一類Tetramic acid化合物及其制備方法和在制備抗腫瘤、抗病毒藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類Tetramic acid化合物及其制備方法和 在制備抗腫瘤、抗病毒藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Tetramic acid(吡咯烷-2, 4-二酮）類的天然產(chǎn)物通?？梢詮募?xì)菌、真菌以及 海綿中分離得到[Schobert, R. ;Andrea, S. Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 4203 - 4221.]。它 們的結(jié)構(gòu)特征是含有1個(gè)吡咯-2, 4-二酮的雜環(huán)片段，很長(zhǎng)的側(cè)鏈或由很多環(huán)聚合在一起 等，其中含有十氫萘片段的tetramic acid類化合物經(jīng)常在很多微生物的次生代謝產(chǎn)物中 被發(fā)現(xiàn)，由于tetramic acid類化合物具有結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的特點(diǎn)[Li，G. ;Kusari，S.; Spiteller, M. Nat. Prod. R印· 2014, 31，1175 - 1201.]，因此，很多學(xué)者們對(duì)它們的生物合 成、化學(xué)合成以及生物活性展開(kāi)了廣泛的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一類具有抗腫瘤和抗病毒活性的Tetramic acid類化 合物。
[0004] 本發(fā)明通過(guò)多種柱層析及一維、二維核磁共振波譜，從真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021的發(fā)酵液中分離得到一類新的Tetramic acid類化合物，這種化合物具有抑制 多種癌癥細(xì)胞和HSV-I病毒生長(zhǎng)的活性，可用于制備抗腫瘤和抗病毒藥物，從而實(shí)現(xiàn)了本 發(fā)明的目的。
[0005] 本發(fā)明的5個(gè)Tetramic acid類化合物，其結(jié)構(gòu)如式（I )和式（II )所示：
[0007] 其中，式（I )中
[0012] 或化合物3,其結(jié)構(gòu)如式（II )所示。
[0013] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述Tetramic acid類化合物的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟：
[0014] (1)制備真菌 Trichobotrys effuse DFFSCS021 的固體發(fā)酵物；
[0015] (2)將步驟⑴得到的固體發(fā)酵物的浸膏用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶劑萃取， 濃縮得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物；
[0016] ⑶將步驟⑵所述的乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物經(jīng)過(guò)中壓、 常壓硅膠柱層析，以水-甲醇、氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-丙酮或 石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)分別作為正反相洗脫劑，從體積比100:0到0:100進(jìn)行梯度洗 脫，用薄層層析追蹤合并組分，經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱層析得到粗品，經(jīng)高效液相色譜 純化，得到Tetramic acid類化合物1-5。
[0017] 步驟（1)中所述的真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021的固體發(fā)酵物是通過(guò) 將真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021接種到真菌適用的培養(yǎng)基中，在通常的發(fā)酵條件 下制得。優(yōu)選的制備方法是將真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021接種于PDA瓊脂培 養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)3天，得到培養(yǎng)有菌種的平板，然后將平板中菌種接種入液體培養(yǎng)基中， 于轉(zhuǎn)速180r/min搖床、溫度28°C培養(yǎng)3天，得到種子液，再將種子液接種于大米培養(yǎng)基中， 于28°C靜置培養(yǎng)30天，得到固體發(fā)酵物，所述的液體培養(yǎng)基為每升含有葡萄糖10g，甘露醇 2〇g，麥芽糖20g，玉米漿lg，味精10g，KH 2PO4O. 5g，MgSO4O. 3g，酵母浸膏3g，海鹽30g，余量 為水，pH 7. 0,所述的大米培養(yǎng)基為每600mL是這樣配制的：將大米400g，酵母膏2g，葡萄糖 2g，海鹽18g，加入到容器中，然后用水定容到600ml。
[0018] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021在制備上述 Tetramic acid類化合物中的應(yīng)用。
[0019] 通過(guò)體外抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：本發(fā)明的Tetramic acid類化合物能 抑制肝癌細(xì)胞株ifepG2、宮頸癌細(xì)胞株HeLa、食管癌細(xì)胞株Ecal09、前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、 喉癌細(xì)胞株H印-2、白血病細(xì)胞株KG-la、單純皰疹病毒HSV-I的生長(zhǎng)，它們的IC 5。值如表3 所示，由此證明本發(fā)明的Tetramic acid類化合物可以用于制備抗腫瘤和抗病毒的藥物。
[0020] 因此，本發(fā)明的第三個(gè)目的是上述Tetramic acid類化合物在制備抗腫瘤或抗病 毒藥物中的應(yīng)用。
[0021] -種抗腫瘤或抗病毒藥物，其特征在于，包括有效量的作為活性成分的Tetramic acid類化合物和藥學(xué)上可以接受的載體。
