一種基于泡菜發(fā)酵系統(tǒng)定向篩選益生乳酸菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，尤其是食品中的泡菜領(lǐng)域，具體為一種基于泡菜發(fā)酵系統(tǒng) 定向篩選益生菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 益生菌（Probiotic) -詞，源自希臘語，其意思是"專管生命〃。益生菌的概念最 早始于1965年，當時LillyDM首先建議益生菌是指對動物腸道菌群平衡有益的促進物質(zhì) 或微生物。1989年，F(xiàn)ullerR等在實驗基礎(chǔ)上又將益生菌定義為："益生菌是補充喂養(yǎng)的 具有活性的微生物，而且可通過改善腸道菌群的平衡，對宿主動物產(chǎn)生良好的健康效應"； 同年，美國食品與藥物管理局（(FDA)及飼料協(xié)會（AAFC0)發(fā)布了可以直接飼喂動物的安全 菌株41種，其中乳酸菌類17株，雙歧桿菌類6株，芽抱桿菌類5株，擬桿菌類4株，霉菌類 2株（黑曲霉、米曲霉），酵母菌類1株，球菌和丙酸菌類6株。
[0003] 其后隨著益生菌相關(guān)保健產(chǎn)品的不斷出現(xiàn)，益生菌的定義也在不斷提出和修正。 直到2001年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FA0)與世界衛(wèi)生組織（WHO)聯(lián)合專家組將益生菌重新定義 為：益生菌，是指經(jīng)適量服用后，有益于其宿主健康的活的微生物。目前，這一定義被業(yè)界公 認為益生菌的最適定義。
[0004] 益生菌廣泛存在于自然界，主要來源于人體和動物腸道正常生理性細菌和非腸道 細菌。隨著對益生菌的不斷深入研究，人們從發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品及傳統(tǒng)泡菜中也篩 選出大量了益生菌，尤其是對人體健康有益的功能性益生乳酸菌。乳酸菌（Lacticacid bacteria)指發(fā)酵糖類，主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽抱、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。因 其可將碳水化合物發(fā)酵成乳酸，故得名。乳酸菌是人及動物腸道中極為重要的生理菌群 之一。閆劉慧在其論文《泡菜中乳酸菌特性分析及模擬腸道存活定殖作用研究》提到，目 前研究表明乳酸菌可分為43個屬，其中較常見的有6個屬：鏈球菌屬（Streptococcus)、 片球菌屬（Pediococcus)、明串珠球菌屬（Leucnostoc)、乳酸桿菌屬（Lactobacillus)、 雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)、產(chǎn)抱乳桿菌屬（Sporolactobacillus);其中種數(shù)最多的 為乳酸桿菌屬，有44種，包括嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus)、副干酪乳桿菌 (Lactobacillusparacasei)和植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)等，主要存在于泡 菜等釀造食品、牛乳等發(fā)酵乳制品、動物口腔和腸道、腐敗肉類中。
[0005] 隨著社會的快速發(fā)展，人們生活水平提高的同時也承受著源自各處的壓力，隨之 而來的各種疾病，使得人們對自身的健康越來越重視。而益生乳酸菌對腸道健康非常有益， 如增加腸道內(nèi)乳酸菌量，減少有害菌，防止腹瀉；提高機體免疫力、活化巨噬細胞以及產(chǎn)生 腫瘤壞死因子、干擾素和IgA等抗體；吸附致癌物及減少糞便中致癌物的濃度，降低與激活 致癌物相關(guān)的酶活性；降低血清膽固醇以及降血壓等。
[0006] 泡菜，尤其是四川泡菜，歷史悠久，工藝成熟，是我國典型的傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一。它 是以生鮮蔬菜為原料，添加或不添加輔料，經(jīng)過低濃度鹽水泡漬發(fā)酵而成的蔬菜制品。泡菜 營養(yǎng)豐富，味道可口，可增加食欲，促進消化，在國內(nèi)外享有盛譽。大量研究表明，泡菜中乳 酸菌代謝產(chǎn)生的高濃度礦物質(zhì)、乳酸和生物活性物質(zhì)是構(gòu)成泡菜獨特風味的重要原因。而 泡菜中主要的乳酸菌包括乳桿菌屬、片球菌屬、明串株菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬。
