專利名稱：使用乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白增加光合作用碳固定的方法
使用乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白增加光合作用碳固定的方法農(nóng)作物產(chǎn)量受很多因素影響，其中一方面是影響植物生產(chǎn)生物量能力的因素(光合作用，養(yǎng)分和水分的吸收)，和另一方面是影響植物抵抗某些壓力，例如生物壓力(昆蟲，真菌，病毒…)或非生物壓力(干旱，鹽度，營養(yǎng)缺乏· · ·)能力的因素。影響植物生產(chǎn)生物量的一個重要因子是光合作用。通過光合作用的機理，植物俘獲大氣二氧化碳并轉(zhuǎn)化為糖，然后納入植物組織中，從而產(chǎn)生生物量。光合作用是地球上所有初級生產(chǎn)力的最終來源。大部分植物有光合作用機理，其中葉綠體蛋白質(zhì)酶RuBisCo (核酮糖-1，5_ 二磷酸羧化酶/加氧酶)是主要的獲取二氧化碳和將其轉(zhuǎn)化成糖的酶。那些植物屬于所謂的C3植物，包括一些最重要的農(nóng)作物，例如水稻、小麥、大麥、馬鈴薯、油菜籽。C3植物光合作用機理的一個已知問題是碳固定效率在某些環(huán)境條件下不是最佳，其中部分碳固定通過稱為氧化的RuBisCo其他活性，而喪失。 RuBisCO能催化核酮糖-1，5_ 二磷酸的羧化和氧化。兩種活性之間的平衡主要取決于植物對某些環(huán)境條件反應后改變的葉中co2/o2比率。每個羧化反應生成兩分子磷酸甘油酸鹽，進入卡爾文循環(huán)，最終形成淀粉和蔗糖并產(chǎn)生核酮糖-1，5-二磷酸。氧化反應生成單分子的磷酸甘油酸和磷酸乙醇酸。后者通過光呼吸作用重新循環(huán)為磷酸甘油酸(LeegoodR.C.等，1995)。每生成兩分子磷酸乙醇酸，釋放一分子CO2，造成碳固定的凈損失，最終降低糖和生物量的生成。氨在此反應中也損失，并需要通過葉綠體中能量消耗反應重新固定。已經(jīng)報道克服光呼吸作用作為提高光合作用最大效率和增加產(chǎn)量的目標(Zhu等，2008)，并且迄今已描述一些嘗試來降低植物中碳損失并因此提高糖和生物量生產(chǎn)。Kebeish等報道阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)中光呼吸作用的損失可通過向葉綠體中引入光呼吸作用中間物乙醇酸分解代謝的細菌通路來緩解(WO 03/100066 ;Kebeish R.等,2007)。作者首先將大腸桿菌(Escherichia coli)乙醇酸脫氫酶酶的三個亞基靶向阿拉伯芥葉綠體，然后引入大腸桿菌乙醛酸連接酶和大腸桿菌羥基丙二酸半醛還原酶以完成此通路，與內(nèi)源光呼吸通路平行轉(zhuǎn)化乙醇酸成甘油酸。五個大腸桿菌基因的逐步核轉(zhuǎn)化產(chǎn)生其中葉綠素乙醇酸直接轉(zhuǎn)化為甘油酸的阿拉伯芥植物。這些轉(zhuǎn)基因植物生長更快，生產(chǎn)更多芽和根生物量，并包括可溶性更高的糖。PCT/EP2009/059843描述水稻植物中增加生物量生產(chǎn)和/或種子生產(chǎn)和/或碳固定的方法，其中水稻植物用大腸桿菌乙醇酸脫氫酶三個亞基(glcD, glcE和glcF)轉(zhuǎn)化,沒有后續(xù)引入大腸桿菌乙醛酸連接酶和大腸桿菌羥基丙二酸半醛還原酶。本發(fā)明目標是使用細菌多個亞基乙醇酸脫氫酶(GDH)在農(nóng)作物中的翻譯融合，避免耗費時間和多個轉(zhuǎn)化或多個表達盒轉(zhuǎn)化的繁瑣過程。細菌(glcD，glcE和glcF)亞基已經(jīng)與靈活接頭以不同配置融合，并在大腸桿菌GDH缺陷株中檢測，顯示重組GDH多個亞基融合蛋白DEFp, EFDp和FDEp有活性。性能最好的構(gòu)建體已經(jīng)轉(zhuǎn)入煙草(Nicotiana tabacum),水稻和油菜籽植物，并且轉(zhuǎn)基因植物顯示明顯增加的生長和提高的光合作用率。本發(fā)明涉及植物中增加生物量生產(chǎn)和/或種子生產(chǎn)和/或碳固定的方法，所述方法包括向植物細胞基因組引入編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白的核酸，其中所述引入所述核酸可從頭表達有乙醇酸脫氫酶酶活性的合成多肽，并且其中所述一個多肽定位在所生成植物的葉綠體中。發(fā)明背景中，乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白是由對乙醇酸脫氫酶活性必須的乙醇酸脫氫酶亞基組成的一個多肽，一般在這些亞基之間有肽接頭。