龍血竭中的類黃酮化合物的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及中藥龍血竭的化學(xué)成分的新發(fā)現(xiàn)和醫(yī) 藥新用途，更具體來說，涉及龍血竭中類黃酮新化合物的分離純化及其在治療骨質(zhì)疏松藥 物中的醫(yī)藥新應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，0P)是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、 易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病，多發(fā)于絕經(jīng)后婦女和老年男性，是世界衛(wèi)生組織認(rèn)定的 影響中老年健康的"三大殺手"之一。骨質(zhì)疏松癥嚴(yán)重地影響老年人的身體健康及生活質(zhì) 量，甚至縮短壽命，增加國家及家庭財(cái)力與人力負(fù)擔(dān)。而目前用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的藥 物有雙膦酸鹽類、降鈣素、雌激素類藥物、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑及甲狀旁腺激素（PTH) 等，但多數(shù)藥物對(duì)骨質(zhì)疏松的作用依然有限，部分藥物毒副作用較大，不良反應(yīng)較多。因此， 尋找一種安全、高效的0P治療藥物具有重要意義。
[0003] 正常生理狀態(tài)下，破骨細(xì)胞的骨吸收作用和成骨細(xì)胞的骨形成作用之間的動(dòng)態(tài) 平衡維持了骨組織內(nèi)環(huán)境及骨量的穩(wěn)定。當(dāng)骨吸收大于骨形成即發(fā)生骨流失、骨量減少， 導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，增加骨折風(fēng)險(xiǎn)。成骨細(xì)胞發(fā)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs)，MSCs在相關(guān)因子的調(diào)控下可分化為脂肪細(xì)胞，成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞等。因此 我們期望能夠從天然產(chǎn)物中分離出有效的化合物，能夠調(diào)控MSCs的分化方向即促進(jìn)MSCs 骨向分化，從而有望增加骨形成作用用于骨質(zhì)疏松的治療。
[0004] MSCs在向成骨細(xì)胞分化過程的初期，其標(biāo)志性蛋白一一堿性磷酸酶 (alkalin印hosphate，ALP)的活性明顯增加，因此通過檢測ALP的活性水平可以判斷化合 物是否促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞方向分化。
[0005]龍血竭為百合科（Liliaceae)龍血樹屬（Dracaena)植物劍葉龍血樹（Dracaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen)中經(jīng)提取得到的樹脂，又名麒麟血、海錯(cuò)等，是一味傷 科要藥，性平，味甘、咸，具有活血散瘀、定痛止血、斂瘡生肌的功效，主要用于外傷出血、潰 瘍不斂、跌打損傷、瘀滯作痛等癥。龍血竭主要含有查爾酮、二氫黃酮、羥芐色原烷、留體皂 甙等化合物。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，龍血竭具有抗氧化、抗菌、抗炎、活血止血等活性。迄今， 目前尚未有關(guān)于龍血竭用于治療骨質(zhì)疏松癥的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種龍血竭中的 類黃酮化合物的制備方法，以及提供龍血竭具有治療骨質(zhì)疏松作用的新應(yīng)用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明之目的，采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：正相硅膠柱色譜分離、反相 0DS柱色譜分離、S印hadexLH-20凝膠色譜分離、高效液相色譜分離等分離方法相結(jié)合。
[0008] 類黃酮化合物的結(jié)構(gòu)通式如下：
[0009]
[0010] Compd. 1 :&= CH 30, R2= CH 30, R3= H
[0011] Compd. 2 :&= H，R 2= H，r3 = Ch30
[0012] Compd. 3 :&= H，R 2= H，R 3= H
[0013] 類黃酮化合物為龍血竭中分離得到的具有4'-羥芐基色原烷基本骨架的類黃酮 化合物，其中化合物1為新化合物，化合物2和3為已知化合物?；衔锩麨椋夯衔? 為5,8_二甲氧基-7-羥基-4'-羥芐色原烷，化合物2為4-甲氧基-7-羥基-4'-羥芐 色原燒（7,4' -dihydroxy-8-methoxyhomoisoflavane)，化合物 3 為 7_ 羥基 _4'-輕節(jié)色 原燒（7-hydroxy_3-(4-hydroxybenzyl) chromane)；
[0014] 所述的龍血竭是經(jīng)過下述提取方法獲得：收集劍葉龍血樹分泌的樹脂，先經(jīng)8倍 量乙酸乙酯回流提取2次，過濾后合并濾液，減壓濃縮得浸膏。往浸膏中加入30倍0. 35% NaOH溶液攪拌溶解，過濾得濾液；再用10%鹽酸將濾液酸化至pH 1~2,靜置24小時(shí)，獲 得沉淀物，并用純水洗滌至中性，干燥粉碎，制成龍血竭干粉；
[0015] 所述的龍血竭中的類黃酮化合物是通過下述方法分離純化：將所述龍血竭干粉， 先后采用MCI、正相硅膠、反相0DS、S印hadex LH-20分離材料進(jìn)行柱色譜分離，并輔以HPLC 方法進(jìn)行純化，獲得單體化合物。
[0016] 作為優(yōu)選：分離純化時(shí)，將所述龍血竭干粉先采用MCI填料、50%~100%甲醇/ 水溶液進(jìn)行梯度柱色譜分離，分別得到4個(gè)部位：50%~60% :部位I ;70%~80% :部位 II ;80%~90% :部位III ;100% :部位IV ;部位II經(jīng)減壓濃縮，再進(jìn)行正相硅膠柱色譜分 離，得到10個(gè)分離部位（II-1~11-10);
[0017] 部位11-6、II-7先后經(jīng)反相0DS柱色譜分離、S印hadex LH-20凝膠色譜分離，最 終經(jīng)HPLC方法進(jìn)行純化，獲得單體化合物1~3。