[0007] 泡菜中乳酸菌屬類在不同發(fā)酵階段中不盡相同。大量相關(guān)文獻表明，在泡菜發(fā)酵 初期，好氧微生物占主導地位，異型乳酸菌進行微弱的發(fā)酵。隨著發(fā)酵，產(chǎn)生的乳酸使得體 系pH值降低，進而導致果膠酶活性降低，保證泡菜質(zhì)地脆嫩，使發(fā)酵朝正確的方向進行；此 時有0. 3% -0. 4%的乳酸積累量，乳酸菌活性增加，推動發(fā)酵進入中期階段。在發(fā)酵中期， 隨著發(fā)酵過程的持續(xù)，氧氣含量逐漸降低，好氧微生物的生長受到抑制，其中腐敗菌大量死 亡，而霉菌和酵母生長受到嚴重阻礙。兼性厭氧微生物數(shù)量增加，以同型乳酸菌發(fā)酵為主， 植物乳桿菌等短乳桿菌發(fā)揮主要作用。發(fā)酵后期，植物乳桿菌等短乳桿菌的乳酸積累量超 過1. 0%，此時口感酸爽，為佐餐的最佳配菜。
[0008] 在泡菜發(fā)酵中，溫度和鹽度是影響乳酸菌種類變化的主要因素。正是因為泡菜在 不同鹽度、不同溫度下的不同發(fā)酵階段中其乳酸菌屬類不一致，從而導致在篩選泡菜中益 生菌時，不能定向篩選。比如，我們要篩選植物乳桿菌時，如果不確定何種條件（鹽度、溫 度）下的哪個階段中植物乳桿菌出現(xiàn)并主導發(fā)酵的話，就很難篩選出目標菌，甚至可能都 篩選不出來。另外，泡菜發(fā)酵很快，尤其在老鹽水中發(fā)酵的泡菜更快，這就使得在泡菜發(fā)酵 系統(tǒng)中很難篩選出純的益生乳酸菌屬。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明針對上述技術(shù)問題，提出了一種基于泡菜發(fā)酵系統(tǒng)定向篩選益生乳酸菌的 方法，該方法可定向篩選出泡菜中不同的益生乳酸菌屬，簡單可行，準確度高，不必反復純 化。
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：
[0011] -種基于泡菜發(fā)酵系統(tǒng)定向篩選益生乳酸菌的方法，包括以下步驟：
[0012] (1)低鹽常溫下定向篩選乳酸乳球菌屬
[0013] 乳酸乳球菌也是一類益生菌，可調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，促進營養(yǎng)吸收。乳酸乳球菌細菌 素有40多種，目前被廣泛應用的只有乳酸鏈球菌素，因此潛力巨大。在發(fā)酵初期，即發(fā)酵 1~1. 5天，于25°C的常溫條件下并控制鹽度為2~3%，可定向篩選乳酸乳球菌屬，乳酸乳 球菌的數(shù)量可達l〇scfu/ml。在發(fā)酵后期因為不耐酸而逐漸消亡。而在高鹽中，本身不利于 乳酸乳球菌生長。因此，定向篩選乳酸乳球菌的具體步驟如下：
[0014] 1)泡菜：將卷心菜切分、洗凈，然后裝壇（可用1500ml~2000ml的泡菜壇），再加 入用涼開水溶化好的鹽水，其中菜：鹽水=1 :1(w:w)，最終鹽濃度為2~3% (按總質(zhì)量算， 如lkg菜，加lkg鹽水，其中鹽40~60g，下同）。最后蓋好壇蓋，加上壇沿水，放入25°C恒 溫箱中培養(yǎng)；
[0015] 2)選擇培養(yǎng)：泡菜在25°C恒溫箱中發(fā)酵18~24h，取1ml泡菜發(fā)酵液，在生理鹽 水中進行10倍的梯度稀釋。取稀釋度為10 4、10 5、10 6、10 7和10 8的含菌液〇.lml，均勻涂 布在含0. 01% (wt% )溴甲酚紫的MRS培養(yǎng)基，然后在37°C恒溫箱中培養(yǎng)36h，觀察菌落；
[0016] 3)純化培養(yǎng)：挑選出使溴甲酚紫MRS培養(yǎng)基變黃的單菌落在MRS平板上劃線培養(yǎng) 36h，然后挑選出中央隆起、長勢較好的乳黃色菌落，進行斜面培養(yǎng)；
[0017] 4)菌種保藏：斜面培養(yǎng)36h后，接入液體培養(yǎng)MRS培養(yǎng)36h，然后甘油管（其中甘 油V冰V= 1: 1，加菌液0.8~0. 9ml，下同）保藏，-70°c下放置。
[0018] (2)低鹽低溫（10°C)下定向篩選魏斯氏菌屬