本發(fā)明中，我們選擇適于將細菌glcD,glcE和glcF結(jié)構(gòu)域共價連接成多蛋白形式的重復接頭序列(Gly4Ser)3，而不干擾所需屬性，例如正確折疊，溶解性和⑶H活性。另外，接頭不應被植物細胞質(zhì)中的蛋白酶切割，使葉綠體中多蛋白可過量表達。發(fā)明背景中，生物量是由單個植物或植物生長表面積產(chǎn)生的物質(zhì)量?？梢詼y量幾個參數(shù)以測定生物量生產(chǎn)的增加。這些參數(shù)的示例是植物高度，葉片的表面積，芽干重，根干重，種子數(shù)目，種子重量，種子大小…。種子生產(chǎn)或種子產(chǎn)率能在 每個單獨植物或植物生長的每個表面積測量。這些參數(shù)一般在土壤生長測定期或生長特定步驟后測量，例如在植物營養(yǎng)生長期結(jié)束時，并且對比根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化一個或多個核酸的植物和未轉(zhuǎn)化一個或多個這種核酸的植物。植物碳固定的增加能通過測量氣體交換和葉綠素熒光參數(shù)來測定。一種使用LI-6400系統(tǒng)(力高泰公司(Li-Cor))和生產(chǎn)商所提供軟件的便利方法描述于R. Kebeish等，2007，并通過引用納入本文。發(fā)明方法涉及的核酸編碼有乙醇酸脫氫酶酶活性的一個多肽。乙醇酸脫氫酶活性能根據(jù)Lord J. Μ. 1972測定，使用本申請實施例6所述的技術(shù)?；蛘?，可用缺失形成活性內(nèi)源乙醇酸脫氫酶的三個亞基的大腸桿菌突變體進行互補分析。這些大腸桿菌突變體不能以乙醇酸作為唯一碳來源生長。當這些缺陷型突變體內(nèi)過量表達酶使得細菌恢復在含有乙醇酸作為唯一碳來源的培養(yǎng)基上生長時，意味著該酶編碼大腸桿菌乙醇酸脫氫酶的功能等價物?；パa分析的方法和方式描述于Bari等，2004，并通過引用納入本文。編碼有乙醇酸脫氫酶酶活性的一個多肽的核酸分子可以通過重組DNA技術(shù)(如PCR)或化學合成方法生產(chǎn)。所述核酸分子的鑒定和分離可通過使用已知乙醇酸脫氫酶核酸分子的序列，或部分序列，或在這些分子的反義互補鏈情況中，例如通過根據(jù)標準方法雜交(見如 Sambrook 等，1989)0用于本發(fā)明目的的乙醇酸脫氫酶可以是任何天然產(chǎn)生的乙醇酸脫氫酶，或其任何活性片段或其任何變體，其中一些氨基酸(優(yōu)選1-20氨基酸，更優(yōu)選1-10，甚至更優(yōu)選1-5)被替換、添加或刪除，從而該酶保留乙醇酸脫氫酶活性。根據(jù)本發(fā)明，“核酸”或“核酸分子”理解為多核苷酸分子，其可以是DNA或RNA類型，優(yōu)選DNA類型，并特定是雙鏈。其可是是天然或合成來源。合成核酸由體外生產(chǎn)。這些合成核酸的示例是那些本發(fā)明所述有乙醇酸脫氫酶酶活性的多肽的編碼密碼子已經(jīng)根據(jù)要在其中表達的宿主生物體優(yōu)化(例如,通過將密碼子替換為這種宿主生物體或宿主生物體所屬組的密碼子使用表內(nèi)相較原始宿主更優(yōu)選或最優(yōu)選的密碼子)。密碼子優(yōu)化方法為技術(shù)人員熟知。優(yōu)選乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白由細菌乙醇酸脫氫酶亞基的融合組成，更優(yōu)選由大腸桿菌glc 操縱子的三個必要亞基(gi/1141710/gb/L43490. 1/EC0GLCC)的融合組成。最優(yōu)選包括SEQ ID NO:2 (Glc D)，4 (Glc E)和6 (Glc F)的融合氨基酸序列的多肽，其中這些氨基酸序列可以通過接頭連接。因此，包括ID NO: 1，3和5多核苷酸序列的核酸能用于操作本發(fā)明。本發(fā)明方法包括向植物細胞基因組引入編碼有乙醇酸脫氫酶酶活性的乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白的核酸，其中所述多肽包括在氨基酸序列水平分別與SEQ ID N0:2、4和6有至少60、70、80或90%序列相同性的序列，特定是至少95%、97%、98%或至少99%，其中引入核酸可從頭表達有乙醇酸脫氫酶酶活性的一個多肽，并且其中所述活性定位在葉綠體內(nèi)。