專利名稱：從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)和抽提原花青素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于發(fā)展可可組織細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。本發(fā)明還涉及選擇生產(chǎn)高水平原花青素的細(xì)胞系及從細(xì)胞培養(yǎng)物中抽提同樣物質(zhì)以生產(chǎn)食品配料、食品添加劑、治療組合物、或化妝品組合物的方法。本發(fā)明還涉及新培養(yǎng)基，如用于生長(zhǎng)可可細(xì)胞的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基及用于提高此懸浮細(xì)胞的原花青素生產(chǎn)的液體培養(yǎng)基組合物。
背景技術(shù)：
多酚廣泛分布于植物、水果和蔬菜中，并且因其在人類和動(dòng)物健康中的生理功能(包括抗氧化、抗突變和預(yù)防癌癥的活性)受到了相當(dāng)?shù)闹匾?Salvia等，J. Agric. Food Chem. 39 :1549-1552,1991 ；Bomser 等，Cancer Lett.，135 :151-157,1999 ；Zhao 等， Carcinogenesis, 20 1737-1745，1999)。流行病學(xué)研究曾暗示了多酚中的黃酮類化合物可以降低心臟病的風(fēng)險(xiǎn)(Hertog等，Lancet :342 :1007_1011，1993)。此外，已有結(jié)果顯示膳食黃烷-3-醇和/或原花青素在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中降低了動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)病率(Tijburg 等，Atherosclorosis, 135 :37-47,1997 ；Yamakoshi 等，Atherosclerosis, 142:139-149, 1999)。負(fù)責(zé)這些效果的機(jī)制之一涉及到它們對(duì)于低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制作用 (Steinberg, Circulation, 85 :2337-2344,1992)。已知可可植物(可可屬可可Theobroma cacao L·，梧桐科)的種子富含多酚 (Porter等，Phytochemistry, 30 1657-1663，1991)。制備自發(fā)酵和烘烤可可豆的可可酒的某些抗氧化組分(可可和巧克力產(chǎn)品的主要成分)已被鑒定為黃烷-3-醇和原花青素寡聚體(Sanbongi 等，J. Agric. Food Chem. ,46 :454-457,1998 ；Adamson 等，J. Agric. Food Chem. ,47 :4184-4188,1999)?？煽蓪俚钠渌N和如Herrania的其他屬也是可可原花青素的已知的來(lái)源?？煽蓪俚亩畟€(gè)不同種已有所描述，但通常只有十二種被接受。在這些種中，九個(gè)原產(chǎn)于亞馬遜河流域，因此遺傳分布的中心似乎是該區(qū)域的西半部(Giacometti，1994，In "Neglected Crops :1492 from a different perspective (J. E. Hernando Berme jo 禾口 J. Leon，編)Plant Production and Protection Series No. 26, FAO, Rome, Italy, p205_209)?？煽蓪僖话阍谛聼釒^(qū)，并且分布在北緯18°和南緯15°之間的西半球的熱帶雨林中。具有最多物種的區(qū)域是在哥斯達(dá)黎加和東北哥倫比亞之間。人們發(fā)現(xiàn)了五派和二十個(gè)種。大花可可樹(Theobroma grandif lorum)屬于由i^一個(gè)種組成的 Glossopetalum(Glossopetalum)派；可可屬可可是可可派的唯一種?？煽蓪俚乃膫€(gè)種已被描述為可食用肉的生產(chǎn)者大花可可樹、Theobroma canumanense Pires & Froes、Theobroma subincanum Martius、(巴西的 Cupui 及哥倫比亞的Cacau de monte)禾口Theobroma tricolor Humb. & Bonpl，是自西亞馬遜河流域至南墨西哥都有分布的小樹。巧克力也由這些種的種子制造(Giacometti，1994，In "Neglected Crops :1492 from a different perspective (J. E. Hernando Berme jo 禾口 J. Leon，編)Plant Production and Protection Series No. 26，F(xiàn)7V0，Rome，Italy，p205_209) 。 g.glUg 可可屬與Herrania屬的幾個(gè)種的豆生產(chǎn)類似的原花青素，并且這些化合物能從豆中抽提 (Romanczyk 等，WO 97/36497)。可可豆中的多酚儲(chǔ)存于子葉的色素細(xì)胞中。根據(jù)那些色素細(xì)胞(也稱為多酚儲(chǔ)存細(xì)胞)中的花青素量，它們是白色到深紫色的。在這些細(xì)胞中能區(qū)分三組多酚兒茶酸或黃烷-3-醇( 37%)、花青素( 4%)、及原花青素( 58%)。主要的兒茶酸是(-)_表兒茶酸，其構(gòu)成高達(dá)35%的總多酚含量。原花青素(通常被稱為原花青素 (proanthocyanidins))主要是黃烷_3，4- 二醇，其4 — 8或4 — 6結(jié)合于聚集的二聚體、三聚體、或寡聚體，以表兒茶酸作為主要延伸亞單位(Romanczyk等，WO 97/36497)。在新鮮可可豆的干的不含脂肪的質(zhì)量中可溶性多酚的總量為15%到20% (相當(dāng)于含有脂肪和6%水分的空氣干燥可可豆的 6%)，而在發(fā)酵豆中為 5%。因此，使用可可豆作為多酚來(lái)源的一個(gè)主要缺點(diǎn)是在豆的加工過(guò)程中損失了大部分多酚。其他步驟如烘烤和脫脂也導(dǎo)致?lián)p失。因而，可可粉中只有10%以下的新鮮豆中所發(fā)現(xiàn)的總多酚。使用可可豆的另一個(gè)問(wèn)題是可可屬可可這個(gè)植物的有限生長(zhǎng)范圍。它僅生長(zhǎng)于赤道北緯和南緯約20°的面積內(nèi)溫暖、潮濕的氣候中。這使得在儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)至加工及多酚抽提區(qū)域的過(guò)程中保持豆的多酚含量變得困難。植物細(xì)胞培養(yǎng)物是克服這些問(wèn)題的有吸引力的替代方法。最近植物細(xì)胞培養(yǎng)物已被用于分離黃酮類化合物。關(guān)于原花青素的情況，幾個(gè)組已經(jīng)能夠從培養(yǎng)物中分離特殊的化合物。例如，已經(jīng)從R0sa(R0sa)培養(yǎng)物中分離到4 —8連接的(-)-表兒茶酸-(+)-兒茶酸和五倍子酸(Muhitch & Fletcher, Plant Physiol. , 75 :592-595,1984) 已發(fā)現(xiàn)日本柳杉(Cryptomeria japonica)的懸浮培養(yǎng)物和愈合組織生產(chǎn)多達(dá)干重的原花青素 (Teramoto & Ishikura,Bot. Mag. Tokyo 98 :171-179,1985 ；Ishikura & Teramoto,Agric. Biol. Chem. 47 :421-423，1983)，而花旗松(Pseudotsuga mensiesii)懸浮培養(yǎng)物生產(chǎn)多達(dá)其干重40%的原花青素(Stafford & Cheng，Phytochemistry 19 131_1；35，1980)。還有報(bào)告顯示在葡萄(Vitis vinifera)的懸浮培養(yǎng)物中生產(chǎn)原花青素(Decendit & Merillon， Plant Cell Rep. 15 :762-765,1996 ；Waffo-Teguo 等，Phytochem. 42 1591-1593，1996)。可可屬可可的組織培養(yǎng)研究集中于體細(xì)胞胚胎發(fā)生，已在幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室中發(fā)展了該技術(shù)用于植物無(wú)性繁殖的目的。han在1977年第一個(gè)報(bào)道了可可屬可可體細(xì)胞胚胎發(fā) 生(Proc. 5th Int. Cacao Res. Conf. 1975. Ibadan Cacao Res. Inst. Nigeria，1977 116-125，1977)，他描述了使用未成熟合子胚組織外植體的方法。后來(lái)其他人也報(bào)道了類似方法(Pence 等，J. Am. Soc. Hort. Sci. 104 :145-148,1979 ；Villalobos & Aguilar，Abstr. VII Int. Congr. Plant Tissue and Cell Cult. ,Amsterdam,Int. Assoc. for Plant Tissue Culture, pp 140，1990)。后來(lái)的研究集中于從包括葉(Litz, In Dimick, P. S.，編，Cacao biotechnology symposium. The Pennsylvania State University Press, University Park, PA, pp 111-120,1986)、珠心(Chatelet 等，C. R. Acad. Sci.，Paris 315 :55-62, 1992 ；Figueira & Janick，Acta Hort. 336 :231-238,1993 ；Sondhal 等，Acta Hort. 336 245-248,1993)及包括花瓣和雄蕊的花卉外植體(Lopez-Baez等，C. R. Acad. Sci.，Paris 316 :579-584,1993 ;Alemanno 等，Plant Cell Tiss.Organ Cult. 46 :187—194，1996 ； Alemanno & Michaux-Ferriere, In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 33 :163-172,1997)的體組織中發(fā)展組織培養(yǎng)方法。這些早期方法，盡管是成功的，并不適用于所有基因型，并且再生植物的頻率較低。人們還發(fā)展了能繁殖更大范圍基因型的更有效方法(Li等，h Vitro Cell Dev.Biol. Plant 34 :293-299,1998 ；Maximova φ, In Vitro Cell Dev.Biol. Plant 38 :252-259, 2002)。然而，當(dāng)使用組織培養(yǎng)方法以生產(chǎn)體細(xì)胞胚胎時(shí)，所有已描述的方法均未給出飼養(yǎng)懸浮細(xì)胞的方法。關(guān)于發(fā)展可可屬可可的細(xì)胞培養(yǎng)只有有限數(shù)量的工作發(fā)表。這個(gè)工作絕大多數(shù)在 1970，和 1980，年間(Hall & Collin, Annals of Bot. 39 :555,1975 Jalal & Collin, Phytochem. 16 :1377-1380,1977 Jalal & Collin，New Phytol. 83 :343-349,1979 ；Tsai 等，J. Food Sci. 47 :768-773,1982 ；Wen 等，J. Am. Oil Chemist，s Soc. 16 :1720-1724, 1984)。這些工作中，只有幾個(gè)研究了可可屬可可細(xì)胞培養(yǎng)物中的黃酮類。例如，Jalal和 Collin(1979)報(bào)道了愈合組織和細(xì)胞懸浮物中的黃酮類組合物類似并且與最初完整子葉的黃酮類組合物相比變化少得多。兩種組織培養(yǎng)物均含有(-)_表兒茶酸、無(wú)色花青素、咖啡酸和香豆酸。在組織培養(yǎng)物中檢測(cè)不到甲基化嘌呤、可可堿和咖啡因。然而，Gurney等 (J. Expt. Bot. 43 :769-775,1992)報(bào)道了可可屬可可的愈合組織和懸浮培養(yǎng)物生產(chǎn)濃度約為那些體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的10%的咖啡因、可可堿和茶堿。尚未有現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道寡聚體原花青素的形成，近年來(lái)寡聚體原花青素已顯示出最大的生物學(xué)效果。Jalal和Collin (New Phytol. 83 =343-349,1979)報(bào)道了在可可屬可可細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測(cè)無(wú)色花青素。然而，基于用來(lái)檢測(cè)化合物的方法，不可能鑒定無(wú)色花青素的性質(zhì)或大小。另外，對(duì)可可屬或Herrania其他種的組織培養(yǎng)方法未有描述。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)展用于生成能生產(chǎn)高產(chǎn)量原花青素的細(xì)胞培養(yǎng)物的方法及發(fā)展用于從培養(yǎng)物有效抽提這些化合物的方法能顯著提高這些有價(jià)值的化合物的生產(chǎn)，并且不需要發(fā)展新方法用于加工可可豆以降低原花青素?fù)p失的繁重任務(wù)。本發(fā)明描述了此類細(xì)胞培養(yǎng)物和方法。本發(fā)明提供制備基本上無(wú)黃嘌呤生物堿的可可多酚制備物的方法，該方法包括在足以導(dǎo)致可可多酚的生產(chǎn)的時(shí)間和條件下在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)可可屬或Herrania細(xì)胞， 并從細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中收獲可可多酚。在本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方案中，在足以導(dǎo)致可可原花青素(例如，寡聚體原花青素)的生產(chǎn)的時(shí)間和條件下在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)可可屬或Herrania細(xì)胞，并且從細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中收獲可可原花青素。在這些方法的實(shí)施例中， 所得的可可多酚(或原花青素)制備物基本上(或在某些情況下完全)不含有可檢測(cè)的咖啡因和/或可可堿。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)可可細(xì)胞的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的方法。這些方法的實(shí)施例涉及在固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上從不成熟可可屬花卉外植體或從可可屬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中生長(zhǎng)愈合組織；從可可屬愈合組織培養(yǎng)物中選擇快速生長(zhǎng)的細(xì)胞系；并通過(guò)接種快速生長(zhǎng)的細(xì)胞系于液體培養(yǎng)基起始細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。以實(shí)施例的方式，在某些情況下可可屬可可不成熟花卉外植體
