一種大規(guī)模培養(yǎng)nkt細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于細胞生物學領域，具體設及一種大規(guī)模培養(yǎng)NKT細胞的方法。
【背景技術】
[0002]NKT細胞（自然殺傷T細胞）是繼自然殺傷細胞（NK細胞）、T淋己細胞、B淋己細 胞之后又一類新型的T淋己細胞，屬于第4類免疫細胞。NKT細胞主要分布在骨髓、肝和胸 腺，在脾、淋己結和外周血中也有少量存在。NKT細胞絕大多數(shù)為CD4-CD8-雙陰性T細胞， 少數(shù)為CD4+單陽性T細胞。NKT細胞表面TCR可識別不同祀細胞表面CDl分子提呈的共有 楠脂類和糖脂類抗原，且不受血IC限制。NKT細胞最佳刺激效應物是a-半乳糖神經酷胺 (a-Galcer)，是一類來源于海綿體或共生微生物的提取物。
[0003] NKT細胞的主要生物學功能是細胞毒和免疫調節(jié)作用。NKT細胞的細胞毒作用表 現(xiàn)在NKT細胞可組成性表達IL-12IL-2和IFN-丫等細胞因子的受體。在相應抗原或細胞因 子作用下，NKT細胞活化，并通過分泌穿孔素使某些病毒感染、胞內寄生菌感染的祀細胞和 腫瘤祀細胞發(fā)生溶解破壞；也可通過表達經化s/化SL途徑使上述祀細胞發(fā)生調亡。 而NKT細胞的免疫調節(jié)作用表現(xiàn)在活化NKT細胞可分泌比-4和IFN- 丫等細胞因子。比-4 可誘導CD4+ThO細胞向CD4+Th2細胞分化，參與體液免疫應答或誘導B細胞發(fā)生I姐類別 轉換，參與速發(fā)型超敏反應；IFN-丫與比-12協(xié)同作用，可使CD4+ThO細胞向CD4+Thl細胞 分化，增強細胞免疫應答。此外NKT細胞還可分泌多種趨化性細胞因子如MCP-Ia、MIP-e1 等參與炎癥反應。
[0004] 近幾年在其表型特征、分布及發(fā)育、免疫學效應及與疾病關系、腫瘤治療和自身免 疫性疾病治療等方面的研究有了很大的發(fā)展。現(xiàn)有研究表明，NKT細胞在肝炎、脂肪肝等肝 病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，總之，NKT細胞作為一類新型的免疫調節(jié)細胞，在癌癥抗腫 瘤、抗感染、自身免疫性疾病等治療中具有遠大的應用前景。 陽〇化]目前NKT細胞的培養(yǎng)主要是直接添加細胞因子誘導純化刺激細胞增殖或通過篩 選特定細胞株共同培養(yǎng)刺激細胞的增殖，使分離外周血得到的PBMC中NKT細胞純化增殖。 但上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細胞數(shù)量少，操作繁瑣、效率低。而效應細胞數(shù)量的多少，直接影響 了殺傷率，也就影響到各種疾病的治療效果。此外還可通過篩選癌癥細胞株福照后誘導培 養(yǎng)NKT細胞。但此法有具有一定的安全隱患，如福照不完全，可能給患者引入新的癌細胞。

【發(fā)明內容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術存在的問題，提供一種大規(guī)模培養(yǎng)NKT 細胞的方法。采用本發(fā)明所述大規(guī)模培養(yǎng)NKT細胞的方法能刺激NKT細胞的大量增殖，高 效簡單，安全無害。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0008] 一種大規(guī)模培養(yǎng)NKT細胞的方法，包括如下步驟：
[0009] A、用含有IL-2和IL-15的RPMI1640培養(yǎng)基重懸PBMC，加入鐵皮石解素和自體血 清；
[0010]B、將重懸后的PBMC接種到含有成熟DC細胞的誘導MT細胞的培養(yǎng)板中，37°C、 5%C〇2培養(yǎng)箱中解育；
[0011] C、解育5天后，將培養(yǎng)板中誘導的NKT細胞轉入細胞培養(yǎng)瓶擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)到第14 天收集細胞。
[0012] 本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細胞的方法步驟A在培養(yǎng)基中添加鐵皮石解素和自 體血清。自體血清可W為細胞提供生長所需的細胞因子和營養(yǎng)物質，且安全性高。而鐵皮 石解素的添加不僅能促進NKT細胞的增殖和生長，同時具有輔助治療作用，且安全無毒副 作用。
[001引其中，在一些實施方案中，本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細胞的方法步驟A中所述 加入鐵皮石解素的終濃度為2mg/mL~12mg/血。
[0014] 在一些實施方案中，本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細胞的方法步驟A中所述自體 血清的加入量為含有IL-2和IL-15的RPMI1640培養(yǎng)基的lOv/v%。
[0015] 在一些實施方案中，本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)MT細胞的方法步驟A重懸后的 PBMC的細胞密度為0. 5X1〇6個/血~1X10 6個/mL。