本發(fā)明方法也包括向植物細胞基因組引入編碼有乙醇酸脫氫酶酶活性的乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白的核酸，其中所述核酸包括在核苷酸序列水平分別與SEQ ID NO: K3和5有至少60、70、80或90%序列相同性的序列，特定是至少95%、97%、98%或至少99%，其中引入核酸可從頭表達有乙醇酸脫氫酶酶活性的至少一個多肽，并且其中所述活性定位在 葉綠體內(nèi)。為了本發(fā)明目的，用百分比表示的兩個相關核苷或氨基酸序列的“序列相同性”指兩個最佳比對序列中，相同殘基的位點數(shù)目(xlOO)除以比較位點數(shù)目。缺口，即比對中某一殘基在一個序列中出現(xiàn)但另一個中沒有，認為此比對中的位點是殘基不相同的位點。兩個序列的比對能通過EMBOSS (Rice等，2000)中Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)用默認設置(缺口開放罰分10，缺口延伸罰分O. 5)完成，從而在整體序列長度上找到最優(yōu)比對。一旦外源DNA序列已知，能通過分子生物學技術(shù)開發(fā)特異性識別樣品核酸(DNA或RNA)中這些序列的引物和探針。例如,能開發(fā)PCR方法來鑒定生物樣品(例如植物樣品,植物物質(zhì)或包含植物物質(zhì)的產(chǎn)物)中用于發(fā)明方法的基因(gdh基因)。這種PCR基于至少兩個特異性“引物”，例如兩者都識別用于本發(fā)明的gdh編碼區(qū)內(nèi)的序列(例如編碼區(qū)SEQ IDNo. 1，，3，5)，或一個識別gdh編碼區(qū)內(nèi)的序列而另一個識別結(jié)合的轉(zhuǎn)運肽內(nèi)序列或調(diào)控區(qū)序列，例如啟動子或包括本發(fā)明所用gdhDNA的嵌合基因的3’末端。優(yōu)選引物有15-35核苷序列，在最優(yōu)PCR條件下，特異性識別本發(fā)明所用gdh嵌合基因內(nèi)的序列，從而特異片段(“整合片段”或識別擴增子)擴增自含有本發(fā)明所用gdh基因的核酸樣品。這意味這只有目標整合片段，而沒有植物基因組中其他序列或外源DNA在最優(yōu)PCR條件下被擴增。本發(fā)明方法也包括向植物細胞基因組引入編碼有乙醇酸脫氫酶酶活性的乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白的核酸，其中所述一個核酸在嚴謹條件下與選自SEQ ID N0:l、3和5的核苷序列雜交，其中引入核酸可從頭表達一個有乙醇酸脫氫酶酶活性的多肽，并且其中所述活性定位在葉綠體內(nèi)。本文所用的嚴謹雜交條件特別指下列條件在濾器上固定相關DNA序列，并且所述濾器在50%甲酰胺、5%SSPE、2x Denhardt試劑和O. 1%SDS中于42° C預雜交1-2小時，或在6x SSC、2xDenhardt試劑和O. 1%SDS中于68。C預雜交1-2小時。然后直接加入變性的dig (地高辛素)標記或放射性標記探針到預雜交液，并在上述合適溫度下孵育16-24小時。孵育后，濾器隨后在2x SSC、0. 1%SDS中室溫洗滌30分鐘，然后在O. 5xSSC和O. 1%SDS中于68° C洗滌兩次，各30分鐘。通過用光增強屏在-70° C將濾器接觸X射線膠片(Kodak (柯達)XAR-2或等同物)24-48小時來完成放射自顯影。當然，等同條件和參數(shù)能用于此方法，同時仍保留所需嚴謹雜交條件。本文所用的術(shù)語DNA或蛋白“包含”特定序列X，指包括或包含至少序列X的DNA或蛋白，從而其他核苷或氨基酸序列能包括在5’(或N末端)和/或3’(或C末端)末端，例如(核苷序列編碼)選擇性標記蛋白，(核苷序列編碼)轉(zhuǎn)運肽，和/或5’前導序列或3’尾隨序列。相似地，在本申請正文和權(quán)利要求中使用術(shù)語“包含”，“包括”或“含有”應理解為表明涵蓋規(guī)定的整體或步驟或者整體或步驟的組，但不排除其他任何整體或步驟或者整體或步驟的組。本發(fā)明方法包括在葉綠體內(nèi)設置乙醇酸脫氫酶酶活性。這能通過向植物細胞核基因組中引入編碼乙醇酸脫氫酶活性的核酸完成，然后編碼蛋白序列融合編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列來完成?；蛘撸掖妓崦摎涿富钚阅芡ㄟ^用編碼相應酶的核酸直接轉(zhuǎn)化葉綠體基因組完成。能使用轉(zhuǎn)化植物細胞或植物組織的一般技術(shù)。一系列方法包括用連接DNA序列的粒子轟擊細胞，原生質(zhì)體或組織。