6選自退化雄蕊、萼片及花瓣基部外植體。在其他特定的、非限制性的實(shí)施例中，可可屬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)選自年輕或成熟的葉、莖、分生組織、節(jié)點(diǎn)、或節(jié)間。本發(fā)明還提供了用此處所述方法的任一個(gè)生產(chǎn)的基本上無(wú)黃嘌呤生物堿的可可多酚制備物。在具體實(shí)施方案中，可可多酚制備物缺乏可檢測(cè)水平的黃嘌呤生物堿(該制備物是無(wú)黃嘌呤生物堿的)。在其他實(shí)施方案中，在指數(shù)生長(zhǎng)階段的末期加入補(bǔ)充的葡萄糖到懸浮培養(yǎng)物增加了原花青素的生產(chǎn)。在此涵蓋的還有以所述方法任一個(gè)生產(chǎn)的可可屬或Herrania細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物， 及這些細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物用以生產(chǎn)可可多酚(例如原花青素)的使用。此處還提供了可可多酚制備物，包括可可多酚的混合物并且基本上不含有咖啡因和/或可可堿，該制備物是從可可屬或Herrania細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中抽提得到。在特定的、非限制性的實(shí)施例中，可可多酚制備物包括原花青素(例如，寡聚體原花青素)并且基本上不含有咖啡因和/或生物堿。 具體的、非限制性的實(shí)施方案中，在此所述的可可多酚能被用于飲食、化妝品、治療或獸醫(yī)組合物。下面的說(shuō)明中上述和其他對(duì)象、特征和優(yōu)勢(shì)將更加明顯，下面的說(shuō)明參考附圖進(jìn)行。


圖1是快速生長(zhǎng)細(xì)胞系的照片。圖2是顯示在不同接種密度的培養(yǎng)物中生物量密度的典型時(shí)相圖。圖3是顯示來(lái)自營(yíng)養(yǎng)組織的所選健康細(xì)胞隨時(shí)間推移的細(xì)胞生長(zhǎng)和碳水化合物消耗的圖。圖4是顯示來(lái)自營(yíng)養(yǎng)組織的細(xì)胞因?yàn)榧?xì)胞選擇過(guò)程隨時(shí)間推移的原花青素生產(chǎn)改善的圖。圖5說(shuō)明了測(cè)定原花青素的丁醇-鹽酸水解分析。原花青素的酸水解導(dǎo)致其分解為兩個(gè)單體形式，顏色為粉紅色的(-)_表兒茶酸和花青素。在每個(gè)樣本中的粉色的強(qiáng)度代表了在不同細(xì)胞系中得到的原花青素量(圖5A)。圖5A中的方法被優(yōu)化為96孔板形式用于快速篩選樣本(圖5B)。藍(lán)色素在520nm吸收而表兒茶酸在^Onm吸收(圖5C)；從藍(lán)色素吸收值來(lái)計(jì)算定量。圖6是來(lái)自可可屬可可細(xì)胞培養(yǎng)物的原花青素和生物堿的系列色譜。圖6A至6C 代表不同的可信標(biāo)準(zhǔn)化合物的高效液相色譜LC-MS分析。圖6D至6F顯示可可屬可可懸浮細(xì)胞的高效液相色譜LC-MS分析。圖7是顯示MX1440-3496細(xì)胞系中由于添加補(bǔ)充葡萄糖的隨時(shí)間推移的原花青素生產(chǎn)增強(qiáng)的圖。圖8是未發(fā)酵可可抽提物(圖8A)和懸浮細(xì)胞抽提物(圖8B)以熒光檢測(cè)器模式的系列高效液相色譜的色譜。標(biāo)記1到12指示原花青素多聚化的程度，分別是1、單體；2、 二聚體；3、三聚體；4、四聚體；5、五聚體；6、六聚體；7、七聚體；8、八聚體；9、九聚體；10、十聚體；11、十一聚體；12、十二聚體。圖9是未發(fā)酵可可抽提物(圖9A)和懸浮細(xì)胞抽提物(圖9B)以PDA檢測(cè)器模式在^Onm的系列HPLC色譜。
圖10是系列圖，顯示了在可可屬可可細(xì)胞培養(yǎng)物中的原花青素生產(chǎn)力和產(chǎn)量及碳水化合物消耗。圖IOA和圖IOB闡明自非花卉和花卉組織的懸浮培養(yǎng)物的原花青素生產(chǎn)力(圖10B)和生產(chǎn)量(圖10A)。圖IOC顯示對(duì)于原花青素生產(chǎn)力改善的細(xì)胞選擇效應(yīng)。 圖IOD顯示對(duì)于原花青素生產(chǎn)量改善的細(xì)胞選擇效應(yīng)。圖IOE顯示在培養(yǎng)基XXVI中可可屬可可細(xì)胞培養(yǎng)物的碳水化合物分析(表1)。
具體實(shí)施方式
I.縮寫
2,4-D2，4_ 二氯苯氧乙酸
2iP6-(y, Y-二甲基丙烯胺)嘌呤
B5Gamborg ‘ s B5
BA芐基腺嘌呤
CPChee 禾口 Poole
DKffDriver 禾口 Kuniyuki Walnut(Driver and Kuniyuki Walnut)
FAB/MS 快原子轟擊/質(zhì)譜
HCl鹽酸
HPLC高效液相色譜
H2SO4硫酸
IAA吲哚乙酸
IBA吲哚丁酸
LC液相層析
LSIMS液體二次離子質(zhì)譜
MS質(zhì)譜
MS培養(yǎng)基，
維生素，
^ife Murashige 禾口 Skoog Murashige 禾口 Skoog _生素，MurashiglSkoog鹽
NAA1-萘乙酸
匪R核磁共振
NNNitsch 禾口 Nitsch
PCV細(xì)胞壓積
PDA光電二極管陣列
QLQuiorin 禾口 Lepoivre
RI折射率
rpm每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)
SHSchenk 禾口 Hildebrandt
TDZthisdiazuron
TLC薄層層析
vvm每分鐘每體積培養(yǎng)物的氣體體積
WPM McCown，s Woody 植物培養(yǎng)基II. 術(shù)語(yǔ)除非另有說(shuō)明，按傳統(tǒng)用法使用技術(shù)術(shù)語(yǔ)。為方便綜述本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案，提供了下列特殊術(shù)語(yǔ)的解釋抗氧化物是降低氧化損傷(由氧造成的損傷)如自由基造成的損傷的物質(zhì)。愈合組織是大量的薄壁、未分化植物細(xì)胞，是由創(chuàng)傷或在營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)發(fā)展而來(lái)。兒茶酸是在植物中天然產(chǎn)生的多酚類化合物。它們也被稱為黃烷-3-醇。可可是可可屬可可(梧桐目下)的種子并且主要由兩個(gè)品種構(gòu)成Criollo和 Forestero,分為若干亞種。被稱為Trinitario的第三組是Criollo和Forestero的雜交。此處包括的其他種有(例如)大花可可樹(Theobroma grandiflorum)、可可屬 obovatum(Theobroma obovatum) > 可可屬 speciosum(Theobroma speciosum)、可可屬 subincanum(Theobroma subincanum)禾口可可屬棒子豐公(Theobroma sylvestris)。黃酮類是含有特征性三聚芳香雜環(huán)核的一組化合物中的任一個(gè)，通常產(chǎn)生為糖苷形式并在植物中廣泛分布，經(jīng)常作為色素。多酚是水溶性植物色素，也被稱為生物黃酮，其包括了超過(guò)4000個(gè)化學(xué)唯一的黃酮類化合物(可以根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類)。多酚單體包括兒茶酸、表兒茶酸、無(wú)色花青素。多酚寡聚體包括原花青素。原花青素是由兩個(gè)到多于五十個(gè)單位之間的偶聯(lián)的兒茶酸單位構(gòu)成的多聚體化合物。原花青素一般還被稱為原花青素(proanthocyanidins)或濃縮單寧。懸浮培養(yǎng)是個(gè)過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程，原核或者真核細(xì)胞在可控的條件下于液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中生長(zhǎng)。組織培養(yǎng)是保持組織存活并生長(zhǎng)于培養(yǎng)基的技術(shù)或過(guò)程。黃嘌呤、黃嘌呤衍生物(3，7- 二氫-嘌呤-2，6- 二酮)，是一組生物堿，其通常被用于作為溫和興奮劑和支氣管擴(kuò)張藥的效應(yīng)。甲基化黃嘌呤衍生物包括咖啡因、副黃嘌呤、茶堿和可可堿(主要在巧克力中發(fā)現(xiàn))。這些化合物抑制磷酸二酯酶和拮抗腺嘌呤核苷。除非另作解釋，在此使用的所有技術(shù)和科技用語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員通常所理解的具有相同含義。除非上下文另外明顯說(shuō)明，單數(shù)用語(yǔ)“a，"an, ”和“the” 包括復(fù)數(shù)對(duì)象。類似地，除非上下文另外明顯說(shuō)明，單詞“或”有意包括“和”。因此“包括A 或B”意思是包括A、或B、或A和B。盡管類似于或等同于在此所述那些的方法和材料可被用于實(shí)踐或試驗(yàn)本發(fā)明，下面描述了適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。在此提及的所有文獻(xiàn)、專利申請(qǐng)、 專利及其他參考以其整體引入作為參考。在沖突的情況下，本說(shuō)明書、包括術(shù)語(yǔ)的解釋，將被采用(control)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅作說(shuō)明而無(wú)意限制本發(fā)明。III. 幾個(gè)實(shí)施方案的概述此處第一個(gè)實(shí)施方案中提供制備基本上不含黃嘌呤生物堿的可可多酚制備物的方法，該方法包括在足以導(dǎo)致可可多酚生產(chǎn)的時(shí)間和條件下于懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)可可或 Herrania，并從細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中收獲可可多酚。在此方法的實(shí)施例中，產(chǎn)生的可可多酚制備物基本上(或在某些情況下完全地)沒(méi)有可檢測(cè)的咖啡因和/或可可堿。在其他特定實(shí)施例中，制備物含有少于50%水平的(如發(fā)酵豆莢所制造的可可多酚制備物中含有的)咖啡因和/或可可堿。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物生成的制備物含有(如發(fā)酵豆所制造的可可多酚制備物中含有的)少于30%、少于20%、少于15%、少于10%、或少于5%水平的咖啡因和/或可可堿。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，在足以導(dǎo)致可可原花青素(例如， 寡聚體原花青素)的生產(chǎn)的時(shí)間和條件下于懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)可可或Herrania(Herrania) 細(xì)胞，并從細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中收獲可可原花青素。在此處提供的代表性方法中，通過(guò)在固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)愈合組織(愈合組織來(lái)自不成熟的可可或Herrania花卉外植體或來(lái)自可可或Herrania營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))、從可可或 Herrania愈合組織培養(yǎng)物中選擇快速生長(zhǎng)細(xì)胞系及通過(guò)接種快速生長(zhǎng)細(xì)胞系于液體培養(yǎng)基中來(lái)起始細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物來(lái)生產(chǎn)可可或Herrania細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。在某些提供的方法中可可多酚(包括原花青素)的生產(chǎn)包括收獲細(xì)胞；在適當(dāng)?shù)娜軇┲袛噭蚣?xì)胞生物質(zhì)以抽提富含多酚部分；分離富含原花青素部分(如使用溶劑-溶劑萃取和/或?qū)游?；及可選地干燥或濃縮原花青素部分。在某些情況下，收獲細(xì)胞包括離心、過(guò)濾、或其組合。