一種魚皮源基質金屬蛋白酶拮抗肽的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于功能肽制備技術領域，具體涉及一種魚皮源基質金屬蛋白酶拮抗肽。
【背景技術】
[0002]近幾十年來，由于臭氧層的破壞、過度日光浴等原因使皮膚光老化人群增多。由紫外線引起的皮膚松弛、粗糙、萎縮、皺紋、色素沉著、毛細血管擴張、紫癜等嚴重影響了人們皮膚的健康，預防和延緩皮膚光老化已成為目前醫(yī)學研究的熱點。
[0003]皮膚光老化與真皮層膠原含量的減少密切相關，紫外線照射產生過多的R0S，破壞了體內氧化還原系統的平衡，誘導基質金屬蛋白酶(Matrix Metallo ProteinasesMMPs)水平升高，導致了真皮層膠原蛋白的降解。
[0004]目前主要通過藥物、激光、注射填充、手術等方法進行光老化皮膚的治療和改善。國內外報道了許多天然動植物提取物具有抗氧化、延緩皮膚光老化的效果，但其含量少、利用率低、作用效果不明顯。通過化學方法合成的具有抑制金屬蛋白酶活性的多肽成本高。因此，開發(fā)抗皮膚光老化作用效果明顯、來源廣泛的抑制基質金屬蛋白酶效果的天然活性物質成為現在研究的熱點。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種具有抑制基質金屬蛋白酶活性的多肽，具有減緩由于紫外線而導致的皮膚氧化損傷的功效。
[0006]本發(fā)明的抑制基質金屬蛋白酶活性的多肽，其制備方法如下:
[0007]I)魚皮明膠的制備
[0008]將魚皮在堿液中進行浸泡，浸泡結束后，水洗魚皮至中性，然后再用酸溶液在室溫浸泡，浸泡結束后水洗魚皮至pH為5.0-6.0，再將處理的魚皮放入蒸餾水中，在40°C -80°C水浴振蕩提?。浑x心取上清液，得到魚皮明膠；
[0009]所述的魚皮為鱈魚皮和/或大馬哈魚皮；
[0010]所述的堿液為0.02-0.2mol/L的NaOH溶液；
[0011 ] 所述的酸溶液為0.01-0.06mol/L的&504溶液
[0012]2)基質金屬蛋白酶拮抗肽的靶向酶解
[0013]將步驟I)制備的魚皮明膠調節(jié)初始pH至7.2-7.5，采用胰酶和堿性蛋白酶組合進行水解，酶解至產物的水解度為18% _19%，終止酶解反應，離心分離，上清液即為基質金屬蛋白酶拮抗肽的粗組分；
[0014]其中胰酶濃度優(yōu)選為1200U/g.prot，堿性蛋白酶濃度優(yōu)選為1000U/g.prot ；
[0015]3)基質金屬蛋白酶措抗肽的精制純化
[0016]步驟2)制備的粗組分經0.22 μπι的微孔濾膜過濾后，超濾得到分子量300_1000Da的活性肽；然后采用SP-S^hadex C25陽離子交換柱進行分離純化:首先以0.02mol/LpH4.2的醋酸緩沖液平衡100-150min，上樣后再用0-1.0moI/L的NaCl的醋酸緩沖液線性梯度洗脫，收集活性最高的第二個主峰；然后利用Sephadex G25凝膠柱進一步分離純化，洗脫液為超純水，流速0.4-0.6mL/min，收集第二個主峰，脫鹽后冷凍干燥，即為MMPs拮抗肽。
[0017]本發(fā)明制備的多肽用于制備抑制基質金屬蛋白酶活性的制品。
[0018]本發(fā)明提供的基質金屬蛋白酶拮抗肽能顯著的抑制由紫外線照射而引起的皮膚中MMP-1、MMP-3、MMP-9的升高，減緩了紫外線導致的皮膚氧化損傷。另外以魚皮制備的MMPs拮抗肽可充分利用大量水產加工副產物資源，減少環(huán)境污染，具有重要的社會效益。
【具體實施方式】
[0019]實施例1
