細胞體外培養(yǎng)裝置及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞體外培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種細胞體外培養(yǎng)裝置及培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞或組織的增殖、分化及生理功能的實現(xiàn)，與其所處的環(huán)境密切相關(guān)，這些環(huán)境因素可以是營養(yǎng)物質(zhì)、壓力、溫度、PH等中的一種或多種。人體內(nèi)有很多組織和細胞生存于動態(tài)載荷環(huán)境下，如軟骨細胞和肺細胞等，這些組織和細胞只有在適當(dāng)壓力條件下培養(yǎng)，才能正常增殖、分化，產(chǎn)生與體內(nèi)相同的生理功能。現(xiàn)有體外研宄表明:未在適當(dāng)壓力條件下體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細胞，細胞排列不規(guī)則，基質(zhì)產(chǎn)生少，且膠原纖維較細；同時動物研宄發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)制動會使關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生變性，特別對蛋白多糖的合成有影響。相反，一定的機械應(yīng)力刺激是維持軟骨細胞正常新陳代謝機能所必需的生長環(huán)境。
[0003]加壓培養(yǎng)技術(shù)是細胞培養(yǎng)的方法之一，通過不同手段對培養(yǎng)的組織或細胞施加一定的壓力載荷，以模擬其承受生理載荷的環(huán)境。常見的加壓培養(yǎng)技術(shù)有液壓培養(yǎng)技術(shù)、離心管培養(yǎng)技術(shù)和直接接觸壓縮培養(yǎng)技術(shù)等。液壓培養(yǎng)技術(shù)是將軟骨細胞或軟骨塊置于培養(yǎng)皿中，其中加滿完全培養(yǎng)液，去除培養(yǎng)皿上蓋換成壓力膜，排出皿內(nèi)空氣后用粘膠使壓力膜與皿貼緊，確保皿內(nèi)無殘留氣泡，然后將培養(yǎng)皿置于壓力室中，壓力室內(nèi)充滿蒸餾水，壓力和頻率由計算機控制下的壓力閥來調(diào)控。離心管培養(yǎng)技術(shù)則是將細胞及培養(yǎng)基置于離心管內(nèi)，通過離心力產(chǎn)生加壓，通過調(diào)控離心速度的快慢，來調(diào)節(jié)細胞承受重力大小，加壓強度不能靈活調(diào)整，離心過程中細胞的培養(yǎng)條件可能不穩(wěn)定。直接接觸壓縮培養(yǎng)技術(shù)中較有代表性的是flexcell公司的細胞力學(xué)培養(yǎng)產(chǎn)品，該系統(tǒng)基本原理(正氣壓交換模式):利用橡膠密封墊在細胞培養(yǎng)板基底膜與基座之間形成封閉腔，把此密封腔的進、出氣管插入二氧化碳培養(yǎng)箱里，把此密封腔放入二氧化碳培養(yǎng)箱，利用封閉腔正氣壓擠壓培養(yǎng)孔里的活塞，進而使活塞和固定臺之間的三維培養(yǎng)物間接受到壓力發(fā)生形變，通過計算機控制系統(tǒng)調(diào)節(jié)氣體的壓力來改變基底膜的形變量。目前幾種加壓培養(yǎng)方法中，利用液壓或氣壓加載方式，組織處于相對密閉的培養(yǎng)環(huán)境中，難以實現(xiàn)對細胞組織培養(yǎng)液的動態(tài)更新，需在實驗載荷間隙更換培養(yǎng)液。