[0019] 目前，國內(nèi)外對魏斯氏菌屬的研究還比較有限。但作為乳酸菌的一員，其益生性很 值得研究，尤其在葡糖苷酶活性、抗真菌性、促進乳桿菌生長等益生作用方面。低鹽低 溫下定向篩選魏斯氏菌屬的方法為：在發(fā)酵初期，即發(fā)酵1~1. 5天，于5~10°C的低溫條 件下并控制鹽度為2~3%，定向篩選魏斯氏菌屬的具體步驟如下：
[0020] 1)泡菜：將卷心菜切分、洗凈，然后裝壇（可用1500ml~2000ml的泡菜壇），再加 入用涼開水溶化好的鹽水，其中菜：鹽水=1 :1(w:w)，最終鹽濃度為2~3%。最后蓋好壇 蓋，加上壇沿水，放入5~10°C恒溫箱中培養(yǎng)；
[0021] 2)選擇培養(yǎng)：泡菜在5~10°C恒溫箱中發(fā)酵24~28h，取1ml泡菜發(fā)酵液，在生理 鹽水中進行10倍的梯度稀釋。取稀釋度10 4、10 5、10 6、10 7和10 8的含菌液〇.lml，均勻涂 布在含0. 01% (wt% )溴甲酚紫的MRS培養(yǎng)基，然后在37°C恒溫箱中培養(yǎng)36h，觀察菌落；
[0022] 3)純化培養(yǎng)：挑選出使溴甲酚紫MRS培養(yǎng)基變黃的單菌落在MRS平板上劃線培養(yǎng) 36h，然后挑選出中央扁平、長勢較好的暗黃色菌落，進行斜面培養(yǎng)；
[0023] 4)菌種保藏：斜面培養(yǎng)36h后，接入液體培養(yǎng)MRS培養(yǎng)36h，然后甘油管保 藏，-70 °C下放置。
[0024] (3)中低溫低鹽下篩選腸膜明串珠菌
[0025] 腸膜明串珠菌并不能夠在腸道系統(tǒng)內(nèi)定植，而且借助細胞的微生物活動對宿主發(fā) 揮的積極影響力也非常有限，但是當人體攝入的明串珠菌細胞達到一個相對較高的數(shù)量 時，其益生效果便能夠充分體現(xiàn)。一些研究表明，飲用含有10scfu/mL腸膜明串珠菌的印度 達喜酸奶時，可減少兒童的腹瀉持續(xù)時間。
[0026] 在泡菜的自然發(fā)酵過程中，腸膜明串珠菌腸膜亞種啟動泡菜發(fā)酵。腸膜明串菌株 進行異型乳酸發(fā)酵，能夠代謝檸檬酸生成雙乙酞、〇) 2等，可為泡菜壇提供一個厭氧環(huán)境，促 進同型乳酸發(fā)酵。中低溫低鹽下篩選腸膜明串珠菌的方法為：在發(fā)酵起始期，即發(fā)酵〇~ 0. 5天，于10~15°C的中低溫條件下并控制鹽度為1. 5~2%，定向篩選腸膜明串珠菌屬， 具體步驟如下：
[0027] 1)泡菜：將卷心菜切分、洗凈，然后裝壇（可用1500ml~2000ml的泡菜壇），再加 入用涼開水溶化好的鹽水，其中菜：鹽水=1 :1(w:w)，最終鹽濃度為1. 5~2%。最后蓋好 壇蓋，加上壇沿水，放入10~15°C恒溫箱中培養(yǎng)；
[0028] 2)選擇培養(yǎng)：泡菜在10~15°C恒溫箱中發(fā)酵0~12h，取1ml泡菜發(fā)酵液，在生 理鹽水中進行10倍的梯度稀釋。取稀釋度10 4、10 5、10 6、10 7和10 8的含菌液o.lml，分 別在LMM培養(yǎng)基上，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3天。然后挑取典型菌落在含有古霉 素（30ug/ml)的MRS平板上劃線，并置于25°C培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)2~3天，觀察菌落生長狀 況。其中LMMP培養(yǎng)基配方為：
[0029]

[0030] 3)純化培養(yǎng)：挑選長勢較好的單菌落進一步在含有萬古霉素的MRS固體培養(yǎng)基上 劃線分離1~2次，挑選表面光滑邊緣整齊的灰白色圓形菌落轉(zhuǎn)入MRS固體斜面培養(yǎng)；
[0031] 4)菌種保藏：斜面培養(yǎng)48h~60h后，接入液體培養(yǎng)MRS培養(yǎng)48h~60h，然后甘 油管保藏，-70°C下放置。
[0032] (4)高鹽常溫下篩選植物乳桿菌屬
[0033] 植物乳桿菌是一種重要的益生菌，它能代謝能產(chǎn)生有機酸、過氧化氫、雙乙酞和細 菌素等物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠抑制病原菌和腐敗菌，是其具有特殊保健功能的原因之一。很多 研究表明，在泡菜發(fā)酵過程中，最終由植物乳桿菌終止發(fā)酵，即在泡菜成熟后期，整個泡菜 發(fā)酵系統(tǒng)中，植物乳桿菌占絕對優(yōu)勢。同樣，高鹽常溫下篩選植物乳桿菌屬的方法為：在發(fā)