還提供了用此處所述方法任一個(gè)生產(chǎn)的基本上不含黃嘌呤生物堿的可可多酚制備物。通過(guò)實(shí)施例的方式，如果可可多酚制備物含有少于2%的可可堿和少于0. 5%的咖啡因，即可認(rèn)為其基本上不含黃嘌呤生物堿。在特定的非限制性實(shí)施例中，如果可可多酚制備物含有少于1.5%、少于1%、少于0. 5%或0%的可可堿和/或含有少于0. 25%、少于0.2%、少于0. 或0%的咖啡因，可認(rèn)為其基本上不含黃嘌呤生物堿。在另一實(shí)施例中，如果可可原花青素制備物含有少于2%的可可堿和少于0. 5%的咖啡因，即可認(rèn)為其基本上不含黃嘌呤生物堿。在特定的非限制性的實(shí)施例中，如果可可多酚制備物含有少于 1. 5%、少于1%、少于0. 5%或0%的可可堿和/或含有少于0. 25%、少于0. 2%、少于0. 1% 或0%的咖啡因，可認(rèn)為其基本上不含黃嘌呤生物堿。最理想的基本上不含黃嘌呤生物堿的水平是0%可可堿和0%咖啡因(制備物是無(wú)黃嘌呤生物堿的)。還有另一個(gè)實(shí)施方案是生產(chǎn)可可細(xì)胞的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的方法。此方法的實(shí)施例包括在固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)愈合組織(愈合組織來(lái)自不成熟的可可或Herrania花卉外植體或來(lái)自可可或Herrania營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))；從可可或Herrania愈合組織培養(yǎng)物中選擇快速生長(zhǎng)細(xì)胞系；通過(guò)接種快速生長(zhǎng)細(xì)胞系于液體培養(yǎng)基中來(lái)起始細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。通過(guò)實(shí)施例的方式，在某些情況下不成熟可可屬可可或Herrania花卉外植體選自退化雄蕊、萼片和花瓣基部外植體。在其他特定的非限制性的實(shí)施例中，可可屬可可或Herrania營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)選自年輕或成熟的葉、莖、分生組織、節(jié)點(diǎn)、或節(jié)間?？蛇x地，生產(chǎn)可可細(xì)胞的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的方法還包括在燒瓶、任何適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)容器或生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。例如，在某些情況下在容器或生物反應(yīng)器中并以分批、分批添料或連續(xù)模式實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)。此處涵蓋的還有通過(guò)所述方法任一個(gè)生產(chǎn)的可可或Herrania細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物， 以及這些細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物用以生產(chǎn)可可多酚或(更特定的)原花青素的使用。本發(fā)明提供的另一實(shí)施方案是包括可可多酚混合物、且基本上天然不含咖啡因和可可堿的可可多酚制備物，該制備物抽提自可可或Herrania細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。以實(shí)施例的方式，如果可可多酚制備物含有少于2%的可可堿和少于0. 5%的咖啡因，即可認(rèn)為其基本上不含咖啡因和可可堿。在特定的非限制性實(shí)施例中，如果可可多酚制備物含有少于1. 5%、少于1%、少于0. 5%或0%的可可堿和/或含有少于0. 25%、少于0. 2%、少于0. 1% 或0%的咖啡因，即可認(rèn)為其基本上不含黃嘌呤生物堿。最理想的基本上不含黃嘌呤生物堿的水平是0%可可堿和0%咖啡因。參考“基本上天然不含咖啡因和可可堿”的術(shù)語(yǔ)“天然” 表明咖啡因和可可堿的相對(duì)缺乏不是經(jīng)由純化步驟(如LH-20體積排阻層析)產(chǎn)生。在其他實(shí)施方案中，在指數(shù)生長(zhǎng)階段末期加入補(bǔ)充的葡萄糖到懸浮培養(yǎng)物中增加了原花青素生產(chǎn)。又一實(shí)施方案是可可多酚制備物，該制備物生產(chǎn)不經(jīng)過(guò)使用正己烷或其他有機(jī)溶劑的脫脂步驟。因此，此處涵蓋的是不使用正己烷生產(chǎn)(如抽提)的可可多酚(例如原花青素)的制備物。在特定實(shí)施方案中還提供了可可多酚制備物，其中從可可屬或Herrania細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中抽提包括收獲細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)娜軇┲袛噭蚣?xì)胞生物質(zhì)以抽提富含多酚部分，分離富含原花青素部分(如使用溶劑-溶劑萃取和/或?qū)游?，及可選地干燥、凍干、或濃縮原花青素部分。例如，收獲細(xì)胞可以包括離心、過(guò)濾、或其組合。可以理解此處提供的可可多酚制備物可以用在膳食組合物、和/或治療組合物、 和/或獸醫(yī)組合物、和/或化妝品組合物中。還可以理解此處所述的和/或用此處所述方法生產(chǎn)的代表性制備物含有包括兒茶酸、表兒茶酸和原花青素寡聚體的可可多酚。在特定實(shí)施例中，寡聚體是二聚體直至十二聚體。例如，在某些制備物中，寡聚體包括二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、 八聚體、九聚體或其任意兩個(gè)或更多個(gè)的混合物。還可以理解其中可可多酚是可可原花青素的制備物。此處提供的可可多酚制備物可以液體形式、干燥形式或干粉形式提供。IV.可可組織培養(yǎng)在此所述的是用于從可可屬或Herrania細(xì)胞培養(yǎng)物中有效分離原花青素的方法。特別是，已建立了可可屬或Herrania細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物使得與抽提自可可豆的原花青素類似的原花青素能夠常規(guī)分離。而且，在此提供的方法導(dǎo)致了這些原花青素的多產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的生產(chǎn)。這些方法的代表性優(yōu)勢(shì)包括 由于控制氣候條件的可靠而持續(xù)的生物質(zhì)來(lái)源 在抽提過(guò)程中最小化原花青素降解的快速而有效的分離步驟 在組成上從細(xì)胞培養(yǎng)物分離的原花青素類似于從可可豆分離的那些原花青素 用于操作并優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)物原花青素生產(chǎn)力的技術(shù)一般來(lái)說(shuō)，在此所述的是從可可屬或Herrania植物的不同組織建立愈合組織培養(yǎng)物。建立的愈合組織被用于使用不同類型的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)飼養(yǎng)懸浮培養(yǎng)物。當(dāng)已建立穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，抽提細(xì)胞并通過(guò)可識(shí)別光譜方法分析原花青素含量，而使用 HPLC-MS方法來(lái)鑒定單獨(dú)的原花青素。自這樣的分析，選擇能生產(chǎn)所需的原花青素的懸浮培養(yǎng)物來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)力。生成可可培養(yǎng)物在此一般性概述生成可可培養(yǎng)物的過(guò)程，并在實(shí)施例中描述詳細(xì)的范例方法。簡(jiǎn)單講，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)已知變化變動(dòng)具體細(xì)節(jié)，但對(duì)于體細(xì)胞胚胎發(fā)生，可以如所述通過(guò)自來(lái)源于不同植物部分(例如，花卉組織如花瓣、萼片、雄蕊等，或非花卉營(yíng)養(yǎng)
11組織如節(jié)點(diǎn)、節(jié)間、年輕葉、成熟葉)的外植體建立愈合組織和懸浮培養(yǎng)物以實(shí)現(xiàn)原花青素生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物的起始。通過(guò)定期轉(zhuǎn)移部分培養(yǎng)細(xì)胞到新鮮培養(yǎng)基中，在新鮮懸浮培養(yǎng)基中維持懸浮培養(yǎng)物。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)性能和培養(yǎng)基中的糖消耗來(lái)確定轉(zhuǎn)移計(jì)劃和接種密度。一實(shí)施方案提供了改變?cè)ㄇ嗨睾康姆椒ǎ摲椒ㄉ婕霸谧阋云鹗歼@樣的培養(yǎng)物的條件下起始原花青素生產(chǎn)的培養(yǎng)，及建立足以用于建立生產(chǎn)型細(xì)胞培養(yǎng)物的生產(chǎn)培養(yǎng)基，隨后是在一段合適的時(shí)間內(nèi)按比例增加生產(chǎn)型細(xì)胞培養(yǎng)物以分離原花青素。相應(yīng)地，改變起始培養(yǎng)或建立生產(chǎn)型培養(yǎng)所需的條件能導(dǎo)致在此培養(yǎng)物中原花青素含量(量)的改變?？梢愿淖冎参锛?xì)胞培養(yǎng)物微環(huán)境中的物理方面(例如，光輻照度)和/或化學(xué)方面(例如，介質(zhì)組成或化學(xué)誘導(dǎo)子)以實(shí)現(xiàn)想要改變的含量。例如，為了增加培養(yǎng)物中的原花青素量，可以增加懸浮培養(yǎng)基中的碳水化合物 (如蔗糖或葡萄糖)濃度。此外，可以操作氮源(如硝酸銨)來(lái)生產(chǎn)植物細(xì)胞培養(yǎng)物中的次級(jí)代謝物(見(jiàn) Neera 等，Phytochemistry. 31 (12) =4143-4149,1992)。因此，降低可可屬或 Herrania細(xì)胞培養(yǎng)基中的氮源濃度可以被用以增加培養(yǎng)物中原花青素的生產(chǎn)。此外，注入某些氨基酸(如谷氨酸、甘氨酸和絲氨酸)也可能顯著影響次級(jí)代謝物的生產(chǎn)。結(jié)果是，為了增強(qiáng)原花青素的生產(chǎn)，可以增加可可屬或Herrania懸浮培養(yǎng)基中的這些氨基酸的濃度。 其他氨基酸也可以包括在培養(yǎng)基中，并且檢驗(yàn)其增加可可屬或Herrania懸浮培養(yǎng)物的原花青素生產(chǎn)的能力。為了實(shí)現(xiàn)改變可可屬或Herrania細(xì)胞培養(yǎng)物中的原花青素含量，也可以改變光照條件。例如，通過(guò)增加輻照或曝光長(zhǎng)度來(lái)改變光照，因而增加原花青素生產(chǎn)。還可以改變光輻照的波長(zhǎng)以實(shí)現(xiàn)增加原花青素生產(chǎn)。例如，已知紫外光能誘導(dǎo)植物細(xì)胞培養(yǎng)物中的花青素生產(chǎn)(Meyer, J. Biotechnology 93 :45-57,2002)。本領(lǐng)域內(nèi)已知的用于操作植物細(xì)胞培養(yǎng)物微環(huán)境的其他修改也涵蓋在本說(shuō)明書的范圍內(nèi)，并且本領(lǐng)域內(nèi)任何技術(shù)人員均可完成修改。從培養(yǎng)物中收獲可可細(xì)胞如在此所述生長(zhǎng)一批生產(chǎn)原花青素的可可屬或Herrania細(xì)胞，并且收獲細(xì)胞以抽提原花青素?？梢源颂幟枋龅亩喾N方法，實(shí)施例完成收獲懸浮細(xì)胞。一旦細(xì)胞培養(yǎng)物到達(dá)穩(wěn)定期并達(dá)到所需的原花青素生產(chǎn)力，允許培養(yǎng)物在容器中沉淀成緊密的一團(tuán)并且能夠輕輕倒掉培養(yǎng)基，留下大部分為固體的細(xì)胞生物質(zhì)。然后洗滌細(xì)胞生物質(zhì)以去除殘留的培養(yǎng)基并類似地輕輕倒掉。或者，可以離心細(xì)胞懸浮并丟棄上清 (培養(yǎng)基)，然后洗滌細(xì)胞質(zhì)并再次離心以丟棄液體。第三個(gè)選擇是過(guò)濾細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮以去除培養(yǎng)基。這些方法的任何一個(gè)可以使用在從幾毫升到生產(chǎn)級(jí)體積的幾千升培養(yǎng)物不等的細(xì)胞培養(yǎng)物體積。抽提步驟粉碎、研磨或磨碎收獲的細(xì)胞質(zhì)以勻質(zhì)化細(xì)胞質(zhì)，并且破碎細(xì)胞以使得抽提溶劑能與樣本更好地接觸，和保證提取的部分是代表整個(gè)樣本的。原花青素是不穩(wěn)定化合物。因此，如果在抽提前需要儲(chǔ)存細(xì)胞生物質(zhì)，優(yōu)選冷凍儲(chǔ)存，例如通過(guò)用液氮冷凍。除了幾個(gè)主要的差異，從可可屬或Herrania細(xì)胞培養(yǎng)物中抽提總多酚類似于從可可豆中抽提總多酚所用的步驟。在可可豆的情況下，磨碎豆之后的起始步驟是去除磨碎的片(碎粒)中的脂肪。此過(guò)程導(dǎo)致了多酚的損失。因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)物沒(méi)有豆子那么多的脂肪，因而不需要這個(gè)步驟。自細(xì)胞培養(yǎng)物抽提過(guò)程中去除此步驟降低了多酚的損失。而且，脫脂需要如正己烷的溶劑，并且在最終抽提物中發(fā)現(xiàn)有痕量溶劑。這導(dǎo)致了在自可可豆生產(chǎn)的抽提物中有難聞的氣味，并且溶劑可能是有毒的或不能用在某些用途 (如食品配料)。因?yàn)榇颂幩龅淖约?xì)胞培養(yǎng)物生物質(zhì)抽提的方法排除了使用溶劑(如正己烷)，在所得的抽提物中沒(méi)有溶劑污染或難聞的溶劑氣味。