新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測方法及檢測試劑盒，尤其是一種 新型布尼亞病毒的核酸環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測方法及檢測試劑盒，可應用于新型布尼 亞病毒的實驗室快速檢測。
【背景技術】
[0002] 由新型布尼亞病毒感染人體引起的發(fā)熱伴血小板減少綜合征，是一種以發(fā)熱伴白 細胞、血小板減少和多臟器功能損傷為主要臨床表現(xiàn)的新發(fā)傳染病。新型布尼亞病毒感染 后可迅速引起患者肝、腎功能受損，使患者因彌漫性血管內(nèi)凝血、休克、呼吸衰竭而死亡，死 亡率高達30%。流行病學研究顯示新型布尼亞病毒分布極為廣泛：自2010年我國首次對 新型布尼亞病毒進行成功分離鑒定以來，目前已在山東、湖北、浙江、江蘇等多個省市發(fā)現(xiàn) 新型布尼亞病毒感染病例。2011-2013年，美國密蘇里州、日本、韓國也相繼報道發(fā)現(xiàn)有經(jīng)蜱 蟲叮咬傳播的類似新型布尼亞病毒感染病例。蜱傳新型布尼亞病毒感染已逐漸成為全球性 的重要公共衛(wèi)生問題。
[0003] 被新型布尼亞病毒感染者往往急性起病且死亡率高，但目前對新型布尼亞病毒感 染的治療還是以對癥支持治療為主。臨床治療主要通過使用廣譜強效抗病毒藥物，同時依 靠患者自身免疫狀態(tài)的提升，以達到抵抗新型布尼亞病毒感染的效果。值得關注的是，新型 布尼亞病毒感染的及時檢測診斷，對于疾病的治療具有重要意義，可以顯著提高治療效果。 新型布尼亞病毒感染往往發(fā)生在山區(qū)丘陵地區(qū)，通過新型布尼亞病毒快速檢測技術來加強 對野外生存環(huán)境中該病毒的檢測，可以為新型布尼亞病毒感染的防制提供重要依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種新型布尼亞病毒的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測方法及 檢測試劑盒，該方法及檢測試劑盒應具有特異性好、檢測靈敏度高、穩(wěn)定、準確、檢測效率 高、操作快速簡便等特點。
[0005] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0006] -種新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒 中的RT-LAMP反應液包括以下組分：
[0007] 特異性擴增引物、脫氧核糖核苷三磷酸、甜菜堿、緩沖液、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂、 吐溫-20、DNA聚合酶、逆轉錄酶、SYBRGreenI蠟微晶顆粒、無RNA酶的水；
[0008] 所述特異性擴增引物序列如下：
[0009] F3 :5, -GGCCGAGAGACACTGACAT-3，
[0010] B3 :5, -CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3'
[0011] FIP: 5 ' -TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3 '
[0012] BIP:5' -ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3'。
[0013] 新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測試劑盒中各組分的相應含量如下：
[0014] 緩沖液 1.5-2.5mol/L 脫氧核糖核苷三磷酸 0.1-0.2 mol/L 甜菜堿 0.06-0.丨Omol/'L 氯化鉀 0.8-1.2mol/L 硫酸銨 0.8-1.2mol/L 硫酸鎂 0.06-0.10 mol/mL 引物FIP、BIP (兩者比例相同） 0.1-0.2mmol/L 引物F3、B3 (兩者比例相同） 0.01-0.03 mmol/L 染料 50-150 ^iL
[0015] 吐溫-20 50-150 ul DNA聚合酶 800-1200 U 逆轉錄酶 40-60 U 無RNA酶的水（RNase free dH20) 500-1500 瓜。
[0016] 所述染料為SYBR Green I蠟微晶顆粒。
[0017] 所述緩沖液為Tris-HCl。
[0018] 一種新型布尼亞病毒非診斷目的的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測方法，按以下步驟 進行：
[0019] (1)提取待測樣品RNA ;
[0020] (2)以待測樣品RNA為模板，與下列物質混合配制成一步法環(huán)介導逆轉錄等溫擴 增檢測體系：特異性引物、緩沖液、甜菜堿、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂、吐溫-20、脫氧核糖核 苷三磷酸、DNA聚合酶、逆轉錄酶、SYBR Green I蠟微晶顆粒；
[0021] 所述特異性引物序列如下：
[0022] F3 :5, -GGCCGAGAGACACTGACAT-3，
[0023] B3 :5, -CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3'
[0024] FIP :5, -TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3'
[0025] BIP :5' -ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3' ；
[0026] (3)新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測結果的陰陽性可以用肉眼判斷； 如果反應后混合物由橘黃色變?yōu)榫G色，則判斷為陽性，即待測樣品含有新型布尼亞病毒核 酸；如果反應后混合物保持橘黃色不變，則判斷為陰性。