作為轉(zhuǎn)入植物手段的另一系列方法包括用插入到根癌農(nóng) 根菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti質(zhì)?；蛎r(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri質(zhì)粒的嵌合基因?？墒褂闷渌椒?，例如微注射或電穿孔或其他使用PEG的直接沉淀。技術(shù)人員能選擇任何轉(zhuǎn)化植物細胞或植物的合適方法和方式。為了如本發(fā)明所需在植物細胞中表達編碼有酶活性多肽的核酸，能使用任何合適調(diào)控序列。調(diào)控序列會提供轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止區(qū)，其中轉(zhuǎn)錄起始可以是組成型或誘導型。編碼區(qū)域可操作連接于這種調(diào)控序列。合適調(diào)控序列代表是組成型35S啟動子?；蛘撸苁褂媒M成型泛素啟動子，特定是玉米泛素啟動子(GenBank:gi 19700915)。誘導型啟動子示例是RUBISC0小亞基的光誘導啟動子和“捕光復合物結(jié)合蛋白(lhcb)”啟動子。有利地，可以使用包括G0S2基因5’ UTR和內(nèi)含子的水稻(Oryza sativa) gos2基因的啟動子區(qū)域(de Pater等，1992),水稻核酮糖-1，5_ 二磷酸羧化酶小亞基的啟動子區(qū)域(KyozukaJ.等，1993)，或水稻肌動蛋白I基因的啟動子區(qū)域(McElroy D.等，1990)。本發(fā)明中，也可聯(lián)用啟動子與位于啟動子與編碼序列之間的其它調(diào)控序列，如轉(zhuǎn)錄激活子(“增強子”)，例如專利申請WO 87/07644所述的煙草花葉病毒(TMV)的翻譯激活因子，或例如Carrington和Freed 1990描述的煙草腐蝕病毒(TEV)的翻譯激活子，或內(nèi)含子，如玉米adhl內(nèi)含子或水稻肌動蛋白的內(nèi)含子I。作為調(diào)節(jié)終止子或聚腺苷酸化序列，可使用任何細菌來源的相應序列，例如根癌農(nóng)根菌的nos中止子，病毒來源的相應序列，例如CaMV 35S終止子，或植物來源的相應序列，例如在申請EP 0633317描述的組蛋白終止子。在本發(fā)明優(yōu)選核基因組轉(zhuǎn)化的一個特定實施方式中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核酸用于編碼乙醇酸脫氫酶核酸序列的5’，此轉(zhuǎn)運肽序列置于啟動子區(qū)域和編碼乙醇酸脫氫酶的核酸之間以表達轉(zhuǎn)運肽/乙醇酸脫氫酶融合蛋白。轉(zhuǎn)運肽可指導乙醇酸脫氫酶進入質(zhì)體，更特定是葉綠體，當稍后進入質(zhì)體時，融合蛋白在轉(zhuǎn)運肽和乙醇酸脫氫酶之間被切割。轉(zhuǎn)運肽可是單個肽，例如EPSPS轉(zhuǎn)運肽(描述于美國專利5，188，642)或植物核酮糖二羧化酶/加氧酶小亞基(RuBisCO ssu)轉(zhuǎn)運肽,例如獲自馬鈴薯(Solanum tuberosum)核酮糖1，5-二磷酸羧化酶的葉綠體轉(zhuǎn)運肽(GenBank :基因gi21562，編碼蛋白G68077，氨基酸1_58)，其中適當包括成熟RuBisCO ssu的N末端部分的一些氨基酸(EP 189707)，或馬鈴薯rbcSl基因(gi21562)的葉綠體靶向肽。轉(zhuǎn)運肽可以是完整天然產(chǎn)生(野生型)轉(zhuǎn)運肽，其功能片段，其功能突變體。也可以是嵌合轉(zhuǎn)運肽，其中至少兩個轉(zhuǎn)運肽互相連接或其中不同轉(zhuǎn)運肽部分以功能形式互相連接。這種嵌合轉(zhuǎn)運肽的一個示例包括向日葵RuBisCO ssu的轉(zhuǎn)運肽融合到玉米RuBisCO ssu的N末端部分，融合玉米RuBisCO ssu的轉(zhuǎn)運肽,如專利EP 508909所述?；蛘?，多肽可以使用葉綠體基因組轉(zhuǎn)化直接在葉綠體內(nèi)表達。整合感興趣核酸到葉綠體基因組的方法為本領域已知，特定是基于同源重組機理的方法。合適載體和選擇系統(tǒng)為本領域技術(shù)人員已知。多肽編碼序列可以轉(zhuǎn)入單獨載體或構(gòu)建體中，其中單獨開放閱讀框可以融合到一個或幾個多順反子RNA，核糖體結(jié)合位點加入到每一個單獨開放閱讀框前面以允許獨立翻譯。能用于這種整合入葉綠體基因組的方式和方法的示例在例如W006/108830中給出，其內(nèi)容在此通過引入納入。當核酸直接整合到葉綠體基因組時，不需要轉(zhuǎn)運肽序列。該情況中，翻譯起始密碼