[0020]以解凍后300克大馬哈魚皮為原料，經0.lmol/L NaOH溶液(1: 6w/v)室溫浸泡30分鐘后水洗至中性，用0.0211101/1的!12304溶液(l:6w/V)常溫浸泡約30分鐘，水洗至pH5.5。按照料液比1:2-1:6 (w/v)加入蒸餾水，60°C水浴振蕩提取4小時，離心取上清液，大馬哈魚皮明膠。
[0021]調整大馬哈魚皮明膠溶液濃度20g/L，pH為7.3，采用胰酶和堿性蛋白酶(由地衣芽孢桿菌2709所產的蛋白酶)組合進行水解，胰酶濃度為1200U/g.prot，堿性蛋白酶濃度1000U/g.prot，在50°C下酶解，酶解過程采用酶傳感器與人工神經網絡在線控制，酶解120min后，每隔2min采用定量栗將酶解液栗入生物傳感器，利用谷氨酸和賴氨酸的氧化酶電極進行檢測。以游離谷氨酸增加量(μ g/g.總氮)、游離賴氨酸增加量(μ g/g.總氮)輸入到訓練好的模型，明膠水解度達到18.4%，沸水浴滅酶Smin終止水解反應，離心分離，得到基質金屬蛋白酶拮抗肽的粗組分。
[0022](I)基質金屬蛋白酶拮抗肽的粗組分經0.22 μπι的微孔濾膜過濾后，分別采用截留分子量100Da和300Da的卷式超濾膜進行超濾。(2)采用SP-S^hadex C25陽離子交換柱(3.5cmX80cm)進行分離純化:先以0.02mol/L ρΗ4.2的醋酸緩沖液平衡120min，采用NaCl的醋酸緩沖液線性梯度洗脫，收集第二個峰。(3)利用Sephadex G25凝膠柱(1.6cmX 100cm)進一步分離純化，洗脫液為超純水，流速0.5mL/min，收集第二個主峰，脫鹽后冷凍干燥，得到主要特征片段為Gly-Pro的大馬哈魚皮源基質金屬蛋白酶拮抗肽。
[0023]采用SPF級ICR雌鼠作為受試動物，隨機分為正常對照組，模型對照組，陽性對照組，大馬哈魚皮源基質金屬蛋白酶拮抗肽組，構建紫外線誘導的小鼠皮膚光老化模型。實驗照射劑量及方式:各組小鼠在紫外照射實驗開始前，預防性灌胃2周，第3周開始脫毛，灌胃半小時后進行紫外照射，其中正常組只灌胃不進行紫外照射。造模實驗結束后，取小鼠背部同一區(qū)域皮膚制備10%組織勻漿上清液，參照試劑盒操作說明分別測定皮膚組織勻漿上清液中ΜΜΡ-1、ΜΜΡ-3、ΜΜΡ-9和蛋白含量，T-S0D、GSH-Px和CAT的活力。大馬哈魚皮源基質金屬蛋白酶拮抗肽對紫外線照射而導致的MMP-1、MMP-3、MMP-9含量升高的抑制率分別為33.05%,40.83%和39.95%。此外，大馬哈魚皮源基質金屬蛋白酶拮抗肽使皮膚中抗氧化物酶T-S0D，CAT和GSH-Px的平均活力分別提高34.60%,82.32%和49.76%，使脂質過氧化產物MDA的含量降低了 38.09%，減緩了紫外線導致的皮膚氧化損傷。
[0024]實施例2
[0025]以200g新鮮鱈魚皮為原料，經0.05mol/L NaOH溶液(料液比1: 6w/v)室溫浸泡40min，水洗至中性，0.03mol/L的比304溶液(l:6w/v)室溫浸泡約30min，水洗至pH6.0。按照料液比1:4(w/v)加入蒸餾水，65°C水浴振蕩提取5小時，離心取上清液，得到鱈魚皮明膠。
[0026]調整鱈魚皮明膠溶液濃度為20g/L，調節(jié)初始pH至7.5，采用胰酶和堿性蛋白酶(由地衣芽孢桿菌2709所產的蛋白酶)組合進行水解，胰酶濃度為1200U/g.prot，堿性蛋白酶濃度1000U/g.prot，在50°C下酶解，酶解過程采用酶傳感器與人工神經網絡在線控制，酶解120min后，每隔2min采用定量栗將酶解液栗入生物傳感器，利用谷氨酸和賴氨酸的氧化酶電極進行檢測。以游離谷氨酸增加量(μ g/g.總氮)、游離賴氨酸增加量(μ g/g ?總氮)輸入到訓練好的模型，明膠水解度達到18.6%，沸水浴滅酶Smin終止水解反應，離心分離，得到鱈魚皮源基質金屬蛋白酶拮抗肽的粗組分。