從磨碎、勻質(zhì)化的細(xì)胞中，代表性方法中的多酚以70%到80%甲醇水溶液或70% 丙酮水溶液、或其組合來(lái)抽提。也能使用水和乙醇，盡管使用這些溶劑只能部分抽提寡聚體原花青素，而根本不能抽提高分子量聚合物(Grayer，In J. B. Harborne, Plant Phenolics (Vol. 1)，pp 283-323,1989. San Diego, Academic Press, Inc. ；Lee & Widmer, In L. M. L. Nollet, Handbook of Food Analysis(Vol. 1)，pp 821-894,1996, Basel, New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.)。在徹底抽提次要組分之后，單獨(dú)的原花青素可能以稀釋水平存在于抽提物中， 在低溫(40°C以下)和在減壓下實(shí)現(xiàn)濃縮以最小化原花青素的降解(Lee & Widmer. In L. M. L. Nollet, Handbook of Food Analysis(Vol. 1),pp 821-894,1996, Basel,New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.)。在此階段自可可屬或Herrania細(xì)胞培養(yǎng)物的多酚抽提物相對(duì)干凈，能立刻對(duì)其進(jìn)行分析。此處所述方法的一個(gè)益處在于，與豆子的多酚抽提物相比，來(lái)源于可可屬或 Herrania細(xì)胞培養(yǎng)物的多酚抽提物的雜質(zhì)(例如，咖啡因和可可堿)開始就為檢測(cè)不到的水平。然而，做進(jìn)一步的清理以去除細(xì)微雜質(zhì)(如咖啡因和可可堿)是有益的。有可能清理抽提物以去除甚至是痕量的這些雜質(zhì)。此清理步驟可包括以非互溶溶劑所作的液-液分部和在葡聚糖LH-20、聚酰胺、Amberlite XAD-2、制備型HPLC上的柱層析，及使用可購(gòu)得一次性針筒的固相抽提(SPE) (Grayer, In J. B. Harborne, Plant Phenolics (Vol. 1)，pp 283-323,1989. San Diego, Academic Press, Inc. ；Markham & Bloor, In C. A. Rice-Evans and L. Packer,Flavonoids in Health and Disease,pp 1—33,1998,Basel,New York,Hong Kong, Marcel Dekker，Inc.) 0通常通過(guò)以氯仿或二氯甲烷抽提實(shí)現(xiàn)可可堿和咖啡因的去除，因?yàn)槎鄶?shù)黃酮類化合物在這些溶劑中溶解度有限。分析步驟用于檢測(cè)和鑒定自可可屬或Herrania細(xì)胞培養(yǎng)物得來(lái)的原花青素的分析技術(shù)與用于豆的抽提物的那些類似。主要使用多種層析技術(shù)分離寡聚體及隨后使用獨(dú)立的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定來(lái)實(shí)現(xiàn)可可原花青素的鑒定。Quesnel (Phytochemistry 7 :1583-1592,1968) 和Jalal與Collin (Phytochem. 16 1377-1380，1977)分別使用了紙層析和薄層層析法鑒定了可可中的原花青素。然而，盡管這些文獻(xiàn)承認(rèn)了原花青素存在于可可中，但未闡明原花青素的立體結(jié)構(gòu)。Porter等(Phytochemistry 30:1657-1663,1991)用柱層析、薄層層析、高效液相色譜及陰離子快原子轟擊/質(zhì)譜對(duì)可可原花青素進(jìn)行了嚴(yán)格的調(diào)查，從而發(fā)現(xiàn)了原花青素寡聚體直至七聚體的存在。此外他們使用核磁共振證實(shí)了原花青素直至四聚體的結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)它們主要由(-)_表兒茶酸構(gòu)成。Clapperton等報(bào)道了可可原花青素寡聚體直至八聚體的證據(jù)(Proceedings, 16th International Conference of Groupe Polyphenols, Lisbon，Portugal ；Groupe Polyphenols :Norbonne，F(xiàn)rance，Vol II,pp 112-115，1992)，他們使用柱層析、反相高效液相色譜及陽(yáng)離子液體二次離子質(zhì)譜的組合來(lái)鑒定原花青素寡聚體。此工作闡明了使用陽(yáng)離子液體二次離子質(zhì)譜及使用鈉加合物作為鑒定大一些的原花青素寡聚體的方法。不幸的是，所有這些方法都很費(fèi)力，需要較長(zhǎng)制備時(shí)間以獲得結(jié)構(gòu)信息， 并且經(jīng)不起大量細(xì)胞培養(yǎng)物樣本的高通量分析和篩選。而且，這些方法不適用于小樣本。對(duì)于本發(fā)明，我們發(fā)展了高通量微量方法用于自可可屬或Herrania細(xì)胞培養(yǎng)物中抽提原花青素，反相高效液相色譜法用于原花青素單體和寡聚體的快速分離，及質(zhì)譜 (MS)法用于基于其分子特征對(duì)原花青素寡聚體進(jìn)行同步鑒定?？煽蓪倩騂errania細(xì)胞培養(yǎng)物的大規(guī)模過(guò)程優(yōu)化在改進(jìn)工業(yè)用過(guò)程時(shí)大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)是個(gè)重要的技術(shù)。這可以在類似于微生物發(fā)酵所用的那些大罐中進(jìn)行。通過(guò)基于大規(guī)模過(guò)程中的細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)特征確定生物分子因素、及通過(guò)優(yōu)化能增強(qiáng)原花青素生產(chǎn)力的大規(guī)模生物過(guò)程變量，可以實(shí)現(xiàn)這些罐中生產(chǎn)力的增長(zhǎng)。生物分子因素包括培養(yǎng)基成分、誘導(dǎo)子和生物合成途徑中的前體。在大規(guī)模過(guò)程之前，應(yīng)該在燒瓶規(guī)模的過(guò)程中檢驗(yàn)這些因素，因?yàn)榉糯筮^(guò)程的目的在于大規(guī)模復(fù)制在小規(guī)模下觀察為最適的那些條件。然而，大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng)中的條件與燒瓶規(guī)模培養(yǎng)可可屬或Herrania懸浮細(xì)胞不同。由運(yùn)輸限制導(dǎo)致的影響懸浮細(xì)胞的環(huán)境條件改變會(huì)影響培養(yǎng)物的宏觀動(dòng)力學(xué)。例如，當(dāng)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)是規(guī)模不依賴的，在容器中細(xì)胞培養(yǎng)物的總體生長(zhǎng)是規(guī)模依賴性的，因?yàn)闅怏w和溶解的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸具有規(guī)模依賴 t生(Dicosmo & Misawa，Plant Cell Culture Secondary Metabolism,pp 11-44,1996. Boca Raton,Florida,CRC Press LLC)。因此，在放大可可原花青素生產(chǎn)的生物反應(yīng)器過(guò)程時(shí)，要完成許多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)以獲得生長(zhǎng)率、產(chǎn)物形成速率、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收速率及呼吸率的重要數(shù)據(jù)。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)增加細(xì)胞濃度和特定生產(chǎn)力，能夠?qū)崿F(xiàn)植物細(xì)胞培養(yǎng)物中的高生產(chǎn)力。最大細(xì)胞濃度依賴于營(yíng)養(yǎng)供給、每底物的生物質(zhì)產(chǎn)量和水含量?；诨A(chǔ)數(shù)據(jù)，可以逐一變動(dòng)另外的環(huán)境因素或同時(shí)變動(dòng)多個(gè)因素以增加生物量。生物過(guò)程變量如通氣量、懸浮培養(yǎng)的流變性能影響著生物反應(yīng)器中的傳質(zhì)與混合，并且反過(guò)來(lái)不僅影響細(xì)胞生長(zhǎng)而且影響植物次級(jí)代謝物的生產(chǎn)。因此，可能要考慮兩步培養(yǎng)，因?yàn)槎鄶?shù)多酚通常是非生長(zhǎng)相關(guān)的化合物。因?yàn)橐徊竭^(guò)程理論上將培養(yǎng)限制成單一生長(zhǎng)速率并且可能為單一發(fā)展階段，當(dāng)幾個(gè)發(fā)展階段是生產(chǎn)非生長(zhǎng)相關(guān)化合物的前提條件時(shí)，這個(gè)操作將不適合。分開優(yōu)化生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段的通氣率、攪拌速度、其他混合相關(guān)變量及甚至培養(yǎng)基組合物。然而，不可能放大過(guò)程而保持所有條件最適化。對(duì)于被認(rèn)為是最重要的變量必須做出選擇。因?yàn)樘荚春偷吹南鄬?duì)量在增強(qiáng)次級(jí)代謝物生物合成和細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮了重要作用，基于碳和氮消耗的基本工程學(xué)數(shù)據(jù)，還研究了補(bǔ)充碳源和氮源對(duì)于生長(zhǎng)和生產(chǎn)的效果(Basaria, Current Biology, 2 :370-374,1990)。然后，可以研究氧和二氧化碳的補(bǔ)充。除氧以外，已有報(bào)道二氧化碳能改善植物細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長(zhǎng)和次級(jí)代謝物生產(chǎn) (Thanh 等，Biologia Plantarum, 50 :752-754,2006 ；Tate & Payne, Plant Cell Reports， 10 :22-25,1991)。在細(xì)胞生長(zhǎng)階段植物細(xì)胞的氧需求相對(duì)低，但是在代謝物合成期間可能顯著增高。為了在可可屬或Herrania細(xì)胞的反應(yīng)器培養(yǎng)中達(dá)到其最佳使用，控制了這些氣體的水平。在大規(guī)模發(fā)酵中，不可能引入與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模引入的同樣量的氣體(空氣、氧等)。 因此，為了在生物反應(yīng)器過(guò)程中使得表觀氣速恒定，應(yīng)維持傳質(zhì)系數(shù)的常數(shù)。使用誘導(dǎo)子以刺激代謝物形成和分泌是重要的過(guò)程策略。它曾有效用于降低達(dá)
14到高產(chǎn)物濃度(如體積生產(chǎn)力)所需用的過(guò)程時(shí)間。而且，誘導(dǎo)可以導(dǎo)致新化合物的形成 (Payne 等，Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, pp333_351,1995, New York, John Wiley & Sons，Inc)。在大規(guī)模反應(yīng)器培養(yǎng)中檢驗(yàn)具有幾個(gè)生物/非生物備選物的誘導(dǎo)的優(yōu)化，以優(yōu)化應(yīng)處理誘導(dǎo)劑的時(shí)間、最佳的劑量、細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)劑的時(shí)長(zhǎng)及應(yīng)收獲細(xì)胞的時(shí)間。因?yàn)槊總€(gè)誘導(dǎo)劑能誘導(dǎo)生物合成途徑中不同類型的酶，還檢驗(yàn)了使用多重誘導(dǎo)劑處理的協(xié)同效應(yīng)以增強(qiáng)生產(chǎn)力。反應(yīng)器操作方法依賴于細(xì)胞生長(zhǎng)、生產(chǎn)及其關(guān)系的動(dòng)力學(xué)。如之前所述，在此研究中的靶標(biāo)化合物是非生長(zhǎng)相關(guān)的，這意味著必須考慮二步培養(yǎng)過(guò)程。因此，當(dāng)生產(chǎn)時(shí)間大大長(zhǎng)于生長(zhǎng)生物量所需的時(shí)間時(shí)，分批補(bǔ)料培養(yǎng)是特別吸引人的選擇，并且在此情況下，隨后的生物反應(yīng)器的體積的更大升級(jí)是可能的，會(huì)導(dǎo)致生物量列車中生物反應(yīng)器的數(shù)目較少。V.原花青素的用途及施用本發(fā)明方法生成的原花青素可以為治療、膳食或化妝品目的施用于受試者。受試者可以是人類或獸類哺乳動(dòng)物(如猴子、馬、奶牛、豬、狗、貓、小鼠或大鼠)。關(guān)于治療用途，可以使用原花青素來(lái)治療或預(yù)防若干失調(diào)或疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、癌癥、血壓變化和/或高血壓。例如，可以預(yù)防性地給有發(fā)展成腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的受試者、給患有腫瘤的受試者或給之前治療過(guò)腫瘤的受試者施用原花青素。腫瘤治療包括但不限于手術(shù)去除腫瘤、化療、免疫治療或放療。在其他實(shí)施方案中，通過(guò)在本發(fā)明方法生成的原花青素與至少一個(gè)其他試劑組合(或者在腫瘤治療之前、或者同時(shí)、或者之后)施用于受試者。其他試劑也可以是在此所述的抑制或降低腫瘤生長(zhǎng)的另一試劑?；蛘?