[0004]軟骨是人或脊椎動物體內(nèi)的一種結(jié)締組織。骨關(guān)節(jié)炎可引起關(guān)節(jié)軟骨的破壞，其他原因也可導(dǎo)致軟骨缺損，軟骨破壞或缺損后，其自身很難再生修復(fù)，常用異體軟骨移植、假體替代和自身軟骨細胞移植等進行治療，但這些治療方法的效果不甚理想?？茖W(xué)家們正在研宄通過組織工程學(xué)對破壞或缺損的軟骨進行再生修復(fù)。組織工程學(xué)是指利用生物活性物質(zhì)，通過體外培養(yǎng)或構(gòu)建的方法，再造或者修復(fù)器官及組織的技術(shù)。組織工程化軟骨現(xiàn)已逐漸被認為是一種有希望治療全層軟骨缺損的手段。軟骨的組織工程是將關(guān)節(jié)軟骨酶解后，游離出原代軟骨細胞，或直接利用可向軟骨細胞分化的干細胞，種植于可降解吸收的聚合物上，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)等或天然載體如膠原纖維，經(jīng)離體三維培養(yǎng)一段時間后再移植到動物體內(nèi)，繼續(xù)生成新的軟骨。三維培養(yǎng)環(huán)境有利于軟骨細胞的增殖、分化、表型穩(wěn)定和基質(zhì)蛋白合成。
[0005]人體內(nèi)部分組織或細胞在不同部位需要不同的營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)對于細胞的增殖、分化、表型穩(wěn)定和基質(zhì)蛋白合成等也是非常重要的。以最具有代表性的軟骨組織為例來進行說明。軟骨是人或脊椎動物體內(nèi)的一種結(jié)締組織。關(guān)節(jié)軟骨組織呈分層結(jié)構(gòu)，靠近關(guān)節(jié)腔的部分為關(guān)節(jié)軟骨表層，靠近軟骨下骨的部分為關(guān)節(jié)軟骨深層，又稱為關(guān)節(jié)軟骨鈣化層。關(guān)節(jié)軟骨無血管、無淋巴管、無神經(jīng)，其營養(yǎng)來源有:①軟骨下骨組織的血管穿入鈣化層，供應(yīng)該層的營養(yǎng)；?軟骨周圍的滑膜血管與滑液進行營養(yǎng)交換；③滑膜分泌的滑液藉滲透作用進入軟骨，為關(guān)節(jié)軟骨表層提供營養(yǎng)。因此，關(guān)節(jié)軟骨表層與關(guān)節(jié)軟骨深層分別由不同營養(yǎng)來源的不同營養(yǎng)物質(zhì)提供營養(yǎng)。培養(yǎng)基在軟骨細胞三維培養(yǎng)中對細胞分化起著關(guān)鍵性作用。但現(xiàn)有研宄尚未對培養(yǎng)基的研宄給予足夠的重視。現(xiàn)有的軟骨組織或細胞培養(yǎng)中，未對軟骨組織進行結(jié)構(gòu)區(qū)分，僅使用一種培養(yǎng)基提供營養(yǎng)。目前尚未有使用兩種培養(yǎng)基對軟骨組織進行培養(yǎng)的報道，更未有可以同時使用兩種培養(yǎng)基對軟骨細胞進行三維立體體外培養(yǎng)的裝置。
[0006]當(dāng)在細胞外培養(yǎng)基質(zhì)中對軟骨細胞等細胞或組織進行三維立體體外培養(yǎng)時，模擬其所處的力學(xué)和/或營養(yǎng)環(huán)境即顯得尤為重要。建立一套能夠模擬體內(nèi)生理環(huán)境的體外培養(yǎng)裝置及方法，是進行軟骨細胞等細胞或組織相關(guān)基礎(chǔ)研宄的重要手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，有必要針對現(xiàn)有細胞培養(yǎng)中不能實現(xiàn)兩種不同培養(yǎng)液的分層動態(tài)灌注培養(yǎng)的問題，提供一種細胞體外培養(yǎng)裝置及培養(yǎng)方法。
[0008]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0009]細胞體外培養(yǎng)裝置，包括生物反應(yīng)器和雙培養(yǎng)液灌溉系統(tǒng)；
[0010]所述生物反應(yīng)器包含蓋板、中板、底板和雙重培養(yǎng)杯，所述蓋板對合放置在中板上，所述底板對合放置在中板下，所述中板設(shè)有中板方孔，所述方孔內(nèi)放置雙重培養(yǎng)杯，所述雙重培養(yǎng)杯包括方杯以及位于方杯之內(nèi)的圓杯；所述圓杯包含圓杯壁和圓杯多孔底片，所述圓杯設(shè)有圓杯抽吸管和圓杯輸液管，所述方杯設(shè)有方杯抽吸管和方杯輸液管；所述圓杯和方杯之間設(shè)有支撐結(jié)構(gòu)；
