:EGFR基因第20號外顯子；21:EGFR基因第21號 外顯子;M:DNA maker，從上到下大小依次為2000、1000、750、500、250和100。
[001引圖2-1為EGFR基因的ExonlS外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為野生型。
[0016]圖2-2為EGFR基因的ExonlS外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為突變體。
[0017]圖2-3為EGFR基因的Exonig外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為野生型。
[001引圖2-4為EGFR基因的Exonig外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為突變體。
[0019] 圖2-5為EGFR基因的Exon20外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為野生型。
[0020] 圖2-6為EGFR基因的Exon20外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為突變體。
[0021] 圖2-7為EGFR基因的Exon21外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為野生型。
[0022] 圖2-8為EGFR基因的Exon20外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為突變體。
【具體實施方式】
[0023] 1、引物設(shè)計 根據(jù)EGFR基因在肺癌等疾病中的突變情況及個體化治療后產(chǎn)生的耐藥機制，利用引物 設(shè)計軟件，如Primer Premier 5,從EGFR基因 DNA序列中挑選特定的序列，然后根據(jù)堿基互 補特點，設(shè)計EGFR基因虹〇1118、19、20和21四個外顯子的特異性引物，用于擴增樣本中0魁。 引物序列分別是SEQ ID Nos: 1-8。
[0024] 巧U序引物的設(shè)計與用于擴增樣本中DNA的特異性引物的設(shè)計類似，不過測序引物 只需要一段即可，引物序列分別是SEQ ID Nos:9-12。長度在21-23個堿基。
[0025] 2、PCR 擴增 2.1、質(zhì)巧品準備 陽性質(zhì)控品為EGFR野生型和突變型質(zhì)?；旌衔铮幮再|(zhì)控品為無菌水。使用前室溫融 化，旋滿振蕩10秒，瞬時離屯、10秒。
[0026] 2.2、試劑配制 提前將試劑取出，室溫融化，旋滿振蕩10秒，瞬時離屯、10秒。
[0027] 確定反應(yīng)數(shù)N，N=待檢樣本數(shù)(n) X 4+質(zhì)控品數(shù)+1。計算加到反映混合物中的各個 試劑的量，計貸化下：
取一個滅面離屯、菅配制上還反應(yīng)體《，試劑全部加入后旋渦振蕩10砂，瞬時離屯、。然后 將上述混合液按20iil/管分裝至PCR反應(yīng)管中。
[002引 2.3、加樣 將EGFR陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和樣本DNA分別取2.5 iil加入至化CR反應(yīng)管中，其中樣 本要稀釋至20ngAU;然后再將相應(yīng)的引物加入到對應(yīng)的PCR反應(yīng)管中，每個樣本需要引物 各加2.扣1(引物用之前先稀釋1/10至1化M)，同時作好標記，蓋緊管蓋后，瞬時離屯、15秒，將 管壁上的液體全部甩至管底，消除氣泡，可重復(fù)離屯、至氣泡完全消除。然后立即進行PCR擴 增反應(yīng)。
[0029] 2.4、PCR 擴增 配置完成后，將PCR管放入PCR儀進行反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序如下： 3、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及回收
由于PCR產(chǎn)物長度較短，配制2%(w/w)的瓊脂糖凝膠；電泳條件為120V，20min。電泳完成 后，取出凝膠，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，并記錄擴增條帶情況。如果PCR產(chǎn)物電泳結(jié) 果良好，即可回收目的片段用于測序。本試劑盒不包含核酸回收成分，請采用商品化的瓊脂 糖凝膠回收試劑盒?；厥盏玫降漠a(chǎn)物即可用于測序。
【主權(quán)項】
1. 用于EGFR基因突變檢測的Exonl8、19、20和21四個外顯子的特異性引物，引物序列分 別是SEQ ID Nos: 1-8。 2. EGFR基因突變檢測試劑盒，包括： (1) 用于擴增樣本中EGFR基因 Exonl8、19、20和21四個外顯子的特異性引物，引物序列 分別是SEQ ID Nos: 1-8; (2) 用于測序PCR的測序引物，分別用于對EGFR基因 Exonl8、19、20和21四個外顯子進行 測序分析，引物序列分別是SEQ ID Nos:9-12; (3) 4個裝有EGFR野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒按1:1比例混合的陽性質(zhì)控品管和1個裝有 PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管，其中突變型質(zhì)粒包括18號外顯子上c.2156G>C，p.G719A突變位點； 19號外顯子上c.2235-2249dell5，p.E746A750delELREA缺失突變位點；20號外顯子上 c · 2396C>T，pT790M突變位點；21號外顯子上c · 2573T>G，pL858R突變位點。3. 權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，PCR反應(yīng)預(yù)混液由以下組份組成：其中 10? PCR buffer中含有500 mM KC1，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH4) 2SO4,和 15 mM MgCl2;5；^ Q solution 中含有 1M Tricine [pH8.7(with K0H)]，8% (v/v) Glycerol和5% (v/v) DMS0;25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和 25mM dGTPs〇
【文檔編號】C12Q1/68GK105861650SQ201610209729
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】鄭焱, 陳俊飛, 陳華梅, 謝龍旭
【申請人】廣東凱普生物科技股份有限公司