一種rs12979860檢測引物、其組合物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及指導(dǎo)丙型肝炎用藥的基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種rsl2979860 檢測引物、其組合物及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型肝炎是一種主要經(jīng)由血液傳播的疾病，目前世界上約有3. 4億人患有慢性丙 型肝炎病毒（HCV)感染。我國約有4千萬感染者，每年新發(fā)病例400萬例左右，僅有不到 30%的HCV感染者可在半年內(nèi)自發(fā)清除病毒，多數(shù)的HCV感染者將發(fā)展為慢性感染，其中約 有30 %的患者會發(fā)展為肝臟纖維化和肝細(xì)胞癌等。丙型肝炎目前治療采用的藥物主要有干 擾素（PEG-IFNal地a)聯(lián)合利己韋林（ribavirin，RBV)、特拉匹韋（telaprevir，TVR)和波 西普韋化OC巧revir，B0C)等?，F(xiàn)已有研究證明，PEG-IFNalpha與RBV聯(lián)合應(yīng)用獲得持續(xù) 病毒應(yīng)答（SVR)和HCV自發(fā)清除的可能性，均與19號染色體上的IL28B基因密切相關(guān)，經(jīng) 過GWAS分析發(fā)現(xiàn)，IL28B的一個SNP-------rsl2979860與HCV1型感染者獲得SVR強(qiáng)烈 相關(guān)。rsl2979860是已知的與HCV感染者的SVR情況最相關(guān)的基因位點(diǎn)，其中C/C基因型 與SVR正關(guān)聯(lián)，而另外兩種基因型（C/T和T/T)與非病毒學(xué)應(yīng)答（NVR)正關(guān)聯(lián)。C/C基因型 的患者SVR獲得率較其他兩種基因型患者高出一倍，而且IL28B的檢測對SVR的預(yù)測要優(yōu) 于治療前檢測HCVRNA水平，纖維化分級W及年齡和性別，且對于HCV1型的效果要好于2 型和3型。鑒于IL28B基因多態(tài)性的臨床價值，2011年歐洲肝臟研究學(xué)會在HCV感染診治 指南中就新加入了對宿主IL28B基因型的檢測W預(yù)測抗病毒治療療效，同年9月美國肝病 研究會更新的《基因1型慢性HCV感染治療指南》中也強(qiáng)調(diào)，對于標(biāo)準(zhǔn)治療聯(lián)合TVR的S聯(lián) 療法，IL28B基因型是預(yù)測患者獲得SVR的強(qiáng)有力因素，在治療前應(yīng)考慮對患者進(jìn)行IL28B 基因型檢測，中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（C抑A)于2015年發(fā)布的《藥物代謝酶和藥物 作用祀點(diǎn)基因檢測技術(shù)指南（試行）》中明確指出，"檢測IFNL3rsl2979860基因型有助于 HCV感染的個體化治療，從而提高其治療水平"。
[0003] 目前針對rS12979860的檢測手段很多，主要包括直接測序法，PCR-SSCP法， 化qmanSNP法，等位基因特異性PCR法，單堿基延伸法等。直接測序法可檢測所有突變，然 而勞動量大，不夠靈敏，并且需要非常昂貴的DNA分析儀，因此并不適合推廣應(yīng)用；Taqman SNP法，單堿基延伸法，HRM法等雖然靈敏度很高，但同樣也需要依賴較為昂貴的進(jìn)口設(shè)備， 因此大范圍的推廣也比較困難。PCR-SSCP法和等位基因特異性PCR法在樣本量較大時操作 很繁瑣，并且由于都要做開管檢測，所W很容易造成氣溶膠污染而出現(xiàn)假陽性。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop-mediatedIsothermalAmplification,LAMP)技術(shù)是日本 科學(xué)家于2000年開發(fā)出來的一種恒溫擴(kuò)增技術(shù)，針對祀基因的六個區(qū)域設(shè)計(jì)四條特異性 引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下恒溫擴(kuò)增，可在十幾分鐘到一小時之內(nèi)產(chǎn)生IO9-IQin數(shù) 量級的產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)束后通過肉眼直接觀察體系狀態(tài)的改變來判定待測樣本的基因型，無 需開管，因此大大簡化了操作步驟，同時又可W有效避免樣本交叉污染，而且，僅需普通水 浴鍋即可開展檢測，又節(jié)約了大量的檢測成本。因此，用LAMP法檢測rsl2979860對于丙型 肝炎患者的基因型檢測、丙型肝炎的治療等具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明要解決的問題是現(xiàn)有的檢測rsl2979860的方法較為復(fù)雜，成本高、工作量 大，不適宜大范圍推廣使用。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種適于等位基因特異性LAMP對rs12979860的基 因型進(jìn)行檢測的引物。所述rsl2979860檢測引物，包括W下引物：
[0012] 本發(fā)明提供的用于rsl2979860檢測的上述的引物中，在3'端的倒數(shù)第第=位人 為引進(jìn)了一個突變，可進(jìn)一步降低非特異擴(kuò)增的可能性，提高檢測的準(zhǔn)確性。