[0018] 所述的類黃酮化合物用于增強(qiáng)堿性磷酸化酶活性，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分 化。
[0019] 本發(fā)明中所述的化合物1為新化合物，該化合物為淡黃色油狀物；高分辨質(zhì)譜 〇11?3頂3)給出準(zhǔn)分子離子峰111/2 315.1227[11-扣（理論計(jì)算值為315.1232)，推算出化合 物1的分子式為C1SH 2Q05,不飽和度為9 ;紅外光譜（溴化鉀壓片）vnax:3367,2923，1616， 1530,1516,1445,1430,1192,1124,853 NMR(表 1)圖譜中顯示了一組 AA，BB'耦合的 苯環(huán)，一組5取代的苯環(huán)，2個(gè)甲氧基取代；13C NMR(表1)結(jié)合DEPT-135圖譜，顯示18個(gè) 碳原子信號(hào)，其中6個(gè)AA' BB'二取代苯環(huán)碳信號(hào)，2個(gè)5取代苯環(huán)碳信號(hào)，1個(gè)連氧亞甲 基，2個(gè)連氧甲基，2個(gè)亞甲基和1個(gè)次甲基；結(jié)合HMBC二維圖譜，2個(gè)CH 30分別與苯環(huán)C-5 和C-8相關(guān)，4-012與苯環(huán)的C-5相關(guān)，2-CH2-0與苯環(huán)C-8a相關(guān)，9-01 2與苯環(huán)的C-2'和 C-6'相關(guān)，3-CH與苯環(huán)C-1'相關(guān)，可以推斷出化合物1的結(jié)構(gòu)為5,8_二甲氧基-7-羥 基-4'-羥芐色原烷。
[0020] 表 1.化合物 1 的1H NMR 和 13C NMR 數(shù)據(jù)（CD30D)
[0021]
[0022]
[0023] 本發(fā)明中的化合物2和化合物3為已知化合物，其分子式分別為C17H1S04 和C16H1603?；衔?2 的1HNMR數(shù)據(jù)（CD30D):S7. 01 (2H,d,J=6.3Hz,H-2'和 H-6，），6.74(lH，d，J= 6.3，H-3，和H-5，），6.55(lH,d，J= 8.4Hz，H-6)，6.36(lH，d，J =8. 4Hz,H-5), 4. 15 (1H,brd,J=10. 6Hz,H-2a ),3. 73 (1H,dd,J=10. 6Hz,H-2P ), 3. 77 (3H,s,CH30),2. 66 (1H,dd,J=15. 8,L5,H-4a ),2. 52 (2H,m,H2-9),2. 37 (1H,dd,J= 15. 8, 8. 6Hz,H-4 0 )，2. 14 (1H,m,H-3 0 );化合物 3 的1HNMR數(shù)據(jù)（CD30D) :S6. 95 (2H,d,J = 8.0Hz，H-2，和H-6，），6.75(lH，d，J= 8.3Hz，H-5)，6.73(2H，d，J= 8.6Hz，H-3，和 H-5，），6. 31 (1H，dd，J = 8. 3, 2. 4Hz，H-6)，6. 22 (1H，d，J = 2. 4Hz，H-8)，4. 04 (1H，br d，J =10. 5Hz，H-2 a )，3. 66 (1H，dd，J = 10. 5, 8. 5Hz，H-2 0 )，2. 61 (1H，dd，J = 15. 8, 5. 2, H-4 a ),2. 51 (2H, m, H2-9), 2. 32 (1H, dd, J = 15. 8, 8. 8Hz, H-4 P ), 2. 09 (1H, m, H-3 P ) 〇
[0024] 本發(fā)明中所述的中藥龍血竭用于制備治療骨質(zhì)疏松的藥物，是通過現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn) 得以證實(shí)。
[0025] 本發(fā)明中抗骨質(zhì)疏松活性是通過測定藥物作用細(xì)胞的ALP活性以及細(xì)胞總蛋白 水平來判斷。采用經(jīng)典的成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)MSCs骨向分化，同時(shí)給予不同的化合物（化合物 1~3)干預(yù)其分化過程，陽性對(duì)照組E2 (17 0 -estradiol)的濃度為0. 5 y M，待篩化合物濃 度為10 yM。分化第4天時(shí)，去除培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽（PBS)將細(xì)胞清洗一次，再加入裂解 緩沖液。裂解15min后，取上清液用于檢測ALP的活性以及細(xì)胞總蛋白水平，最終以總蛋白 來較準(zhǔn)ALP活性。
[0026] 本發(fā)明中化合物1~3的抗骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)中ALP活性如表2所示，
[0027] 表2.化合物1~3的ALP活性（化合物的篩選濃度為10 y M)
[0028]
[0029]
[0030] 表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，化合物1~3對(duì)細(xì)胞具有促進(jìn)MSC細(xì)胞骨向分化的作用，且 ALP活性大于150%，說明龍血竭中的類黃酮化合物具有促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞方向分化的 能力，具有潛在的治療骨質(zhì)疏松的功效。
【附圖說明】
[0031] 圖1為化合物1~3作用于細(xì)胞后細(xì)胞上清液的ALP活性。
[0032] 圖2為化合物1的1H NMR圖譜。
[0033] 圖3為化合物1的13C NMR圖譜。
[0034] 圖4為化合物1的HMBC二維圖譜。
[0035] 圖5為化合物1的HR-ES頂S圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合圖1至圖5和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不以任何方式對(duì) 本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明中中藥龍血竭及龍血竭中類黃酮化合物用于制備骨質(zhì)疏松藥 物應(yīng)用所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條 件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述