，其他試劑可以是在治療腫瘤過(guò)程期間改進(jìn)受試者抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力的試劑或幫助受試者抵抗感染的試劑(如抗生素)。例如，其他試劑可以是刺激免疫系統(tǒng)的試劑，如細(xì)胞因子。通過(guò)在此提供的方法生成的原花青素可以施用于有發(fā)展任何類型腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的受試者，或施用于患有任何類型腫瘤的受試者。腫瘤可以是良性腫瘤或惡性腫瘤。腫瘤可以包括癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、或神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤。在幾個(gè)特定的非限制性實(shí)施方案中，腫瘤包括乳腺腫瘤、肝臟腫瘤、胰腺腫瘤、消化道腫瘤、結(jié)腸腫瘤、子宮腫瘤、卵巢腫瘤、宮頸腫瘤、睪丸腫瘤、前列腺腫瘤、腦腫瘤、皮膚腫瘤、黑色素瘤、視網(wǎng)膜腫瘤、肺腫瘤、腎腫瘤、骨腫瘤、骨肉瘤、鼻咽癌腫瘤、甲狀腺瘤、白血病、或淋巴瘤。一般來(lái)講，通過(guò)在此提供方法生成的原花青素以足以用于預(yù)防或抑制腫瘤生長(zhǎng)的量施用于受試者。在其他實(shí)施方案中，可以預(yù)防性地施用原花青素于有發(fā)展成動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病或高血壓風(fēng)險(xiǎn)的受試者?；蛘?，可以施用原花青素于受試者以治療已有的疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病或高血壓)。組合物可以與其他試劑一起施用或順序施用(其他試劑，如抗腫瘤試劑、抗氧化劑、或者緩解與動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、血壓改變和/或高血壓相關(guān)的癥狀或病征的試劑)。此外，本發(fā)明方法生成的原花青素能用在膳食組合物中。當(dāng)以液體形式口服施用時(shí)，液體可能是基于水的、基于奶的、基于茶的、基于果汁的或其某些組合。用于內(nèi)部施用的固體和液體配方還包括增稠劑、甜味劑。本發(fā)明方法生成的原花青素還可用在化妝品組合物中以改善受試者皮膚的質(zhì)量或外觀。通過(guò)外用、內(nèi)用或其組合施用原花青素組合物能實(shí)現(xiàn)皮膚外觀、紋理和濕度的改善?？山邮艿妮d體可以作為用于組合物成分的溶劑、載體、稀釋劑或分散劑起不同作用，并使得成分能以合適的稀釋程度統(tǒng)一用于皮膚表面。可接受的載體也可以有利于組合物滲透進(jìn)皮膚。含有本發(fā)明方法生成的原花青素的組合物能用于很多種的終產(chǎn)物(包括醫(yī)藥產(chǎn)品、食品產(chǎn)品和飲料組合物)，并可按照醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。 取決于所選的特定施用模式，包括活性試劑的醫(yī)藥組合物能夠與合適的固體或液體載體配制。用于本發(fā)明的醫(yī)藥可接受的載體和輔料是常規(guī)的。例如，腸外配方通常包括可注射液體，該液體是醫(yī)藥上及生理上可接受的液體媒介(如水、生理鹽水、其他平衡鹽溶液、葡萄糖水、甘油等)。包括的輔料有(例如)其他蛋白質(zhì)(如人血清白蛋白或血漿制備物)。如需要，待施用的原花青素組合物也可以含有微量的無(wú)毒輔助物質(zhì)(如潤(rùn)濕或乳化劑、防腐劑、及PH緩沖劑等)，例如醋酸鈉或山梨醇單月桂酸酯。除可注射液體之外，可以使用外用和口服制劑?？诜苿┛梢允且后w(例如，糖漿、飲料、溶液、或懸浮液)、或固體(例如，粉末、丸劑、片劑、或膠囊)。對(duì)于固體組合物，傳統(tǒng)無(wú)毒固體載體可包括醫(yī)藥級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。外用制備物可包括眼藥水、軟膏、霜?jiǎng)?、噴霧劑等。優(yōu)選地，適用于外用施用的本發(fā)明制劑與組合物成分的溶劑、載體、稀釋劑或分散劑相混合，并使得成分能以合適的稀釋程度統(tǒng)一用于皮膚表面?？山邮艿妮d體也有利于組合物滲透進(jìn)皮膚。通過(guò)所選施用模式確定原花青素組合物的劑型。制備這樣的劑型的實(shí)際方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)講是已知或顯而易見(jiàn)的。通過(guò)本發(fā)明方法生成的原花青素組合物可被施用于人類或獸類哺乳動(dòng)物，在它們的細(xì)胞內(nèi)組合物以多種方式(如外用、口服、靜注、肌注、腹腔注射、滴鼻、皮內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射和皮下注射)發(fā)揮效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮到案例的特殊情況(例如受試者、疾病、涉及的疾病狀態(tài)和是否是預(yù)防性治療)來(lái)選擇施用的特殊模式和給藥方案。治療可以包括在幾天到數(shù)月、或甚至數(shù)年的時(shí)期內(nèi)每日或每幾天給與一定劑量的化合物。這樣的組合物可以一定劑量并通過(guò)醫(yī)藥、營(yíng)養(yǎng)或獸醫(yī)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)施用給需要此施用的受試者，考慮到諸如特殊受試者的年齡、性別、體重和疾病狀況及施用方式等因素。用于醫(yī)療、膳食、化妝品和獸醫(yī)用途的組合物的制備、劑量和施用在領(lǐng)域內(nèi)眾所周知(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào) 5，554，645,5, 853，728,6, 194，020,6, 312，753,6, 998，417、 7，122，574,7, 314，634,7, 320，797和美國(guó)專利申請(qǐng)文獻(xiàn)號(hào)2007/0148107，所有這些在此引
入作為參考)。提供下列實(shí)施例以闡明某些特殊功能和/或?qū)嵤┓桨?。這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明為所述的特定技術(shù)特征或?qū)嵤┓桨浮?br> 實(shí)施例實(shí)施例1.可可屬可可愈合組織自花卉組織的誘導(dǎo)和增殖在可控條件下使用[D+]-葡萄糖作為碳源，使用以生長(zhǎng)素Qmg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D))、細(xì)胞分裂素(0. 005mg/L thisdiazuron(TDZ))及其他添加物(250mg/L L-谷氨酸、100mg/L肌醇)增強(qiáng)的完全Driver和Kuniyuki walnut (DKff)培養(yǎng)基，建立了緊密愈合組織聚集(表1中培養(yǎng)基I)。在調(diào)節(jié)PH至5. 8之后，以高壓滅菌消毒培養(yǎng)基。從若干栽培植物中收集可可屬可可的不成熟花卉材料樣本。為防止培養(yǎng)物的污染，在加入至培養(yǎng)基之前將材料進(jìn)行表面消毒。首先將材料浸泡于(w/v)次氯酸鈉中20分鐘并每5 分鐘輕輕攪動(dòng)一次。在滅菌條件下將材料輕輕倒出并以滅菌去離子水潤(rùn)洗三次并在每次潤(rùn)洗期間輕輕攪動(dòng)。輕輕倒去最后的潤(rùn)洗液，并且僅轉(zhuǎn)移花蕾至滅菌Petri板。用消毒的解剖刀從基部起在花長(zhǎng)的1/3位置處切過(guò)花蕾。從切口端的開口處提取雄蕊、萼片和花瓣基部外植體。放置提取的材料于固體愈合組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在每個(gè)平板的整個(gè)表面上分布大約 50個(gè)外植體。用封口膜密封Petri平板并在25°C維持其在黑暗中14天。10天后可觀察到主要的愈合組織的形成。在放置花的部分于愈合組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的14天內(nèi)，從外植體分離出愈合組織并放置于表1所列培養(yǎng)基I、II和III的愈合組織增殖培養(yǎng)基上。每隔四個(gè)星期，從愈合組織的表面分離出快速生長(zhǎng)的細(xì)胞并分培于新鮮培養(yǎng)基。選擇顯示為發(fā)白到淡黃色的快速生長(zhǎng)細(xì)胞系用來(lái)分培(圖1)。實(shí)施例2.可可屬可可愈合組織自營(yíng)養(yǎng)組織的誘導(dǎo)和增殖在添加了生長(zhǎng)素 Qmg/LIBA)、細(xì)胞分裂素(0. 005mg/L TDZ)及 L-谷氨酸(250mg/L)和葡萄糖(20g/L)作為碳源的Murashige和Skoog(MQ培養(yǎng)基中建立了愈合組織(表1，培養(yǎng)基XXVII)。在調(diào)節(jié)pH至5. 8之后，以高壓滅菌消毒培養(yǎng)基。從若干溫室生長(zhǎng)植物中收集可可屬可可的營(yíng)養(yǎng)材料樣本(年輕和成熟的葉、節(jié)點(diǎn)和節(jié)間)。為防止培養(yǎng)物的污染，在加入至培養(yǎng)基之前將材料進(jìn)行表面消毒。首先將材料浸泡于70%乙醇中1 分鐘，然后浸入25%漂白劑中10分鐘并每5分鐘輕輕攪動(dòng)一次。在滅菌條件下將材料輕輕倒出并以滅菌去離子水潤(rùn)洗三次并在每次潤(rùn)洗期間輕輕攪動(dòng)。將葉子切成5毫米正方形， 而節(jié)點(diǎn)及節(jié)間切成1-2毫米圓柱體，并外植于含固體培養(yǎng)基的平板上。在25°C、黑暗中維持平板。每天觀察其污染的跡象并丟棄污染的材料。在四周后觀察到愈合組織形成。六周之后，自外植體分離出愈合組織并放置于如上面所述及培養(yǎng)基XXVII (表1)所顯示的愈合組織增殖培養(yǎng)基上。然而，起始后，愈合組織非常快地增殖和建立。從愈合組織的表面分離新形成的細(xì)胞并以每?jī)芍艿拈g隔分培于新鮮培養(yǎng)基。選擇顯示為淡黃色到淺褐色的快速生長(zhǎng)細(xì)胞系進(jìn)行分培。在建立可可愈合組織之后，有必要檢驗(yàn)較低量的生長(zhǎng)素對(duì)于愈合組織可持續(xù)性的效果，因?yàn)榕囵B(yǎng)基XXVII中的高生長(zhǎng)素含量在延遲細(xì)胞生長(zhǎng)并在后代中形成深棕色愈合組織，顯示了細(xì)胞正在經(jīng)受壓力。檢驗(yàn)不同培養(yǎng)基維持可可愈合組織的能力以及維持培養(yǎng)基對(duì)于細(xì)胞懸浮創(chuàng)建的下游效應(yīng)。培養(yǎng)基XXVII在MS培養(yǎng)基中添加有6mg/L生長(zhǎng)素Qmg/L IAA和％ig/L IBA)、2X MS維生素及250mg/L谷氨酸及20g/L葡萄糖和7g/L瓊脂。用于維持時(shí)，將培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素降低至細(xì)g/L(aiig/L IAA和ang/L IBA，表1中培養(yǎng)基XXVIII) 和2mg/L生長(zhǎng)素(以IBA形式，表1中培養(yǎng)基XXIX)。降低生長(zhǎng)素至％ig/L改善了愈合組織的顏色，從深褐色到淺褐色直至黃色。愈合組織細(xì)胞生長(zhǎng)重回到旺盛的水平。建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和從培養(yǎng)基XXVII上分培的健康愈合組織建立的那些一樣容易。在含2mg/L生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中愈合組織的顏色變化并且細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)到旺盛的水平。然而，與培養(yǎng)基XXVIII中的愈合組織相比，當(dāng)這些愈合組織分培于同樣培養(yǎng)基時(shí)，愈合組織的細(xì)胞生長(zhǎng)降低。
在降低生長(zhǎng)素至ang/L之后，也記錄了去除過(guò)量MS維生素(表1中培養(yǎng)基XXX) 連同去除谷氨酸(表1中培養(yǎng)基XXXI)對(duì)于生長(zhǎng)的效果。來(lái)自這兩種培養(yǎng)基的愈合組織與來(lái)自培養(yǎng)基XXIX的愈合組織的生長(zhǎng)特征看起來(lái)并無(wú)不同。然而，注意到在培養(yǎng)基中存在過(guò)量維生素對(duì)于生產(chǎn)原花青素是有利的。用于維持可可營(yíng)養(yǎng)愈合組織的最好的培養(yǎng)基是培養(yǎng)基XXVIII，因?yàn)榇伺囵B(yǎng)基使得愈合組織能長(zhǎng)期持續(xù)、還使得細(xì)胞懸浮能容易地建立并且原花青素生產(chǎn)力能夠維持。實(shí)施例3.大花可可樹和可可屬obovatum愈合組織的誘導(dǎo)與增殖使用如實(shí)施例1和2中所述可可屬可可所用的那些方法建立大花可可樹和可可屬 obovatum的愈合組織培養(yǎng)。實(shí)施例4.懸浮的起始通過(guò)接種自實(shí)施例1中所述的花卉外植體獲得的白色新鮮愈合組織于125ml Erlenmeyer燒瓶(含有25ml 二十種不同液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基IV-XXIII ；表1)，建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。以硅泡沫帽蓋住燒瓶，并在恒溫控制的房間內(nèi)、在M±rc、完全黑暗的條件下以120rpm攪動(dòng)加旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)M天。如認(rèn)為必要，每周或每?jī)芍苻D(zhuǎn)移分培。保留形成為粒狀或細(xì)胞細(xì)小懸浮的培養(yǎng)物，而丟棄不形成懸浮培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。在14天細(xì)胞生長(zhǎng)之后，轉(zhuǎn)移10% (ν/ν)細(xì)胞于含有25ml新鮮培養(yǎng)基的新125ml燒瓶并此后每?jī)芍芊峙嘁淮?。