子(Met)可以加入到編碼成熟蛋白序列以確保翻譯起始。本發(fā)明的主題也是編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白的核酸。在一個特定實施方式中，發(fā)明的核酸編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白，包括將所述蛋白靶向葉綠體的氨基酸序列。在另一個特定實施方式中，發(fā)明的核酸編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白，其是細菌乙醇酸脫氫酶亞基的融合。在另一個特定實施方式中，發(fā)明的核酸編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白，是大腸桿菌glc操縱子編碼的三個亞基的融合。在另一個特定實施方式中，發(fā)明的核酸編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白，包括分別與序列SEQ ID NO 2、4和6有至少60%序列相同性的氨基酸序列。在另一個特定實施方式中，發(fā)明的核酸編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白，包括分別與多核苷酸序列SEQ ID NO 1、3和5有至少60%序列相同性的多核苷酸序列。本發(fā)明主題也是植物細胞，植物組織，植物和部分或其種子，包括編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白的一個核酸并在葉綠體內(nèi)表達有乙醇酸脫氫酶酶活性的一個多肽。上面描述引入植物細胞，植物組織，植物和部分或其種子的核酸的特定實施方式。本發(fā)明也涉及包含轉(zhuǎn)化細胞的植物，特定是從轉(zhuǎn)化細胞中再生的植物。再生能從任何合適方法得到?？梢孟铝袑＠蛯＠麘茫囟ㄉ婕稗D(zhuǎn)化植物細胞和使植物再生的方法US4, 459，355，US4, 536，475，US5, 464，763，US5, 177，010，US5, 187，073，EP267，159，EP 604662，EP 672752，US4, 945，050，US5, 036，006，US5, 100，792，US5, 371，014，US5, 478，744，US5, 179，022，US5, 565，346，US5, 484，956，US5, 508，468，US5, 538，877，US5, 554，798，US5, 489，520，US5, 510，318，US5, 204，253，US5, 405，765，EP442174, EP486233, EP 486234, EP 539563, EP 674725, WO 91/02071 和 WO 95/06128。本方面也涉及通過培養(yǎng)和/或雜交上述再生植物獲得的轉(zhuǎn)化植物或其部分，并且涉及轉(zhuǎn)化植物的種子，其特征為包括發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化植物細胞。在發(fā)明的一個特定實施方式中，轉(zhuǎn)化植物或其部分選自水稻，小麥，大麥，馬鈴薯，油菜籽，煙草。在發(fā)明的一個特定實施方式中，轉(zhuǎn)基因種子和從其所得的粗粉，油或食物，來自水稻，小麥，大麥，油菜籽或煙草植物。本發(fā)明也涉及通過加工本發(fā)明的植物、其部分或種子獲得的任何產(chǎn)品如粗粉。例如，發(fā)明包括根據(jù)發(fā)明加工種子所得的顆粒，和由進一步加工種子或谷粒所得的粗粉，以及得自所述粗粉的任何食品。序列表SEQ ID NO: I :大腸桿菌 gel D DNA 序列SEQ ID NO:2 SEQ ID NO I編碼的氨基酸序列SEQ ID N0:3:大腸桿菌 gel E DNA 序列SEQ ID NO:4 SEQ ID NO 3編碼的氨基酸序列SEQ ID N0:5:大腸桿菌 gel F DNA 序列SEQ ID NO:6 SEQ ID NO 5編碼的氨基酸序列附I :合成多亞基融合盒的設計。glcD，glcE和glcF:編碼⑶H亞基D，E和F的細菌基因。I =(Gly4Ser)3接頭。T :His6標簽。箭頭腸激酶切割位點。標出所引入限制位點。圖2 :轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因系的生長參數(shù)。