[0011]所述雙培養(yǎng)液灌溉系統(tǒng)包括兩個培養(yǎng)液盛放裝置、兩個廢液回收裝置、兩個培養(yǎng)液輸送管、兩個廢液回收管和一個多通道蠕動泵，兩個培養(yǎng)液盛放裝置分別通過一個培養(yǎng)液輸送管與圓杯輸液管或方杯輸液管相連，所述圓杯抽吸管和方杯抽吸管各通過一個廢液回收管與一個廢液回收裝置相連；所述多通道蠕動泵為培養(yǎng)液的輸送和廢液的抽吸提供動力。
[0012]優(yōu)選的，所述細胞體外培養(yǎng)裝置還包括加載裝置，所述加載裝置包括馬達、加壓板、加壓柱和多孔加壓片；所述加壓板位于蓋板之上，所述蓋板上對應(yīng)中板方孔的位置設(shè)有蓋板方孔，所述加壓柱的上端與加壓板螺紋連接，加壓柱穿過蓋板方孔，加壓柱的下端與多孔加壓片螺紋連接；所述馬達與加壓板連接。
[0013]優(yōu)選的，所述細胞體外培養(yǎng)裝置還包括監(jiān)測系統(tǒng)，所述監(jiān)測系統(tǒng)包括壓力感應(yīng)片、電子顯微鏡和電腦；所述壓力感應(yīng)片位于所述底板上，且與雙重培養(yǎng)杯對應(yīng)設(shè)置，所述壓力感應(yīng)片通過數(shù)據(jù)線與電腦連接；所述電子顯微鏡位于蓋板和中板之間，通過數(shù)據(jù)線與電腦連接；所述電腦還通過數(shù)據(jù)線與多功能蠕動泵和馬達連接。
[0014]優(yōu)選的，所述蓋板的底面設(shè)有蓋板管槽和蓋板電子顯微鏡安裝槽，所述中板的正面設(shè)有中板管槽和中板電子顯微鏡安裝槽。
[0015]優(yōu)選的，所述方杯和圓杯分別設(shè)有管道固定結(jié)構(gòu)。
[0016]更優(yōu)選的，所述雙重培養(yǎng)杯分為壓力承載杯和非壓力承載杯；所述壓力承載杯的方杯含有3個管道固定結(jié)構(gòu)，圓杯有I個管道固定結(jié)構(gòu)，圓杯抽吸管穿過加壓柱；所述非壓力承載杯的圓杯含有2個含有管道固定結(jié)構(gòu)，所述方杯含有4個管道固定結(jié)構(gòu)。
[0017]優(yōu)選的，細胞體外培養(yǎng)裝置含有12個雙重培養(yǎng)杯，分為3排，每排4個，中間I排為非壓力承載杯，其余2排為壓力承載杯。
[0018]優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)為設(shè)于圓杯底部的支撐腳。
[0019]一種細胞體外培養(yǎng)方法，使用上述細胞體外培養(yǎng)裝置及兩種培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，包括以下步驟:
[0020]S1、預(yù)制含有細胞的液態(tài)凝膠；
[0021]S2、將生物反應(yīng)器和加載裝置裝配后置于超凈臺上，將電腦連接馬達，控制馬達調(diào)節(jié)加壓板位置使多孔加壓片與圓杯多孔底片之間有1_4_的間隙，然后將預(yù)制的液態(tài)凝膠注入該間隙中，使液態(tài)凝膠與多孔加壓片和圓杯多孔底片的表面充分接觸，置于室溫待液態(tài)凝膠充分凝固；
[0022]S3、在圓杯和方杯中分別加適量的第一種培養(yǎng)液或第二種培養(yǎng)液；再將生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)箱，連接雙培養(yǎng)液灌溉系統(tǒng)以及監(jiān)控系統(tǒng)；啟動驅(qū)動馬達和培養(yǎng)液蠕動泵，對培養(yǎng)組織施加設(shè)定的壓力載荷，并維持穩(wěn)定的培養(yǎng)液環(huán)境，實時監(jiān)測加壓板的加壓位移情況，以及組織的受力大小變化。
[0023]優(yōu)選的，細胞體外培養(yǎng)裝置及培養(yǎng)方法適用于人體內(nèi)生存于壓力條件下的各種組織和細胞的體外培養(yǎng)，例如:胃上皮