培養(yǎng)基VIII顯示在懸浮細(xì)胞起始中對(duì)于細(xì)胞繁殖有最佳性能(在第14天達(dá)45% PCV)。為培養(yǎng)非花(營(yíng)養(yǎng))組織(節(jié)點(diǎn)、節(jié)間、年輕葉、成熟葉)，以類似于上述用于花卉外植體的方式轉(zhuǎn)移實(shí)施例2中生成的愈合組織于液體培養(yǎng)基。所用培養(yǎng)基是培養(yǎng)基XXIV， 就鹽類型而言，該培養(yǎng)基與常規(guī)維持培養(yǎng)基VIII不同(MS鹽，而非DKW鹽，含有更多銨和氮源及更少硫酸鹽)，并且包括ang/L IAA和％ig/L IBA作為代替2，4-D的生長(zhǎng)素(表1)。在此培養(yǎng)基中，建立懸浮培養(yǎng)更快，并且愈合組織在七天內(nèi)消耗了培養(yǎng)基中的所有糖，而對(duì)于培養(yǎng)基VIII中起始的愈合組織則通常要用2到3周來(lái)消耗全部碳水化合物源。這些建立的非花組織懸浮的原花青素生產(chǎn)力也比得自花卉組織懸浮的生產(chǎn)力高(1. 1克總原花青素 /升培養(yǎng)物)(圖IOA和10B)。實(shí)施例5.懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)此實(shí)施例描述用于增加懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)力增長(zhǎng)是細(xì)胞生長(zhǎng)速率和細(xì)胞生長(zhǎng)停止時(shí)的密度的作用。為了確定最適接種密度，以開始細(xì)胞密度的10%、15%和20% (ν/ν)起始可可屬可可細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)并使其生長(zhǎng)14天。圖2顯示接種密度起作用下的生物量密度的典型時(shí)程。以細(xì)胞密度的10%起始的培養(yǎng)物顯示出生長(zhǎng)的顯著滯后，并且在14天內(nèi)未達(dá)到最大密度。在培養(yǎng)基 VIII中以細(xì)胞密度的15%和20%起始的培養(yǎng)物在13天內(nèi)密度翻倍并且在14天內(nèi)達(dá)到最大平均細(xì)胞密度40-43%。然而，在細(xì)胞選擇過(guò)程之后，在第14天某些培養(yǎng)物顯示出超過(guò) 50% -60%的細(xì)胞壓積(PCV)。除了培養(yǎng)基VIII不含有Wiytagel以外，培養(yǎng)基VIII和培養(yǎng)基I是相同的處方。 這兩種培養(yǎng)基均以DKW鹽和維生素為基礎(chǔ)，使用能導(dǎo)致培養(yǎng)基成分的批次間差異的幾個(gè)儲(chǔ)存液配制而成。因而，使用預(yù)混合的DKW基礎(chǔ)鹽(Phytotechnology Laboratories, LLC,目錄#0190)創(chuàng)建培養(yǎng)基XXXII并且比較了培養(yǎng)基VIII和XXXII之間的懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)。在任一培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)均沒(méi)有顯著差異。因此，日常使用培養(yǎng)基XXXII來(lái)維持懸浮培養(yǎng)物。
以大花可可樹和可可屬obovatum完成了類似研究。細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)力增長(zhǎng)是細(xì)胞生長(zhǎng)速率和細(xì)胞生長(zhǎng)停止時(shí)的密度的作用。為了確定最適接種密度，以開始細(xì)胞密度的 10%、15%和20% (ν/ν)起始大花可可樹和可可屬obovatum細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)并使其生長(zhǎng) 14天。一般來(lái)講，以更高密度起始的培養(yǎng)物具有更短的生長(zhǎng)期或更早地到達(dá)最大細(xì)胞密度。以細(xì)胞密度的10%起始的培養(yǎng)物顯示出生長(zhǎng)的顯著滯后，并且在14天內(nèi)未達(dá)到最大密度。以細(xì)胞密度的15%和20%起始的培養(yǎng)物在13天內(nèi)密度翻倍并且在14天內(nèi)達(dá)到最大平均細(xì)胞密度為40-43%。此生長(zhǎng)率比之前所報(bào)道的其他植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物(如紅豆杉(Taxus sp))生長(zhǎng)率更低。然而，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化生長(zhǎng)培養(yǎng)基和如下面實(shí)施例6所述的嚴(yán)格細(xì)胞選擇，可以提高可可屬細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞生長(zhǎng)。實(shí)施例6.自營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物創(chuàng)建同種細(xì)胞系的細(xì)胞選擇過(guò)程新創(chuàng)建的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物一般是異質(zhì)性的細(xì)胞混合物。此異質(zhì)性導(dǎo)致了大規(guī)模懸浮培養(yǎng)物中不平衡的細(xì)胞生長(zhǎng)和所需代謝物的不穩(wěn)定生產(chǎn)模式。通過(guò)分培和選擇具有所需特征的培養(yǎng)物，可以從這些異質(zhì)性混合物中衍生適用于大規(guī)模生產(chǎn)的同種細(xì)胞培養(yǎng)物。 發(fā)展選擇性的和快速的篩選檢測(cè)多酚和細(xì)胞生長(zhǎng)以輔助此過(guò)程。使用實(shí)施例8所述的丁醇-鹽酸水解法來(lái)監(jiān)控多酚累積，并且使用細(xì)胞壓積(PCV(% )=細(xì)胞體積X 100/總培養(yǎng)物體積)作為生物量的衡量。通過(guò)折射率(BriX% )測(cè)定碳水化合物消耗速率作為細(xì)胞代謝的衡量。如實(shí)施例2和4所述從愈合組織中得到營(yíng)養(yǎng)組織(節(jié)點(diǎn))衍生的懸浮培養(yǎng)物。 選擇一個(gè)生長(zhǎng)很好的細(xì)胞系(MX1440-3496)并在三種不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，三種培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型(DKW鹽對(duì)MS培養(yǎng)基)和激素類型和數(shù)量(表1中的培養(yǎng)基XXXII、 XXXIII和XXXIV)上不同。培養(yǎng)基XXXIII和培養(yǎng)基XXXIV中的細(xì)胞壓積(PCV)在第七天時(shí)只有33. 7士4. 7%和25. 7士4.0%，比培養(yǎng)基XXXIII 6士6. 6% )顯示生長(zhǎng)更慢。細(xì)胞生長(zhǎng)率對(duì)于最大化細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的體積生產(chǎn)力非常重要。在以所費(fèi)培養(yǎng)基的折射率 (RI)所測(cè)定的碳水化合物消耗率上培養(yǎng)基XXXIII也是更好的。因此，選擇此培養(yǎng)基作為 MX1440-3496細(xì)胞系進(jìn)一步細(xì)胞選擇過(guò)程的維持培養(yǎng)基。在每次分培時(shí)，優(yōu)選非塊狀或不形成聚集體的生長(zhǎng)良好的、細(xì)小細(xì)胞以提高體積生產(chǎn)力并消除聚集細(xì)胞，因?yàn)檫x擇大的或塊狀的細(xì)胞聚集物導(dǎo)致糟糕的培養(yǎng)性能。因此， 所選細(xì)胞主要是黃色細(xì)小細(xì)胞的形態(tài)，而且細(xì)小懸浮培養(yǎng)物導(dǎo)致同種懸浮培養(yǎng)的更好的生長(zhǎng)和生產(chǎn)。MX1440-3496細(xì)胞系開始以超過(guò)10天的倍增時(shí)間生長(zhǎng)，而在進(jìn)行細(xì)胞選擇過(guò)程后倍增時(shí)間顯示為降低到5天(圖幻。在細(xì)胞選擇過(guò)程之前總原花青素生產(chǎn)水平開始是 0. 5g/L PCV，但隨著細(xì)胞選擇過(guò)程進(jìn)行增加了 8. 9倍(4. 7g/LPCV)(圖4)。實(shí)施例7.自可可屬愈合組織培養(yǎng)物和懸浮培養(yǎng)物中抽提多酚此實(shí)施例描述發(fā)展用于自實(shí)施例1-4中發(fā)展的可可屬培養(yǎng)物的愈合組織和懸浮細(xì)胞中抽提多酚的方法。此實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)特別使用可可屬可可的培養(yǎng)物。用包含0.1% H2SO4W 1.5ml 50% (ν/ν)乙醇從大約0. 25士0. 04g濕重的愈合組織中、及用包含0. 1 % H2SO4的1.5ml 80% (ν/ν)甲醇從0· 1 士0. 003g干重的懸浮細(xì)胞(無(wú)上清培養(yǎng)基)中抽提多酚。將細(xì)胞放置于離心管(2. Oml)中并以珠磨勻漿器勻質(zhì)化1分鐘。以3500rpm離心勻漿20分鐘并只移動(dòng)上清到另一離心管中。
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當(dāng)需要篩選大量的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，使用如下的更強(qiáng)大的高通量方法從待分析的每燒瓶細(xì)胞培養(yǎng)物中，取Iml分裝至96-深孔平板。在轉(zhuǎn)移至96-深孔平板之前，也記錄樣本的細(xì)胞壓積(PCV)。在臺(tái)式離心機(jī)中以6000rpm離心平板4分鐘來(lái)沉淀每孔中的細(xì)胞。以塑料移液管從每孔中去除并丟棄上清。接著，向每孔中加入0.5ml抽提溶劑(80 20 甲醇水)和鎢硬質(zhì)合金珠，并將平板放置在混磨機(jī)上以在15Hz下碾磨細(xì)胞2分鐘。然后轉(zhuǎn)移平板到離心機(jī)并通過(guò)6000rpm離心4分鐘沉淀細(xì)胞碎片。實(shí)施例8.培養(yǎng)物中多酚生產(chǎn)的初步分析用于進(jìn)行原花青素分析反應(yīng)的方法被設(shè)計(jì)為與最初的Swain和Hillis的方法 (J. SCI. Food Agric. 10 :63，1959)和Porter 等的方法(Phytochemistry，25 (1) 223,1986) 相當(dāng)接近。丁醇-鹽酸抽提分析被用于測(cè)定可可屬可可懸浮細(xì)胞抽提物中的多酚。通過(guò)合并0. Iml甲醇水溶液抽提物和1. Oml 丁醇-鹽酸試劑(95 5v/v)、并在Qiagen深孔加熱模塊^!iagen deep well block，Valencia，加利福尼亞，美國(guó))上于75°C加熱溶液60分鐘，將多酚水解成(-)_表兒茶酸和兒茶酸單體。在水解樣本中兒茶酸的存在可以通過(guò)形成粉紅色觀察到。確定了 280nm和520nm處的吸收值，并基于用不同濃度原花青素B2(購(gòu)自 Chromadex, Inc.，歐文，加利福尼亞)創(chuàng)建的校準(zhǔn)曲線得到的兒茶酸量計(jì)算了原花青素含量。更亮的粉色指示懸浮培養(yǎng)物中更高濃度的原花青素(圖幻。基于此方法幾個(gè)懸浮培養(yǎng)物的原花青素含量從250mg/L到1000mg/L不等。實(shí)施例9.自可可屬可可細(xì)胞得來(lái)的多酚的分析來(lái)自實(shí)施例7的甲醇水溶液抽提物經(jīng)由0. 45 μ M微孔過(guò)濾器過(guò)濾，并且注射IOOul 樣本用于LC-MS分析。使用對(duì)稱C18柱(100X2. Imm內(nèi)徑，3.5 μ m) (Phenomenex，托倫斯， 加利福尼亞，美國(guó))。用Waters(Milford，馬薩諸塞州，美國(guó))Alliance HPLC系統(tǒng)完成LC 分析，該系統(tǒng)裝備有CTC分析PAL自動(dòng)上樣儀(CTC Analytics PAL auto sampler, Leap Technologies,卡波羅，北卡羅來(lái)納州，美國(guó))、帶有600S控制器的Waters 626泵以及可從 190nm到780nm掃描的Waters 2996光電二極管陣列檢測(cè)器(PDA)。使用MassLinxTM做數(shù)據(jù)分析。用水-0.1%甲酸(溶劑A)和乙腈-0.1%甲酸(溶劑B)以恒定流速OJml mirT1 進(jìn)行梯度洗脫。使用具有下列溶劑B比例的線性梯度參數(shù)(時(shí)間(分鐘)，%B) (0,7), (5，15)、(20，75) “25，100)、(35，100)、(35. 1,7) (45，7)。在 ^Onm 處監(jiān)測(cè)化合物(+)-兒茶酸、(-)-表兒茶酸、咖啡因、可可堿和原花青素(二聚體到六聚體)。使用Waters Quattro ■三重四極桿質(zhì)iHi^i貝Ij器(Waters Quattro Micro trip 1 e-quadrupo 1 e mass detector, Milford，馬薩諸塞州，美國(guó))獲得MS數(shù)據(jù)。對(duì)于愈合組織用從m/z 150到1200掃描的參數(shù)模式，而對(duì)于懸浮細(xì)胞用從m/z 150到1800掃描的參數(shù)模式完成全掃描數(shù)據(jù)的獲取。兒茶酸、表兒茶酸、可可堿和咖啡因的可靠標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Chromadex. ^ic (歐文，加利福尼亞)，并且每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)在甲醇水溶液中的合適稀釋也進(jìn)行與自懸浮細(xì)胞的抽提物同樣的LC-MS分析(圖 6A 至Ij 6C) ο確定單獨(dú)脫脂的可可屬可可種子中主要的黃酮類可可堿和咖啡因的水平分別為 25. 2mg/g干重和4. 6mg/g干重。相比之下，可可屬可可懸浮細(xì)胞未生產(chǎn)可測(cè)量的咖啡因或可可堿(圖6E和6F)，而它們能生產(chǎn)水平可與種子相媲美的兒茶酸和表兒茶酸(圖6D)。這些結(jié)果顯示植物細(xì)胞培養(yǎng)物能生產(chǎn)高濃度的相關(guān)化合物而少有不想要化合物的污染。實(shí)施例10.花卉衍生細(xì)胞懸浮的細(xì)胞選擇和培養(yǎng)基優(yōu)化過(guò)程