A :葉綠體中生產(chǎn)DEFp的4周齡轉(zhuǎn)基因Ttl植物的表型。B :7周齡煙草植物的葉面積。DEFp (n=6)，EFDp (n=5), FDEp (n=4) C :非轉(zhuǎn)基因煙草(N. tabacum cv. Petit Havana) SRl 植物(n=6)。實施例I :合成多亞基基因構(gòu)建體的設計細菌編碼GDH的D, E和F亞基的glcD, glcE和glcF cDNA與編碼(Gly4Ser) 3基序的靈活接頭融合成多亞基基因構(gòu)建體(圖I)。引入圖I所示限制位點可使glcD，glcE和glcF亞基重排，并且將多亞基盒亞克隆到細菌和植物表達載體中。另外，引入內(nèi)部限制位點(Pstl/Sall和Ncol/Xhol)以促進將(Gly4Ser) 3接頭換成其他靈活接頭.另外，兩個基因融合盒的產(chǎn)生可以通過Sall/Xhol限制位點刪除中間位置的cDNA。引入C末端His6標簽以保證檢測和純化重組蛋白。為避免His6標簽對多亞基⑶H酶酶活性的可能干擾，在His6標簽上游添加腸激酶切割位點，從而去除C末端標簽。實施例2 :多亞基融合盒的合成。設計含有采用三種不同glcD-glcE-glcF、glcE-glcF-glcD 和 glcF-glcD-glcE 排列方式的三個細菌亞基cDNA的三個多亞基融合盒，并且合成分別編碼DEFp、EFDp和FDEp相應多肽的合成基因。合成前，根據(jù)歐洲油菜(Brassica napus)密碼子使用，合成基因就最大表達產(chǎn)率進行密碼子優(yōu)化。另外，根據(jù)遺傳算法，合成基因同時就一大組競爭參數(shù)進行優(yōu)化，例如mRNA 二級結(jié)構(gòu)，隱蔽剪接位點，密碼子和基序重復，和同源GC含量。實施例3 :缺失形成活性內(nèi)源乙醇酸脫氫酶的三個亞基的大腸桿菌突變體的互補分析。為測定DEFp、EFDp和FDEp是否能互補大腸桿菌乙醇酸氧化酶突變體，互補分析用glc操縱子glcD亞基中有轉(zhuǎn)座子插入并不能在乙醇酸作為唯一碳源情況下生長的大腸桿菌突變體JA155完成。在此突變體中過量表達DEFp，EFDp和FDEp使細菌恢復在包括乙醇酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，表明所有三個多蛋白在體內(nèi)有功能，并能補充活性EcGO酶的glcD亞基。實施例4 :將DEFp，EFDp和FDEp cDNA亞克隆到植物表達載體為檢測煙草(N.tabacum cv. Petit Havana) SRl 植物中細菌多亞基 DEFp、EFDp 和FDEp多蛋白對⑶H活性和生物量產(chǎn)生的體內(nèi)效果，將編碼DEFp、EFDp和FDEp的cDNA插入到能使重組蛋白靶向植物細胞葉綠體的植物表達載體上。CaMV 35S啟動子與重復增強子區(qū)域驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達。合成的DEFp cDNA最初用CaMV 35S終止子上游的EcoRI和XbaI限制位點插入pTRAkc穿梭載體，生成pTRA-nptll-DEFp質(zhì)粒。pTRA質(zhì)粒包括煙草RB7基因(gi3522871)的骨架附著區(qū)和PPCV002的nptll盒(Konz和Schell，1986)，以用卡那霉素選擇轉(zhuǎn)基因植物(圖2)。隨后，組成型雙增強的CaMV 35S啟動子，查爾酮合成酶基因的5'未翻譯區(qū)域和馬鈴薯rbcSl基因葉綠體靶向肽序列通過PCR使用pTRAkc-rbcsl-cTP質(zhì)粒作為模板來擴增。然后，所擴增PCR片段使用AscI和AatII限制位點亞克隆到pTRA-nptII_DEF。 用類似方式克隆EFDp和FDEp cDNA到植物表達載體。設計三個最終構(gòu)建體，分別是pTRA-35S-rbcs-cTP:DEFp，pTRA-35S-rbcs-cTP: EFDp 和 pTRA-35S-rbcs_cTP:FDEp。實施例5 :煙草植物的轉(zhuǎn)化和再生植物表達載體使用Gene Pulser II電穿孔系統(tǒng)(美國加利福尼亞州赫告斯的伯樂公司(BioRad))根據(jù)生產(chǎn)商說明引入根癌農(nóng)根菌GV3101細胞。