[0027] 所述步驟（2)中環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測體系中各成分的終濃度如下：
[0028]
[0029]
【主權項】
1. 一種新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒中 的RT-LAMP反應液包括以下組分： 特異性擴增引物、脫氧核糖核苷三磷酸、甜菜堿、緩沖液、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂、吐 溫-20、DNA聚合酶、逆轉錄酶、SYBR Green I蠟微晶顆粒、無 RNA酶的水； 所述特異性擴增引物序列如下： F3 :5, -GGCCGAGAGACACTGACAT-3， B3 :5' -CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3' FIP :5' -TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3' BIP :5' -ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3'。
2. 根據(jù)權利要求1所述新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測試劑盒，其特征在 于新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測試劑盒中各組分的相應含量如下：
3. 根據(jù)權利要求1或2所述新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測試劑盒，其特 征在于所述染料為SYBR Green I蠟微晶顆粒。
4. 根據(jù)權利要求3所述新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測試劑盒，其特征在 于所述緩沖液為Tris-HCl。
5. -種新型布尼亞病毒非診斷目的的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測方法，按以下步驟進 行： (1) 提取待測樣品RNA ; (2) 以待測樣品RNA為模板，與下列物質混合配制成一步法環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢 測體系：特異性引物、緩沖液、甜菜堿、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂、吐溫-20、脫氧核糖核苷三 磷酸、DNA聚合酶、逆轉錄酶、SYBR Green I蠟微晶顆粒； 所述特異性引物序列如下： F3 :5, -GGCCGAGAGACACTGACAT-3， B3 :5' -CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3' FIP :5' -TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3' BIP :5' -ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3' ； (3)新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測結果的陰陽性可以用肉眼判斷；如果 反應后混合物由橘黃色變?yōu)榫G色，則判斷為陽性，即待測樣品含有新型布尼亞病毒核酸；如 果反應后混合物保持橘黃色不變，則判斷為陰性。
6. 根據(jù)權利要求5所述新型布尼亞病毒非診斷目的的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測方 法，其特征在于所述步驟（2)中環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測體系中各成分的終濃度如下：
其余是作為溶劑的無 RNA酶的水； 新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測體系總體積為25 μ L。
7. 根據(jù)權利要求6所述新型布尼亞病毒非診斷目的的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測 方法，其特征在于所述步驟（2)中環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測條件如下：65°C 60min， 95°C 2min。
【專利摘要】本發(fā)明涉及新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測方法及試劑盒。目的是提供的方法及檢測試劑盒應具有特異性好、檢測靈敏度高、穩(wěn)定、準確、檢測效率高、操作快速簡便等特點。技術方案是：一種新型布尼亞病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測試劑盒，試劑盒中的RT-LAMP反應液包括以下組分：特異性擴增引物、脫氧核糖核苷三磷酸、甜菜堿、緩沖液、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂、吐溫-20、DNA聚合酶、逆轉錄酶、SYBR Green I蠟微晶顆粒、無RNA酶的水。一種新型布尼亞病毒非診斷目的的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測方法，按以下步驟進行：(1)提取待測樣品RNA；(2)配制成一步法環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測體系(3)判斷結果。
【IPC分類】C12Q1-68, C12R1-93, C12Q1-70
【公開號】CN104673933
【申請?zhí)枴緾N201510018039
【發(fā)明人】張嚴峻, 張磊, 蔣健敏, 沈廣強
【申請人】浙江省疾病預防控制中心
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年1月14日