[0022] 所述的抗腫瘤藥物優(yōu)選為抗肝癌、宮頸癌、食管癌、前列腺癌、喉癌、白血病的藥 物。
[0023] 所述的抗病毒藥物優(yōu)選為抗單純皰疹病毒HSV-I的藥物。
[0024] 本發(fā)明的Tetramic acid類化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2、宮頸癌細(xì)胞株HeLa、食 管癌細(xì)胞株Ecal09、前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、喉癌細(xì)胞株H印-2、白血病細(xì)胞株KG-la、單純皰 疹病毒HSV-I的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，在制備抗腫瘤和抗病毒藥物方面有良好的應(yīng)用前 景。
[0025] 本發(fā)明的真菌 Trichobotrys effuse DFFSCS021 于 2015 年 8 月 20 日保藏于 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)：CCTCC NO. M 2015496。
【附圖說(shuō)明】：
[0026] 圖1是化合物1中的關(guān)鍵HMBC和1H-1H COSY圖；
[0027] 圖2是化合物1中的關(guān)鍵NOESY圖；
[0028] 圖3是化合物1-5的⑶圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0029] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0030] 實(shí)施例1 :Tetramic acid類化合物1-5的制備
[0031] 每升液體培養(yǎng)基是這樣配制的：將10克葡萄糖，20克甘露醇，20克麥芽糖，1克玉 米漿，10克味精，0. 5克KH2PO4,0. 3克MgSO4, 3克酵母浸膏，30克海鹽混合，用水定容到1L， 調(diào)pH 7. 0。將液體培養(yǎng)基裝入約5個(gè)500mL的三角燒瓶中，每瓶約150mL，在121°C高壓蒸 汽滅菌25分鐘。
[0032] 大米培養(yǎng)基是這樣配制的：每個(gè)5L三角瓶中盛裝大米400g，酵母膏2g，葡萄糖 2g，海鹽18g，用水定容到600mL，混勻，121°C高壓蒸汽滅菌25分鐘，共6瓶備用。
[0033] 用移液槍吸約2微升的真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021菌種接種入PDA瓊 脂培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)3天，得到培養(yǎng)有菌種的平板，然后用竹簽從平板中挑約3微升菌種 接種入含150mL上述液體培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，于搖床（轉(zhuǎn)速180r/min)溫度28°C 培養(yǎng)3天，得到種子液后，在上述盛有大米培養(yǎng)基的5L三角瓶中接種50mL種子液，于28°C 靜置培養(yǎng)30天后，收取固體發(fā)酵物。
[0034] 將經(jīng)大米培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的固體發(fā)酵物每瓶用2L丙酮浸泡、搗碎，在用組織勻漿 機(jī)攪拌均勻，超聲破壁30分鐘，減壓抽濾得到濾液，將濾液減壓蒸餾除去丙酮后，再用水制 成水混懸液，再用20L乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到乙酸乙酯提取物29. 93g。乙酸乙酯提 取物用正相硅膠（200-300目）干法拌樣后，裝入玻璃層析柱（含正相硅膠200-300目約 300g)，進(jìn)行常溫柱層析，以氯仿-甲醇作為洗脫劑，從體積比100:0到0:100進(jìn)行梯度洗 脫，根據(jù)薄層層析（GF 254硅膠板）情況合并得到7個(gè)流分（Fr. I-Fr. 7)，回收洗脫溶劑，蒸 干流分用甲醇轉(zhuǎn)移。在薄層層析板能用氯仿-甲醇（體積比10:1)為展開(kāi)劑展開(kāi)的流分 Fr. 2進(jìn)一步通過(guò)硅膠柱（含正相硅膠100-200目約100g)進(jìn)行常溫柱層析，以石油醚-氯 仿作為洗脫劑，從體積比100:2到0:100進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層層析（GF254硅膠板）情況 合并得到3個(gè)亞流分（Fr. 2-1-Fr. 2-3)，其中在薄層層析板上用氯仿-甲醇（體積比10:1) 為展開(kāi)劑時(shí)，含Rf值為〇. 5~0. 7主點(diǎn)的亞流分Fr. 2-1采用高效液相半制備（檢測(cè)波長(zhǎng) 為254nm，流速為3mL/min，色譜柱為YMC-Pack 10_X 250_，流動(dòng)相為體積比為85:15的 甲醇-水）分別在出峰時(shí)間為30和39分鐘時(shí)分離純化得到化合物4和5。其中在薄層層 析板上用氯仿-甲醇（體積比10:1)為展開(kāi)劑時(shí)，含Rf值為〇. 2~0. 5主點(diǎn)的流分Fr. 3 進(jìn)一步通過(guò)硅膠柱進(jìn)行常溫柱層析，以氯仿-丙酮作為洗脫劑，從體積比100:2到1:1進(jìn)行 梯度洗脫，根據(jù)薄層層析（GF 254硅膠板）情況合并得到4個(gè)亞流分（Fr. 3-1-Fr. 3-4)，其中 在薄層層析板上用氯仿-甲醇（體積比10:1)為展開(kāi)劑時(shí)，含Rf值為0. 3~0. 5主點(diǎn)的亞 流分Fr. 34再通過(guò)中壓柱層析，以甲醇-水作為洗脫劑，從體積比2:8到9:1進(jìn)行梯度洗 脫，根據(jù)薄層層析（GF254硅膠板）情況合并得到4個(gè)亞流分（Fr. 3-1-1-Fr. 3-1-4)，其中在 薄層層析板上用氯仿-甲醇（體積比10:1)為展開(kāi)劑時(shí)，以Rf值為0. 3~0. 5主點(diǎn)為主要 成分的亞流分Fr. 3-1-1采用高效液相半制備（檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，流速為3mL/min，色譜柱 為YMC-Pack 10mmX250mm，流動(dòng)相為體積比為60:40的甲醇-水）分別在出峰時(shí)間為16、 19和22分鐘時(shí)分離純化得到化合物3、1和2。
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