一種醇脫氫酶及其在合成度羅西汀中間體中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種醇脫氫酶，含有編碼該酶的核酸序列的 重組表達載體和重組表達轉(zhuǎn)化體，表達的重組酶和該重組酶的制備方法，以及該醇脫氫酶 作為催化劑在不對稱合成度羅西汀中間體中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抑郁癥又稱抑郁障礙，以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，是心境障礙的 主要類型。抑郁癥包括單相性抑郁癥（即重性抑郁癥和精神抑郁癥）、適應(yīng)性障礙、輕微抑 郁癥、季節(jié)情感性精神障礙（SAD)、經(jīng)前期焦慮癥（PMDD)、產(chǎn)后抑郁癥、非典型抑郁癥、雙相 性精神障礙及躁郁癥等多種類型。抑郁癥的發(fā)病機制尚未完全明確，目前研究認為與遺傳、 心理、神經(jīng)內(nèi)分泌等因素誘發(fā)中樞去甲腎上腺素或5-羥色胺（5-HT)、多巴胺（DA)、乙酰膽 堿（Ach)、神經(jīng)肽等神經(jīng)遞質(zhì)含量降低及其受體功能下降有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥還 與谷氨酸（也是一種中樞神經(jīng)遞質(zhì)）傳導功能障礙有關(guān)。目前的抑郁癥診斷標準都比較 強調(diào)精神癥狀，相對忽視軀體癥狀。一項國際研究提7K，69 %的抑郁癥患者存在軀體癥狀。 77 %主訴精神癥狀的抑郁癥患者得到診斷，而僅有22 %主訴軀體癥狀的抑郁癥患者得到診 斷。忽視軀體癥狀導致抑郁癥被誤診或漏診，使患者輾轉(zhuǎn)于其他臨床科室尋求治療，既延誤 了患者的診治，也浪費了醫(yī)療資源。世界衛(wèi)生組織2005年統(tǒng)計，各種抑郁癥的患病率約占 全球人口的11 %。在中國，目前抑郁癥的患病率約為3%~5%，抑郁癥患者估計有3600萬 人。與高發(fā)病率形成鮮明反差的是，目前全國地市級以上醫(yī)院對抑郁癥的識別率不到20%。 而在現(xiàn)有抑郁癥患者中，只有不到10%的人接受了相關(guān)藥物治療。抑郁癥在我國造成的直 接經(jīng)濟負擔約為141億元，間接經(jīng)濟損失約481億元，總經(jīng)濟負擔達到621億元。據(jù)世界衛(wèi) 生組織（WHO)發(fā)表的《世界衛(wèi)生報告》顯示，抑郁癥目前已成為世界第四大疾患，到2020年 抑郁癥可能成為僅次于心臟病的第二大疾病。
[0003] 度羅西汀是禮來公司的主打產(chǎn)品，用于治療成人抑郁障礙。度羅西汀是5-羥色胺 (5-HT)和去甲腎上腺素再吸收雙重抑制劑，能有效治療抑郁癥的情緒癥狀和軀體癥狀，彌 補了當前主流抗抑郁藥在軀體疼痛癥狀治療方面的不足。該藥于2004年底在美國首先上 市，2006年全球銷售額達到13. 16億美元，比2005年增長了近1倍。同年，度羅西汀在美 國市場已超越所有抗抑郁藥，成為市場增長份額最快的產(chǎn)品。2009年銷售額為30. 75億美 元，同比又增長了 14%。該藥物目前由美國禮來公司（EliLilly)和德國勃林格殷格翰公司 (Boehringerlngelheim)聯(lián)合在全球范圍內(nèi)營銷，已在全球70多個國家上市，并于2007年 4月進入我國，商品名為"欣百達"。
[0004] 度羅西汀合成中的關(guān)鍵步驟是手性羥基中間體的構(gòu)建。美國專利US5023269公 開了一種合成度羅西汀的方法，將3-二甲胺基-1-(2-噻吩基）-1-丙酮鹽酸鹽用硼氫 化鈉還原，然后通過重結(jié)晶來構(gòu)建。CN101391991公開了 2-乙酰噻吩與多聚甲醛和二甲 胺鹽酸鹽發(fā)生Mannich反應(yīng)制備3-二甲胺基-1-(2-噻吩基）-1-丙酮鹽酸鹽的方法。 CN103013898公開了N，N-二甲基-3-氧基-(2-噻吩）-1-丙胺鹽酸鹽在醇脫氫酶作用下轉(zhuǎn) 化為（s) -N，N-二甲基-3-羥基-2- (2-噻吩）-1-丙胺的方法，其光學純度可達到97. 5 %。CN103421854公開了 3-(二甲胺基）-1-(噻吩-2-基）-1-丙酮在酮還原酶與葡萄糖脫氫酶 的組合作用下轉(zhuǎn)化為（S)-3-(二甲胺基）-1-(噻吩-2-基）-1-丙醇的方法。上述方法或 多或少存在反應(yīng)收率低、原料成本昂貴、反應(yīng)不完全、對應(yīng)選擇性不高或者添加了價格昂貴 的輔酶的缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對已報道的不對稱還原制備（S)-3_二甲氨 基-1-噻吩基-1-丙醇反應(yīng)中收率低、原料成本昂貴、反應(yīng)不完全、對應(yīng)選擇性不高或者添 加了價格昂貴的輔酶等問題，提供了一種催化活性高、對映選擇性強、底物耐受性好的醇脫 氫酶，以及使用該醇脫氫酶催化合成（S)-3-取代胺基-1-(噻吩-2-基）-1-丙醇，進而進 一步合成度羅西汀的酶-化學合成方法。還提供了編碼該醇脫氫酶的核酸序列，含有該核 酸序列的重組表達載體、重組表達轉(zhuǎn)化體及該醇脫氫酶的制備方法，以及該醇脫氫酶在催 化羰基底物不對稱還原中的用途。
[0006] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案以解決上述技術(shù)問題：
[0007]本發(fā)明的第一方面提供了一種醇脫氫酶，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋白質(zhì)：
[0008] (a)由SEQIDNo:2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0009] SEQIDNo:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)由環(huán)境DNA編碼，具有醇脫氫酶的功 能，是一種新的醇脫氫酶。