[0013] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種rs12979860檢測組合物。所述rs12979860檢 測組合物，包括上述的引物，還包括dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水。
[0014] 進(jìn)一步地，所述組合物分為兩個體系，分別記為體系C和體系T。體系C用于檢測 C等位基因，包括F3、B3、FIP、BIPC、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水。體系T用于檢測T 等位基因，包括F3、B3、FIP、BIPT、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水。
[0015] 進(jìn)一步地，兩個體系中均還包括用于顯示體系顏色的指示劑。
[0016] 優(yōu)選地，所述指示劑為巧黃綠素和氯化儘的組合物或者為徑基糞酪藍(lán)。
[0017] 優(yōu)選地，所述兩個體系中：F3的濃度相同，為0. 4yM;B3的濃度相同，為0. 4yM; FIP的濃度相同，為1. 6yM;體系C中BIPC的濃度和體系T中BIPT的濃度相同，均為 1. 6yM。
[0018] 進(jìn)一步地，所述兩個體系中緩沖液的濃度相同。緩沖液包括如下濃度的組分： Tris-肥 1 20mM，KCl50mM，（NH4)2S〇4l〇mM，M拆〇44mM，Tween-200. 1% (體積分?jǐn)?shù)）。
[0019] 優(yōu)選地，兩個體系中指示劑的濃度相同。若指示劑為巧黃綠素和氯化儘的組合 物，巧黃綠素的濃度為25yM，氯化儘的濃度為0. 5mM。若指示劑為徑基糞酪藍(lán)，其濃度為 120yM。
[0020] 優(yōu)選地，兩個體系中dNTP的濃度相同，均為1. 4mM。
[0021] 優(yōu)選地，兩個體系中Bst聚合酶均為8U。
[0022] 本發(fā)明的第=個目的在于提供一種用等位基因特異性LAMP對rsl2979860的基因 型進(jìn)行檢測的方法。所述rsl2979860的檢測方法，使用上述的rsl2979860檢測組合物，具 體為：將待檢測的核酸分別加入到體系C和體系T中，得到的混合物于60~70°C下反應(yīng)， 反應(yīng)結(jié)束后觀察體系的變化。
[0023] 進(jìn)一步地，所述待檢測的核酸在兩個體系中的濃度一致，均為0. 8~4ng/yL。
[0024] 優(yōu)選地，反應(yīng)結(jié)束后，將兩個體系分別進(jìn)行滅活處理。滅活處理使得體系中的酶失 活，防止體系放置時間長時發(fā)生非特異性擴(kuò)增。 陽0巧]優(yōu)選地，反應(yīng)溫度為68 °C。
[0026] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)時間為40~120min。
[0027] 在本發(fā)明的反應(yīng)體系中，反應(yīng)前體系為澄清狀態(tài)，發(fā)生陽性反應(yīng)時，儀離子與副產(chǎn) 物焦憐酸形成沉淀，體系產(chǎn)生肉眼可見的沉淀，變?yōu)闇啙釥顟B(tài)。觀察體系狀態(tài)的變化可W直 接判定是否發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。當(dāng)體系中存在指示劑時：（1)若指示劑為徑基糞酪藍(lán)，反應(yīng)前體 系中的儀離子與dNTP馨合，體系呈現(xiàn)紫羅蘭色；當(dāng)有陽性反應(yīng)時，儀離子與副產(chǎn)物焦憐酸 形成沉淀，溶液pH發(fā)生改變，顏色逐漸由紫羅蘭色變?yōu)樘焖{(lán)色；(2)若指示劑為巧黃綠素和 氯化儘的組合物時，反應(yīng)前巧黃綠素與氯化儘中的儘離子結(jié)合，體系呈現(xiàn)黃色；當(dāng)有陽性反 應(yīng)時，副產(chǎn)物焦憐酸與儘離子結(jié)合生成沉淀，巧黃綠素與體系中的儀離子結(jié)合，顏色逐漸由 黃色變?yōu)榍晒饩G色。觀察反應(yīng)體系顏色和/或狀態(tài)的變化可W直接判定是否發(fā)生擴(kuò)增反 應(yīng)。
[0028] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
[0029] 1.本發(fā)明在LAMP基礎(chǔ)上采用等位基因特異性LAMP方法，針對等位基因之間的堿 基差異設(shè)計(jì)特異引物，從而檢測某一特異等位基因。具有靈敏度高，與化qman相同的敏感 性，特異性好且操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。
[0030] 2.本發(fā)明提供的rsl2979860檢測引物中，在3'端的倒數(shù)第=位人為引進(jìn)了一個 突變，可進(jìn)一步降低非特異擴(kuò)增的可能性，提高檢測的準(zhǔn)確性。
[0031] 3.本發(fā)明中，使用等位基因特異性LAMP方法，反應(yīng)中有大量的DNA合成，從dNTP 中析出的焦憐酸根與反應(yīng)體系中的儀離子沉淀，形成大量的焦憐酸儀沉淀，呈現(xiàn)肉眼可見 的渾濁狀態(tài)?？赏ㄟ^觀察反應(yīng)體系狀態(tài)的變化判定反應(yīng)是否發(fā)生。進(jìn)一步地，本發(fā)明在反 應(yīng)體系中加入指示體系顏色變化的指示劑，通過反應(yīng)體系顏色的變化進(jìn)行判斷，避免沉淀 偶爾不是非常明顯使得肉眼不易判定。
[0032] 4.本發(fā)明提供的檢測方法，整個檢測所需要的設(shè)備僅是水浴鍋或金屬浴或者熱 循環(huán)儀，檢測成本低；檢測耗時一小時左右，時間較短；且本檢測方法不需要額外的開管檢 ，因此有效避免了交叉污染的產(chǎn)生，提高了檢測的準(zhǔn)確性。本發(fā)明提供的檢測方法成本