專利名稱：發(fā)熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環(huán)sftsv介導等溫擴增快速檢測試劑盒及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環(huán)SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒，及其使用方法，以及在檢測布尼亞病毒中的應用。
背景技術：
發(fā)熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopeniasyndrome bunyavirus, SFTSV),目前已被確認為是2004年以來湖北、河南、江蘇、浙江等地區(qū)高度散發(fā)出現(xiàn)的發(fā)熱伴血小板減少綜合征的主要病原體。經國家疾控中心相關研究，該病毒屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬的一種新病毒。
與其他布尼亞病毒科白蛉病毒屬病毒相似，SFTSV的基因組由大(L)、中(M)、小
(S)3個單股負鏈RNA片段組成。各片段末端互補。其中大(L)片段全長6368個核苷酸，編碼 RNA 依賴型 RNA 聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRP);中(M)片段全長3378個核苷酸，編碼一個具有1073個氨基酸的膜蛋白前體，該蛋白前體經宿主細胞蛋白酶修飾，可進一步形成Gn膜蛋白和Ge膜蛋白；小(S)片段全長1744個核苷酸，具有雙向讀碼框，分別編碼核蛋白(Nucleocapsid protein,N)和非結構蛋白NSs。目前白蛉屬病毒分兩個組，一組為人類致病病毒組，如立夫特谷熱病毒(Rift Vally Fever Virus)等，另一組為對人類不致病的病毒組，如烏庫病毒(Uukuniemi virus)。而SFTSV經分析應屬新的第三組病毒。自2004年以來，我國多省份陸續(xù)發(fā)生了發(fā)熱伴出血，白細胞減少及血小板減少，多臟器受損的病例。病人多來自華中山區(qū)，農業(yè)區(qū)，流行時間為每年4到8月份，與節(jié)肢動物活動繁殖期相吻合。病例都有明確的蜱蟲叮咬歷史，其發(fā)病死亡率達到12%-30%。在2009年，在河南一份發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例標本中分離到一株新型布尼亞病毒。后又在2010年分離到20株同種病毒。經相關基因組生物信息學分析和電子顯微鏡形態(tài)學研究，該新型病毒屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬的一種新病毒，命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒，即SFTSV。此外，這類發(fā)熱伴血小板減少綜合癥還有另外一種主要病原體，即嗜吞噬細胞無形體(Anaplasma phagocytophilum)。嗜吞曬細胞無形體感染產生的癥狀與SFTSV十分相似，沒有典型特征性癥狀和區(qū)別，該無形體感染的發(fā)病死亡率達到22%。目前，這類發(fā)熱伴出血，白細胞減少及血小板減少的病例，主要就是由嗜吞噬細胞無形體(Anaplasma phagocytophilum)和新型布尼亞病毒SFTSV感染引起。雖然這兩種感染在癥狀表現(xiàn)上沒有明顯區(qū)別，死亡率也都很高，但其對癥治療方法則差別很大。對于嗜吞噬細胞無形體感染，主要應用強力霉素和四環(huán)素。而對抗生素和抗病毒藥物不敏感。過多使用其他抗生素和抗病毒藥物還會造成器官負擔加重，臟器受損，病死率上升。對于新型布尼亞病毒SFTSV感染，則應盡早使用利巴韋林等抗病毒藥物及抑制后續(xù)細菌真菌感染的各類敏感型抗生素配合治療。
由此可見，對于因這兩類病原體感染引起的出血伴血小板減小綜合癥病例，必須盡可能的以最快速度獲得精確的定性診斷結果，這樣才能及時為患者制定正確的治療方案，否則，誤診，延誤，就會導致病情的延誤和錯誤的治療方案，甚至錯過治療時機，造成病人死亡。所以，目前急需能快速、精確的診斷這些主要病原體，尤其是對新型SFTSV病毒進行快速精確診斷的診斷方法，并且要求這種診斷方法操作簡便，成本低廉，適于農村，山區(qū)等欠發(fā)達地區(qū)有限的醫(yī)療資源和人員、設備條件，還要具有良好的靈敏度和高度的特異性。
根據(jù)衛(wèi)生部2010年發(fā)布的《發(fā)熱伴血小板減少綜合征診療方案》，我國檢測新型布尼亞病毒SFTSV的檢測方法主要有(1)血清中特異性抗體的檢測；(2)病原體核酸的PCR檢測；(3)病毒分離培養(yǎng)等方法。傳統(tǒng)的血清學檢測方法和病毒分離培養(yǎng)法。這些檢測法本身大都需要數(shù)周時間才能獲得準確的結果，完全無法及時對發(fā)病病患做出及時的診斷，且大都要求據(jù)有相當水準的實驗技能和一些精密的診斷儀器。因此無法滿足在農村，山區(qū)等條件艱苦地區(qū)開展。此外，由于患者血清中病毒血癥的發(fā)生要大大早于病毒的特異性抗體的出現(xiàn)，因此相比于傳統(tǒng)的血清學檢測方案，基于核酸檢測的PCR技術可以在更早的階段對病原體做出精確的診斷。但是，PCR檢測技術需要需要昂貴的設備和試劑，熒光定量PCR更是需要昂貴的探針和復雜的操作步驟，對人員的操作水平也有較高的要求，不適于在鄉(xiāng)村，山區(qū)，縣一級衛(wèi)生院等一線采用。

發(fā)明內容
針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明提供了一種發(fā)熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環(huán)SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒，及其使用方法，以及在檢測布尼亞病毒中的應用。本發(fā)明的布尼亞病毒SFTSV環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法，以低廉的檢測成本、方便的操作、快速的檢測速度，實現(xiàn)了高度特異性及與PCR相同的高靈敏度，將成為現(xiàn)有檢測技術的有力補充，為發(fā)熱伴血小板減少綜合癥的及時診療提供科學的依據(jù)，成為一種有效的診斷檢測手段。