為研究穩(wěn)定轉(zhuǎn)化煙草植物(N. tabacum cv. Petit Havana SRl)中DEFp、EFDp和FDEp的積累效果，使用卡那霉素作為選擇標記通過重組根癌農(nóng)根菌的葉盤轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因Ttl植物。所產(chǎn)生的植物在DE73標準土壤中溫室培養(yǎng)，有16小時自然光光周期和22° C日間/20° C夜間溫度。分別通過多重PCR和免疫印跡分析篩選多至33個轉(zhuǎn)基因Ttl植物中是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因和重組蛋白。33-48%的檢測系在期望分子量142kDa分別生成DEFp，EFDp或FDEp。7個顯示最高水平重組蛋白(總可溶性蛋白的O. 03-0. 09%)的Ttl系用于建立T1代。實施例6 :葉綠體分離和酶分析完整葉綠體使用KlefTmann等2007所述的方法分離。這種制備不會污染過氧化氫酶和延胡索酸酶活性(>95%純度)。乙醇酸脫氫酶活性如Lord J. Μ.，1972所述檢測。將100 μ g葉綠體蛋白提取物加入 100 μ mo I 磷酸鉀(pH 8. 0),0. 2 μ mo I DCIP、0. Iml 1% (w/v) PMS 和 10 μ mo I 乙醇酸鉀，終體積是2. 4ml。通過以固定時間間隔加入O. Iml 12M HCl來終止各分析。靜置10分鐘后，加入O. 5ml O. IM苯肼HCl?；旌衔镌凫o置10分鐘，然后在324nm檢測由乙醛酸苯腙形成而引起的消光。實施例7 :從葉綠體提取物的經(jīng)標記乙醇酸中釋放CO2加入I μ Ci [I, 2_14C]_乙醇酸(哈脫曼(Hartmann)分析)到緊閉的15_ml反應管的50 μ g葉綠體蛋白提取物中。釋放的CO2在包括連接在15-ml試管內(nèi)壁O. 5M NaOH的500-μ I反應管中吸附。樣品孵育5小時，并且反應管的氣相通常用注射器混合。實施例8 :表達大腸桿菌⑶H的植物表型評價根據(jù)下式通過葉面積檢測監(jiān)控生成葉綠體中DEFp、EFDp或FDEp重組蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的生長
權(quán)利要求
1.一種增加植物中生物量生成和/或種子生產(chǎn)和/或碳固定的方法，所述方法包括向植物細胞基因組引入編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白的核酸，其中所述引入所述核酸可從頭表達有乙醇酸脫氫酶酶活性的一個多肽，并且其中所述多肽定位在所產(chǎn)生植物的葉綠體中。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述引入所述一個核酸在植物細胞核基因組內(nèi)完成，其中所述一個核酸編碼的一個多肽包括將多肽靶向葉綠體的氨基酸片段。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白由細菌乙醇酸脫氫酶亞基的融合組成。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白由大腸桿菌glc操縱子所編碼三個亞基的融合組成。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述乙醇酸脫氫酶多亞基融合 蛋白包括分別與序列SEQ ID NO 2，4和6有至少60%序列相同性的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白的核酸包括分別與多核苷酸序列SEQ ID NO 1，3和5有至少60%序列相同性的多核苷酸序列。
7.—種編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白的核酸。
8.如權(quán)利要求7所述的核酸，其特征在于，所述乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白包括將所述蛋白靶向葉綠體的氨基酸序列。
9.如權(quán)利要求7或8中任一項所述的核酸，其特征在于，所述乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白由細菌乙醇酸脫氫酶亞基的融合組成。
10.如權(quán)利要求7-9中任一項所述的核酸，其特征在于，所述乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白由大腸桿菌glc操縱子所編碼三個亞基的融合組成。