[0010] (b)在（a)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸殘基衍生的 具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
[0011] 其中，所述的"幾個"是指2個至100個，更佳地小于30個，最佳地小于10個。比 如添加一個外分泌信號肽的融合蛋白，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這樣的融合蛋白同樣具有醇脫氫酶活 性。也就是說，只要由（a)衍生的蛋白質(zhì)具有醇脫氫酶活性，且衍生方式如上所述，都可以 達到本發(fā)明的發(fā)明目的。根據(jù)本發(fā)明，在如SEQIDN〇:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)（a)分 子中進行1~5個氨基酸殘基的突變，仍然保持醇脫氫酶活性。
[0012] (c)與（a)的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性且具有醇脫 氫酶活性的蛋白質(zhì)。
[0013] SEQIDNo:2所示的醇脫氫酶和其他已知醇脫氫酶，如短小高加索乳桿菌醇脫氫 酶之間的同一性為76%。本發(fā)明的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示的醇脫氫酶與已知醇脫 氫酶的氨基酸序列的同一性低于80 %，具有顯著差異性。
[0014] 在本文中，氨基酸序列之間的同一性是根據(jù)序列的全長進行計算，優(yōu)選采用NCBI Blastp程序進行比對，默認參數(shù)。
[0015] 本發(fā)明的第二個方面提供了一種分離的核酸，其編碼本發(fā)明的醇脫氫酶。優(yōu)選地， 所述核酸是由SEQIDNo: 1所示核苷酸序列組成的。
[0016] 由SEQIDNo: 1所示的核苷酸序列組成的核酸來源于環(huán)境基因組DNA，其可以從環(huán) 境基因組中分離獲得，也可以從含有該核酸的重組表達載體中或重組轉(zhuǎn)化體中分離獲得， 也可以全基因人工合成獲得。
[0017] 本發(fā)明中，SEQIDNo:l所示的基因命名為BYK-CR，全長750bp。其中，其編碼序 列（CDS)從第1個堿基起至第747個堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。該序 列無內(nèi)含子，其編碼的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo:2所示。
[0018] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，由于密碼子的簡并性，編碼SEQIDNo:2的氨基酸序列的 核酸序列不僅僅局限于SEQIDNo: 1。本發(fā)明的醇脫氫酶基因的核酸序列也可以是編碼序 列表中SEQIDN〇:2所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。另外，還可以通過適當引入替 換、缺失或插入來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發(fā)明中多聚核苷酸的同系物可以通過 對核酸序列SEQIDNo: 1的一個或多個堿基在保持酶活性范圍內(nèi)進行替換、缺失或添加來 制得。
[0019] SEQIDNo: 1的同系物也指啟動子變體。在所述的核酸序列之前的啟動子或信號 序列可通過一個或多個核酸的替換、插入或缺失而改變，但這些改變對啟動子的功能沒有 負面影響。而且通過改變啟動子的序列或甚至用來自不同種生物體的更有效的啟動子完全 替換，可提商目標蛋白的表達水平。
[0020] SEQIDNo: 1的同系物還指在標準條件下能夠與SEQIDNo: 1所示序列的核酸 進行雜交的核酸序列。在標準條件下進行雜交可根據(jù)《分子克隆實驗指南》中描述的方 式進行：ColdSpringHarborLaboratoryPress，分子生物學中的通用方案（Current ProtocolsinMolecularBiology)。具體來說，雜交可以按照如下步驟進行：將一個載有 被轉(zhuǎn)錄的待測DNA或RNA分子的膜與一個標記探針在雜交緩沖液中進行雜交；雜交緩沖 液的組成為〇·lwt%SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀釋抑制劑以及2~8XSSC; 20XSSC為3M氯化鈉和0. 3M的檸檬酸組成的溶液；雜交溫度為50~70°C;在培養(yǎng)幾個小 時或過夜后，用清洗緩沖液清洗膜；清洗溫度為室溫，更優(yōu)選為雜交溫度；清洗緩沖液的組 成為6XSSC+0.lwt%SDS溶液，更優(yōu)選為5XSSC+0.lwt%SDS;當用這種清洗緩沖液清洗 完膜后，就可以通過在DNA或RNA分子內(nèi)被雜交的探針上的標記來識別DNA或RNA分子。 [0021 ] 本發(fā)明的第三個方面提供了一種包含本發(fā)明的編碼醇脫氫酶的核酸序列的重組 表達載體。其可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明所述的編碼醇脫氫酶或其突變體的核酸序列 連接于各種表達載體上構(gòu)建而成。所述的表達載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如市售的 質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選質(zhì)粒pET28a。較佳地，可通