[0016] 在一些實施方案中，本發(fā)明大規(guī)模培養(yǎng)MT細胞的方法步驟A中所述RPMI1640培 養(yǎng)基中比-2的濃度為lOOU/mL~lOOOU/mL，比-15的濃度為50ng/mL~200ng/mL。
[0017] 本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)MT細胞的方法步驟B采用成熟DC細胞固定在培養(yǎng)板 上與PBMC共同培養(yǎng)誘導NKT細胞，提供了相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，同時提高了安全性。
[0018] 在一些實施方案中，本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細胞的方法中步驟B所述含有 成熟DC細胞的誘導NKT細胞的培養(yǎng)板的制備方法為用含有GM-CSF和IL-4的RPMI1640培 養(yǎng)基重懸PBMC于37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天換一次液，第5天加入腫瘤抗原，第 6天加入TNF-a，第7天收集成熟的DC細胞，在37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中鋪板培養(yǎng)。
[0019] 其中，在一些實施方案中，所述含有成熟DC細胞的誘導NKT細胞的培養(yǎng)板的制備 方法中所述含有GM-CSF和IL-4的RPMI1640培養(yǎng)基中GM-CSF和IL-4的濃度均為200U/ 血~800U/mL。
[0020] 在一些實施方案中，所述含有成熟DC細胞的誘導MT細胞的培養(yǎng)板的制備方法中 所述腫瘤抗原的工作濃度為20Jig/mL~80Jig/mL。
[0021] 在一些實施方案中，所述含有成熟DC細胞的誘導MT細胞的培養(yǎng)板的制備方法中 所述TNF-a的工作濃度為200U/mL~800U/mL。
[0022] 在一些具體實施方案中，所述鋪板培養(yǎng)的時間為化。
[0023] 本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細胞的方法中步驟C將培養(yǎng)板中誘導的NKT細胞轉 入細胞培養(yǎng)瓶擴增培養(yǎng)。
[0024] 在一些實施方案中，所述擴增培養(yǎng)具體為每隔2天進行補液，補液前保證細胞的 密度不大于3XIO6個/mU補液后保證細胞密度為0. 5X10 6個/mL~1X10 6個/mL。
[00巧]其中，所述補液成分與步驟A完全相同。即含有IL-2、比-15、鐵皮石解素和自體血 清的RPMI1640培養(yǎng)基，所述RPMI1640培養(yǎng)基中IL-2的濃度為lOOU/mL~lOOOU/mL，比-15 的濃度為50ng/mL~200ng/mU所述鐵皮石解素的終濃度為2mg/mL~12111旨/111以所述自體 血清的加入量為含有IL-2和IL-15的RPMI1640培養(yǎng)基的lOv/v%。
[0026] 本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)MT細胞的方法還包括PBMC分離的步驟。
[0027] 在一些實施方案中，本發(fā)明所述的大規(guī)模培養(yǎng)NKT細胞的方法采用淋己細胞分離 管分離PBMC，分離得到的PBMC更多，且紅細胞少，減少后期紅細胞對NKT細胞生長的影響。
[0028] 在一些實施方案中，所述PBMC分離的步驟具體為抽取外周血，用生理鹽水按1:1 的比例稀釋，緩慢的加到Ficoll淋己細胞分離液上，SOOg離屯、20min;離屯、結束后，抽取單 核球（PBMC)條帶層于離屯、管中，用生理鹽水定容后400g離屯、IOmin;將上述離屯、的PBMC再 次 400g離屯、lOmin。
[0029] 本發(fā)明所述大規(guī)模培養(yǎng)MT細胞的方法用含有IL-2和IL-15的RPMI1640培養(yǎng)基 重懸PBMC，加入鐵皮石解素和自體血清；將重懸后的PBMC接種到含有成熟DC細胞的誘導 NKT細胞的培養(yǎng)板中，37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中解育；解育5天后，將培養(yǎng)板中誘導的NKT細胞 轉入細胞培養(yǎng)瓶擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)到第14天收集細胞。本發(fā)明所述方法操作簡單，安全無害。 實驗表明，采用本發(fā)明所述大規(guī)模培養(yǎng)NKT細胞的方法能刺激NKT細胞的大量增殖，并且培 養(yǎng)的NKT細胞細胞活率高，對K562細胞的殺傷能力明顯增強。
【附圖說明】
[0030] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0031] 圖1示實施例3中A組培養(yǎng)方法培養(yǎng)的P2代NKT細胞的細胞表面標志物的表達 結果圖，其中圖a為FSC及SSC表達情況圖，圖b為CD56及CD3表達情況圖；
[0032] 圖2示實施例3中B組培養(yǎng)方法