11.如權(quán)利要求7-10中任一項所述的核酸，其特征在于，所述乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白包括分別與序列SEQ ID NO 2，4和6有至少60%序列相同性的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求7-11中任一項所述的核酸，其特征在于，所述編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白的核酸包括分別與多核苷酸序列SEQ ID NOl, 3和5有至少60%序列相同性的多核苷酸序列。
13.一種包含乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白編碼核酸的轉(zhuǎn)基因植物細胞。
14.如權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其特征在于，所述乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白包括將所述蛋白靶向葉綠體的氨基酸序列。
15.如權(quán)利要求13-14中任一項所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其特征在于，所述乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白由細菌乙醇酸脫氫酶亞基的融合組成。
16.如權(quán)利要求13-15中任一項所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其特征在于，所述乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白由大腸桿菌glc操縱子所編碼三個亞基的融合組成。
17.如權(quán)利要求13-16中任一項所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其特征在于，所述乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白包括分別與序列SEQ ID NO 2，4和6有至少60%序列相同性的氨基酸序列。
18.如權(quán)利要求13-17中任一項所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其特征在于，所述編碼乙醇酸脫氫酶多亞基融合蛋白的核酸包括分別與多核苷酸序列SEQ ID NO 1，3和5有至少60%序列相同性的多核苷酸序列。
19.一種轉(zhuǎn)基因植物和其部分，所述轉(zhuǎn)基因植物和其部分包括如權(quán)利要求13-18中任一項所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞。
20.如權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植物和其部分，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物和其部分選自水稻，小麥，大麥，馬鈴薯，油菜籽，煙草。
21.—種轉(zhuǎn)基因種子和其所得粗粉、油或食物，所述轉(zhuǎn)基因種子和其所得粗粉、油或食物包括如權(quán)利要求13-18中任一項所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞。
22.如權(quán)利要求21所述轉(zhuǎn)基因種子和其所得粗粉、油或食物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因種子和其所得粗粉、油或食物選自水稻，小麥，大麥，油菜籽，煙草。
全文摘要
本發(fā)明涉及刺激植物生長和/或提高生物量產(chǎn)量和/或增加植物碳固定的方法，包括將一個或多個核酸引入植物細胞、植物組織或植物，其中引入核酸造成葉綠粒內(nèi)從頭表達由細菌多亞基乙醇酸脫氫酶亞基翻譯融合形成的一個或多個有乙醇酸脫氫酶酶活性的多肽。
文檔編號C12N9/04GK102858982SQ201180008103
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日
發(fā)明者F·庫扎勒, G·內(nèi)爾克, C·彼得漢森爾, S·希爾貝格 申請人:拜爾農(nóng)科股份公司