每七天培養(yǎng)測(cè)定一次生物量增加、糖消耗及原花青素生產(chǎn)力。這些數(shù)據(jù)對(duì)于所需細(xì)胞選擇過(guò)程非常重要?；赑CV和糖消耗測(cè)定優(yōu)選生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，并且隨后基于原花青素生產(chǎn)量從生長(zhǎng)良好的細(xì)胞系中挑選生產(chǎn)良好的細(xì)胞系。更高生物量和更高原花青素生產(chǎn)量能增加批次循環(huán)中的生產(chǎn)力。在細(xì)胞選擇過(guò)程之前平均原花青素生產(chǎn)力為52mg原花青素每升培養(yǎng)物，在一年細(xì)胞選擇過(guò)程之后其提高至251mg/L的水平，并且得到的最高水平為1600mg原花青素每升培養(yǎng)物(圖10C)。最高生產(chǎn)量也增加至超過(guò)5000mg/L PCV (圖 10D)。用B5主要鹽和MS少量鹽生成培養(yǎng)基XXV，從而相比于通常的維持培養(yǎng)基培養(yǎng)基 VIII降低了培養(yǎng)基中銨離子的濃度。碳水化合物源為60g/L蔗糖，且激素為0. lmg/L NAA 和0. ang/L激動(dòng)素(相比ang/L 2，4-D和0. 005mg/L TDZ)。在兩周的時(shí)間后，在培養(yǎng)基XXV 中檢驗(yàn)懸浮顯示無(wú)生長(zhǎng)，但是懸浮中積累的原花青素達(dá)到對(duì)照培養(yǎng)基VIII中的大于四倍的水平(用培養(yǎng)基XXV大于95mg/L，相比于用培養(yǎng)基VIII為22mg/L)。這可能由于在此培養(yǎng)基中的硝酸鹽/銨離子的比例較高、加上與生長(zhǎng)素相比過(guò)剩的細(xì)胞分裂素所造成。用MS鹽、30g/L蔗糖及1.5mg/L 2，4_D生成培養(yǎng)基XXVI。轉(zhuǎn)移至此培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)物顯示出原花青素累積更高，在第13天達(dá)到比培養(yǎng)基VIII中大于四倍的水平(用培養(yǎng)基XXVI 87mg/L，相比于用培養(yǎng)基VIII為22mg/L)。盡管在兩種培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)類似(在培養(yǎng)基VIII中為從22% PCV IlJ 61% PCV，相比于在培養(yǎng)基XXVI為60% PCV M 25% PCV)，糖消耗不同，顯示了細(xì)胞會(huì)優(yōu)選葡萄糖作為碳水化合物源(圖10E)。實(shí)施例11.葡萄糖添加用于生產(chǎn)力增強(qiáng)此實(shí)施例描述通過(guò)補(bǔ)充添加葡萄糖以增強(qiáng)可可懸浮培養(yǎng)物的原花青素生產(chǎn)力的方法的發(fā)展。通過(guò)改變培養(yǎng)基從生長(zhǎng)培養(yǎng)基到生產(chǎn)培養(yǎng)基誘導(dǎo)植物次級(jí)代謝物的生產(chǎn)。對(duì)于生產(chǎn)培養(yǎng)基優(yōu)化，可以認(rèn)為或者碳水化合物源或者氮源是關(guān)鍵因素。為了增強(qiáng)自花卉及營(yíng)養(yǎng)組織衍生的懸浮培養(yǎng)物的原花青素生產(chǎn)，在指數(shù)生長(zhǎng)階段末期使用葡萄糖形式的額外碳水化合物。通過(guò)葡萄糖添加，自花卉組織衍生懸浮細(xì)胞系(MX1241-58)中獲得了原花青素生產(chǎn)力的顯著改進(jìn)。在如實(shí)施例5所述的正常培養(yǎng)條件下在培養(yǎng)基XXXII中正常維持培養(yǎng)物七天。在第7天添加葡萄糖之前，從MX1241-58細(xì)胞培養(yǎng)物中取樣，并且其平均PCV和RI為 49. 5士3. 5%和0. 2。平均原花青素生產(chǎn)水平為189. 5士 17. 7mg/L PCV。在第7天，加入5ml 50%葡萄糖儲(chǔ)存液至懸浮培養(yǎng)物中以調(diào)節(jié)RI至大于3%，并且隨后當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度低于0.5%時(shí)重復(fù)此步驟。在添加葡萄糖之后，用手劇烈搖晃燒瓶中的培養(yǎng)物大約10秒鐘以分散懸浮中集中的葡萄糖，并且再次測(cè)定RI，平均RI為3。在不同培養(yǎng)天數(shù)(在第7、11、 16和21天)時(shí)加入3-4次葡萄糖及一次新鮮培養(yǎng)基(第25天)，原花青素生產(chǎn)水平增加到高達(dá)4. 4g/L PCV，比其起始值高24倍，并且PCV從49. 5士3. 5%增加至69. 0士 1. 4%。應(yīng)用類似的處理至(實(shí)施例6中所述)細(xì)胞系MX1440-3496以改善其生產(chǎn)水平。 設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)細(xì)胞系對(duì)于葡萄糖添加的響應(yīng)。在實(shí)施例6中所述的培養(yǎng)基XXXIII中維持MX1440-4496細(xì)胞系。在第6天，隨機(jī)挑選了 6個(gè)燒瓶的MX1440-3496細(xì)胞系，并將其分為兩組，每組為三瓶。一組三個(gè)燒瓶以50%葡萄糖儲(chǔ)存液處理而另外三個(gè)燒瓶不做處理。 在第6天加入葡萄糖之前測(cè)定所有六個(gè)燒瓶，平均值為，PCV為45%，RI為0. 3 士0. 1且原
21花青素生產(chǎn)PCV為2.41 士0. 19g/L。加入5mL 50%葡萄糖儲(chǔ)存液至三個(gè)處理燒瓶。在葡萄糖添加后處理燒瓶的平均RI增加至6. 0 士 1. 1，并且平均PCV為39. 7 士 0. 6%。在葡萄糖添加之后第1、3、4、5和6天，從所有燒瓶中取樣并測(cè)定它們的PCV、RI和原花青素生產(chǎn)。未處理的燒瓶顯示RI無(wú)顯著變化，而PCV從45%輕微增加至53士3. 6%。 其生產(chǎn)在處理后第6天停留在2.83士 1. 17g/L PCV。相反，處理的燒瓶顯示PCV穩(wěn)步增長(zhǎng)， 在第6天增加至53士2.7%。RI以每天0.6至0.8單位RI的速率顯著降低，從第0天的 6士 1. 1到達(dá)第6天的2.0士 1.3。與此同時(shí)，其生產(chǎn)也從加入葡萄糖之前的2.42士 1.93g/L PCV增加到第5天的12. 93士2. Mg/L PCV。葡萄糖處理導(dǎo)致原花青素生產(chǎn)的增長(zhǎng)，并且如圖7所示這些生產(chǎn)特征代表用于原花青素生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的顯著改進(jìn)。實(shí)施例12.可可懸浮培養(yǎng)的放大在使用植物細(xì)胞培養(yǎng)中的普遍問(wèn)題是獲得靶標(biāo)產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)(Kim等， Biotechnol Prog. 20(6) 1666,2004)。因此，成功的大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵在于維持穩(wěn)定生產(chǎn)力。成功進(jìn)行了可可細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮從125ml燒瓶到500ml燒瓶的放大過(guò)程，因?yàn)樵诜糯髼l件下可可細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)均非常一致和穩(wěn)定。所選細(xì)胞系的七天平均PCV為45
，是起初PCV水平20%的大約2. 5倍。在黑暗條件下、在回旋振蕩器上、以IOOrpm在維持培養(yǎng)基培養(yǎng)基VIII中生長(zhǎng)更大規(guī)模的燒瓶培養(yǎng)物。每培養(yǎng)七天測(cè)定一次生物量、培養(yǎng)基中糖消耗及原花青素生產(chǎn)力。接種2. 7L可可細(xì)胞至6. 5L生物反應(yīng)器(工作體積=5. 0L)中，并在0. 2vvm(每體積培養(yǎng)物每分鐘的氣體體積)的氣體流速下、在IOOrpm攪動(dòng)速度和23°C容器溫度下培養(yǎng)七天。生物量增長(zhǎng)非常緩慢，并且延遲期長(zhǎng)達(dá)四天。對(duì)細(xì)胞來(lái)講大接種體積是個(gè)問(wèn)題，因?yàn)檫@會(huì)限制養(yǎng)分供應(yīng)而且還使得細(xì)胞的均勻混合變得困難。理想的起始接種體積應(yīng)在25% 和40% PCV之間。影響生物量濃度和特定生產(chǎn)力的一個(gè)重要因素是溶解氧(DO)濃度和溶解氣體代謝物如 CO2 的氣體交換(Dicosmo & Misawa，“Plant Cell Culture Secondary Metabolism", 1996，pp44)。在燒瓶培養(yǎng)物中，不可能控制溶解氧和氣體代謝物，但是在反應(yīng)器培養(yǎng)物中控制溶解氧和氣體代謝物是可行的。在此實(shí)施例中，DO水平逐漸降低，這是細(xì)胞代謝的好指示物。實(shí)施例13.自懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中的大規(guī)模分離自IOL可可懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中重獲的凍干生物量與80%甲醇以生物量體積的 1 1的比例混合，并且在室溫下攪拌1小時(shí)。真空條件下、在布氏漏斗中將其經(jīng)過(guò)濾紙過(guò)濾。至少重復(fù)抽提三次。收集每次的甲醇抽提物，集合并在40°C、減壓下濃縮以減少甲醇抽提物的體積到最初的30%。將濃縮甲醇抽提物加至二氯甲烷中做液-液抽提并收集、集合二氯甲烷層抽提物，并且在室溫、減壓下以25%的比例濃縮。溶解干燥的抽提物于甲醇中， 逐滴加入去離子水，并且在0°C放兩天以獲得沉淀物。自干燥細(xì)胞得到的預(yù)先純化原花青素的實(shí)際產(chǎn)量在10 20%之間，具有50 60%的純度。為有效去除雜質(zhì)，通過(guò)使用C18和硅膠柱的Waters pr印-LC(Milford，馬薩諸塞州，美國(guó))完成了進(jìn)一步純化，并且在Pr印-LC純化過(guò)程后純度會(huì)增加至超過(guò)99%。為了得到高純度的原花青素靶標(biāo)化合物，使用附加的結(jié)晶過(guò)程。實(shí)施例14.自可可屬可可細(xì)胞培養(yǎng)物和可可豆中生產(chǎn)的多酚和原花青素的比較。自懸浮培養(yǎng)物中抽提粗原花青素
用Labconco凍干機(jī)凍干自IL可可屬可可懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物重獲的生物量以得到 14. Og干可可細(xì)胞。用250mL混合的丙酮水溶液(70% ν/ν)抽提干粉30分鐘。以3500rpm 離心水溶液15分鐘并移出上清。再次以同樣方式抽提固體殘留物。兩次抽提得到的上清被合并到一起，并且隨后在部分真空下、在40°C、以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)。在_20°C冷凍濃縮的水化殘留物并以Laboconco凍干機(jī)干燥以得到厚的黃色粗抽提物。通過(guò)實(shí)施例8所述的酸丁醇水解法確定自細(xì)胞干重得到的粗原花青素產(chǎn)量，并且該產(chǎn)量在10-15%之間。自未發(fā)酵生可可豆抽提粗原花青素未發(fā)酵生可可豆得自Raw Harmony (洛杉磯，加利福尼亞)。從5g磨碎的干的未發(fā)酵豆或磨碎、脫脂的未發(fā)酵可可豆中抽提粗原花青素。抽提與上述用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟類似，除了在每個(gè)抽提步驟中使用50mL丙酮水溶液(70% ν/ν)，并且重復(fù)抽提三次。 以3500rpm離心合并的抽提物15分鐘。輕輕倒出上清并隨后在部分真空中、在40°C下蒸發(fā)以去除溶劑。在-20°C冷凍濃縮的水化殘留物并用Laboconco凍干機(jī)干燥以得到紫紅色的粗提取物。通過(guò)實(shí)施例8中所述的酸丁醇水解分析估計(jì)的粗原花青素產(chǎn)量在10-13%之間。原花青素的高效液相色譜(HPLC)分析以正相HPLC系統(tǒng)完成原花青素的HPLC分析，該系統(tǒng)由Waters 2795分離模士夬、Waters 996 PDA檢測(cè)儀和Waters 474掃描熒光檢測(cè)儀組成。用Develosil Diol柱 050x4. 6mm內(nèi)徑，5 μ粒徑，改編自Kelm等(美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?007075020)，其描述了質(zhì)子極性單體和/或寡聚體的改進(jìn)過(guò)程)獲得可可屬可可細(xì)胞抽提物和生可可豆抽提物中的原花青素鑒定和分離的條件。。二元流動(dòng)相由溶劑(A)、乙腈冰醋酸(98 2，ν/ν)和溶劑 (B)、甲醇水冰醋酸(95 3 2，ν/ν/ν)組成。在30°C下以0.8mL/min流速完成下列線性梯度洗脫:0-35分鐘，100-60% A ；35-40分鐘，60% A ；40-45分鐘，60-100% A。通過(guò)熒光檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)在276nm，發(fā)射波長(zhǎng)在316nm)、280nm處的紫外檢測(cè)監(jiān)測(cè)原花青素的分離(Lazarus 等，J. Agric. Food Chem. 47 :3693,1999)。