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的發(fā)熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環(huán)SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒，該試劑盒包括以下組分(1)1(^擴增檢測反應液擴增檢測反應液由水、200臟01/1 Tris-HCKpH 8.8)、100mmol/L KCl、80mmol/L MgS04、100mmol/L (NH4) 2S04 和 8mol/L Betaine 組成;(2)25mmol/l dNTP (四種等量的脫氧核糖核酸的混合物)；(3)擴增檢測用引物組為S片段特異性引物組、L片段特異性引物組或M片段特異性引物組，其中，S片段特異性引物組由F3/B3外引物、FIP/BIP內引物和LF/LB環(huán)引物組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 6所示,如表I所示；L片段特異性引物組由F3/B3外引物、FIP/BIP內引物和LF/LB環(huán)引物組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7 12所示,如表2所示；M片段特異性引物組由F3/B3外引物、FIP/BIP內引物和LF/LB環(huán)引物組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 13 18所示，如表3所示；表I.針對SFTSV病毒S片段的檢測引物
權利要求
1.發(fā)熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環(huán)SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括以下組分 (1)IOX擴增檢測反應液擴增檢測反應液由水、200mmol/L Tris-HClUOOmmol/L KC1、80mmol/L MgS04、lOOmmol/L (NH4) 2S04 和 8mol/L Betaine 組成；(2)25mmol/ldNTP ； (3)擴增檢測用引物組為S片段特異性引物組、L片段特異性引物組或M片段特異性引物組，其中， S片段特異性引物組由F3/B3外引物、FIP/BIP內引物和LF/LB環(huán)引物組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 6所示； L片段特異性引物組由F3/B3外引物、FIP/BIP內引物和LF/LB環(huán)引物組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7 12所示； M片段特異性引物組由F3/B3外引物、FIP/BIP內引物和LF/LB環(huán)引物組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 13 18所示；(4)Bst DNA 聚合酶8υ/μ I ；(5)反轉錄酶avian myeloblastrosis virus reverse transcriptase IOOU/μ I ； (6)熒光染料:1/1000SYBR GREEN I 或 HNB dye ；(7)ddH20。
2.根據(jù)權利要求I所述的發(fā)熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環(huán)SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒，其特征在于所述各組分構成一個反應體系，其用量為 (1)IOX擴增反應液2. 5μ I ;(2)25mmol/ldNTP 2μ I ； (3)F3/B3外引物:各 5pmol ； FIP/BIP 內引物各 40pmol ； LF/LB 環(huán)引物各 20pmol ；(4)Bst DNA 聚合酶1μ I ； (5)反轉錄酶1μI ; (6)熒光染料1μI ； (7)ddH20 :補足反應體積到20 μ I。
3.權利要求I或2所述的發(fā)熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環(huán)SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒在特異性檢測布尼亞病毒中的應用。
4.權利要求I或2所述的發(fā)熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環(huán)SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒的使用方法，其特征在于步驟如下 (1)以常規(guī)RNA提取方法從待檢測者血清標本中提取RNA溶液，提取的RNA溶液的OD260/OD280應在I. 6 2. O范圍內，濃度在10 IOOng/ μ I范圍內； (2)按照試劑盒的配方組成，在冰上，組合成20μ I反應體系，然后取上述提取的RNA溶液5 μ I加入該反應體系中； (3)上述反應體系置于63°C水浴中恒溫反應40±2min； (4)將水浴溫度調整到80°C 85°C，保持3min，使擴增反應終止； (5)擴增結果的判讀上述擴增反應終止后，觀察反應體系的顏色，進行以下判斷①可見光目視觀察在可見光下觀察，若反應體系的顏色變成略混濁的亮綠色，則是陽性；若反應體系的顏色不變，仍保持清澈透明的暗黃色，則為陰性； 或②紫外線輔助觀察在透射紫外線輔助照射下觀察，若反應體系被紫外線激發(fā)出明亮的綠色熒光，則是陽性，若反應體系不發(fā)出熒光，仍保持清澈透明的暗黃色，則為陰性； (6) 根據(jù)以上判斷結果，若判斷結果為陽性，則證明待檢測者血清標本中含有濃度大于IOcopy/μ I的SFTSV病毒S/L/M片段；若檢測結果為陰性，則證明待測血清標本中不含有SFTSV病毒或SFTSV病毒的濃度低于IOcopy/μ I的水平。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環(huán)SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒，由以下組分組成(1)10X擴增反應液2.5μl；(2)25mmol/l dNTP2μl；(3)F3/B3外引物各5pmol；FIP/BIP內引物各40pmol；LF/LB環(huán)引物各20pmol；(4)Bst DNA聚合酶1μl；(5)反轉錄酶1μl；(6)熒光染料1μl；(7)ddH2O。使用時，加入待檢測者的RNA，擴增后，觀察反應體系的顏色變化，并以此判斷檢測結果。本發(fā)明檢測試劑盒及檢測方法，檢測成本低廉、操作方便、檢測速度快，實現(xiàn)了高度特異性及與PCR相同的高靈敏度，為發(fā)熱伴血小板減少綜合癥的及時診療提供科學的依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102618669SQ20121010618
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月12日 優(yōu)先權日2012年4月12日
發(fā)明者劉元東, 李兵, 車吉泊, 靳曉紅, 黃尉初 申請人:中國人民解放軍濟南軍區(qū)聯(lián)勤部疾病預防控制中心