圖8顯示通過(guò)熒光檢測(cè)儀測(cè)定的未發(fā)酵可可豆抽提物(圖8A)和可可屬可可細(xì)胞懸浮抽提物(圖8B)的層析圖。按照Kelm等(美國(guó)專利號(hào)2007075020)所述的層析分離， 未發(fā)酵可可豆抽提物由多至十二聚體(聚合度=12)組成。本實(shí)施例證實(shí)了來(lái)自可可屬可可細(xì)胞培養(yǎng)物的原花青素抽提物也具有與豆中所報(bào)道的同樣的屬性。圖9顯示未發(fā)酵可可豆抽提物(圖9A)和可可屬可可細(xì)胞培養(yǎng)物抽提物(圖9B)的紫外吸收層析圖。此檢測(cè)模式使得咖啡因和可可堿能被檢測(cè)，并且此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)豆中的抽提物顯示抽提物中有這兩種化合物存在時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)物的抽提物中未檢測(cè)到這兩種化合物。因此，此實(shí)施例顯示了可可屬可可的細(xì)胞培養(yǎng)物能生產(chǎn)與可可豆相同的原花青素，而不生產(chǎn)不所需的化合物咖啡因和可可堿。而且，在此所述的用于細(xì)胞培養(yǎng)物的抽提步驟不需要使用如(可可豆脫脂所需的)正己烷的溶劑。因此，得自可可屬可可細(xì)胞培養(yǎng)物的原花青素抽提物不會(huì)有有毒溶劑如正己烷的殘留。實(shí)施例15.自可可細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物得到的原花青素抽提物的抗氧化活性。此實(shí)施例描述了檢驗(yàn)自通過(guò)上述實(shí)施例所述方法培養(yǎng)的可可細(xì)胞中抽提的原花青素的抗氧化活性的方法。文獻(xiàn)中的證據(jù)說(shuō)明可可原花青素的促進(jìn)健康的性質(zhì)和這些化合物抗氧化性質(zhì)之間的關(guān)系。通常人們相信，這些抗氧化物影響某些類型的腫瘤進(jìn)展以及心血管疾病中的LDL 氧化中涉及的氧化和自由基過(guò)程。因此，測(cè)定可可原花青素的抗氧化潛力成為確定這些化合物在預(yù)防人類疾病(如癌癥和心臟病)中的有效性的合理方法，以使得這些化合物能被用在具有健康促進(jìn)性質(zhì)的組合物中。類似地，人們相信，抗氧化物能幫助維持具有更少皺紋的年輕皮膚，并且因此可可原花青素能被用于化妝品組合物。通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的若干步驟測(cè)定多酚類化合物(如可可原花青素)的抗氧化能力。最常用的方法是氧自由基吸收能力(ORAC)法(Cao G，Alessio H，Cutler R(1993). “Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants"Free Radic Biol Med 14(3) :303_11)。分析測(cè)定了熒光分子(β _藻紅蛋白或熒光素)在與自由基發(fā)生器如偶氮引發(fā)物化合物混合后的氧化降解。偶氮引發(fā)物被認(rèn)為可以通過(guò)加熱生產(chǎn)過(guò)氧自由基，其損害了熒光分子，導(dǎo)致熒光的丟失?？寡趸锬軌虮Ｗo(hù)熒光分子不被氧化變性。保護(hù)程度可以使用熒光計(jì)定量?，F(xiàn)今作為熒光探針用得最多的是熒光素。在市場(chǎng)上可以購(gòu)得能夠自動(dòng)測(cè)量和計(jì)算能力的裝置(Biotek，Roche Diagnostics) 0隨著氧化變性的進(jìn)行熒光強(qiáng)度降低，并且通常在加入偶氮引發(fā)物(自由基發(fā)生器)之后記錄此熒光強(qiáng)度35分鐘。以熒光延遲為熒光素的變性(或分解)的測(cè)定指標(biāo)，其在抗氧化物存在時(shí)變得不那么明顯。記錄(熒光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間)衰減曲線并計(jì)算兩條衰減曲線(有抗氧化物或無(wú)抗氧化物)之間的面積。隨后，用抗氧化物troloX(維生素E類似物) 作為標(biāo)準(zhǔn)，定量抗氧化物介導(dǎo)的保護(hù)的程度。用不同濃度trolox制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且將檢驗(yàn)樣本與之相比。檢驗(yàn)樣本(食品)的結(jié)果報(bào)告為“trolox等價(jià)物”或TE。表1.培養(yǎng)基I-XXXIV的組成(表2提供了儲(chǔ)存液的配方)
權(quán)利要求
1.一種制備可可寡聚體原花青素的方法，包括在足以導(dǎo)致可可寡聚體原花青素的生產(chǎn)的時(shí)間和條件下、在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)可可屬sp. Theobroma sp.細(xì)胞，并且自細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中生產(chǎn)含可可寡聚體原花青素的抽提物，從而制備可可寡聚體原花青素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該方法包括在足以導(dǎo)致可可寡聚體原花青素的生產(chǎn)的時(shí)間和條件下、在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)可可屬可可iTheobroma cacao細(xì)胞，并且自細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中收獲可可寡聚體原花青素，其中收獲的可可寡聚體原花青素基本上不含黃嘌呤生物堿。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中產(chǎn)生的可可寡聚體原花青素制備物不含有可檢測(cè)的咖啡因和可可堿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)下列步驟生產(chǎn)可可屬可可細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物 在固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)來(lái)自非成熟可可屬可可花卉外植體的愈合組織；自可可屬可可愈合組織培養(yǎng)物中選擇快速生長(zhǎng)細(xì)胞系；并且通過(guò)接種快速生長(zhǎng)細(xì)胞系于液體培養(yǎng)基來(lái)起始細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)下列步驟生產(chǎn)可可屬可可細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物 在固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)來(lái)自可可屬可可節(jié)點(diǎn)、節(jié)間、分生組織或莖組織的愈合組織；自可可屬可可愈合組織培養(yǎng)物中選擇快速生長(zhǎng)細(xì)胞系；并且通過(guò)接種快速生長(zhǎng)細(xì)胞系于液體培養(yǎng)基來(lái)起始細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中可可寡聚體原花青素的生產(chǎn)包括收獲細(xì)胞；在合適溶劑中勻質(zhì)化細(xì)胞生物量以抽提富集多酚部分；用溶劑-溶劑抽提和/或?qū)游龇蛛x富集原花青素部分；及可選地干燥或濃縮原花青素部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中收獲細(xì)胞包括離心、過(guò)濾或其組合。
8.通過(guò)權(quán)利要求1所述方法生產(chǎn)的基本上無(wú)黃嘌呤生物堿的可可多酚制備物。
9.一種生產(chǎn)可可細(xì)胞的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的方法，包括在固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)來(lái)自非成熟可可屬可可花卉外植體或來(lái)自可可屬可可節(jié)點(diǎn)、節(jié)間、分生組織或莖組織的愈合組織；自可可屬可可愈合組織培養(yǎng)物中選擇快速生長(zhǎng)細(xì)胞系；及通過(guò)接種快速生長(zhǎng)細(xì)胞系于液體培養(yǎng)基來(lái)起始細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中非成熟可可屬可可花卉外植體選自退化雄蕊、萼片和花瓣基部外植體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，還包括在燒瓶、任何合適的培養(yǎng)容器或生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中在容器或生物反應(yīng)器中、并以分批、分批補(bǔ)料或連續(xù)的模式實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)。
13.通過(guò)權(quán)利要求9所述方法生產(chǎn)的可可屬可可細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，使用表1中所列出的液體培養(yǎng)基XXXII或XXXIII。
15.一種可可多酚制備物，包括可可多酚混合物，并基本上不含咖啡因和可可堿，該制備物自可可屬可可細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中抽提。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備物，其不用正己烷抽提。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備物，其中自可可屬可可細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中抽提包括 收獲細(xì)胞；在合適溶劑中勻質(zhì)化細(xì)胞生物量以抽提富集多酚部分； 用溶劑-溶劑抽提和/或?qū)游龇蛛x富集原花青素部分；及可選地干燥或濃縮原花青素部分。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中收獲細(xì)胞包括離心、過(guò)濾或其組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備物，用于膳食組合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備物，用于治療組合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備物，用于獸醫(yī)組合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備物，用于化妝品組合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備物，其中可可多酚包括兒茶酸、表兒茶酸和其原花青素寡聚體。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的制備物，其中寡聚體是二聚體至十二聚體。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的制備物，其中寡聚體包括二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、 六聚體、七聚體、八聚體、九聚體或其任意兩個(gè)或更多個(gè)的混合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備物，其中可可多酚是可可原花青素。
27.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備物，其是液體形式、干燥形式或粉末形式。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，使用表1所列出的液體培養(yǎng)基XXXII或XXXIII。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括在指數(shù)生長(zhǎng)期末期加入補(bǔ)充的葡萄糖至懸浮培養(yǎng)物中，從而增強(qiáng)原花青素生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明提供制備可可多酚制備物的方法，該方法包括從細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中收獲可可多酚，例如，原花青素。在這些方法的實(shí)施例中，產(chǎn)生的可可多酚制備物基本上(或在某些情況下完全)不含可檢測(cè)的咖啡因和可可堿，并且更普遍的是基本上不含黃嘌呤生物堿。本發(fā)明還描述了生產(chǎn)可可細(xì)胞的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的方法，包括用于制備可可多酚和(更特定的)原花青素制備物的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。本發(fā)明還提供了由此制作的可可屬sp和Herrania sp細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物和可可多酚制備物，特別是無(wú)黃嘌呤生物堿的(或無(wú)咖啡因和/或可可堿的)可可多酚制備物。
文檔編號(hào)C12N5/04GK102414312SQ200980159092
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2009年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者D·R·瓦格納, F·勒雅爾, M·文卡特拉莫斯, S·拉爾, S-Y·尹 申請(qǐng)人:戴安娜植物科學(xué)有限公司