[0027](I)基質金屬蛋白酶拮抗肽的粗組分經0.22 μπι的微孔濾膜過濾后，分別采用截留分子量100Da和300Da的卷式超濾膜進行超濾。(2)采用SP-S^hadex C25陽離子交換柱(3.5cmX80cm)進行分離純化:先以0.02mol/L pH4.2的醋酸緩沖液平衡120min，上樣后用NaCl的醋酸緩沖液線性梯度洗脫，收集第二個峰。(3)利用Sephadex G25凝膠柱(1.6cmX 100cm)進一步分離純化，洗脫液為超純水，流速0.4mL/min，收集第二個主峰，脫鹽后冷凍干燥，得到主要特征片段為Gly-Pro的鱈魚皮源基質金屬蛋白酶拮抗肽。
[0028]采用SPF級ICR雌鼠作為受試動物，隨機分為正常對照組，模型對照組，陽性對照組，鱈魚皮源基質金屬蛋白酶拮抗肽組，構建紫外線誘導的小鼠皮膚光老化模型。實驗照射劑量及方式:各組小鼠在紫外照射實驗開始前，預防性灌胃2周，第3周開始脫毛，灌胃半小時后進行紫外照射，其中正常組只灌胃不進行紫外照射。造模實驗結束后，取小鼠背部同一區(qū)域皮膚制備10%組織勻漿上清液，參照試劑盒操作說明分別測定皮膚組織勻漿上清液中MMP-1、MMP-3、MMP-9和蛋白含量，T-SOD, GSH-Px和CAT的活力。鱈魚皮源基質金屬蛋白酶拮抗肽對紫外線照射而導致的MMP-1、MMP-3、MMP-9含量升高的抑制率分別為
36.73%，31.34%和44.24%。此外，鱈魚皮源基質金屬蛋白酶拮抗肽使皮膚中抗氧化物酶T-S0D, CAT和GSH-Px的平均活力分別提高34.07%,90.85%和77.64%,使脂質過氧化產物MDA的含量降低了 30.36%，減緩了紫外線導致的皮膚氧化損傷。
【主權項】
1.一種抑制基質金屬蛋白酶活性的多肽，其特征在于，所述的多肽的制備方法如下: 1)魚皮明膠的制備 將魚皮在堿液中進行浸泡，浸泡結束后，水洗魚皮至中性，然后再用酸溶液在室溫浸泡，浸泡結束后水洗魚皮至pH為5.0-6.0，再將處理的魚皮放入蒸餾水中，在40°C -80°c水浴振蕩提?。浑x心取上清液，得到魚皮明膠； 2)基質金屬蛋白酶拮抗肽的靶向酶解 將步驟I)制備的魚皮明膠調節(jié)初始PH至7.2-7.5，采用胰酶和堿性蛋白酶組合進行水解，酶解至產物的水解度為18% _19%，終止酶解反應，離心分離，上清液即為基質金屬蛋白酶拮抗肽的粗組分； 3)基質金屬蛋白酶拮抗肽的精制純化 步驟2)制備的粗組分經0.22 μ m的微孔濾膜過濾后，超濾得到分子量300-1000Da的活性肽；然后采用SP-S^hadex C25陽離子交換柱進行分離純化:首先以0.02mol/L pH4.2的醋酸緩沖液平衡100-150min，上樣后再用0-1.0moI/L的NaCl的醋酸緩沖液線性梯度洗脫，收集活性最高的第二個主峰；然后利用Sephadex G25凝膠柱進一步分離純化，洗脫液為超純水，流速0.4-0.6mL/min，收集第二個主峰，脫鹽后冷凍干燥，即為MMPs拮抗肽。2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的步驟I)中的魚皮為鱈魚皮和/或大馬哈魚皮。3.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的步驟I)中的堿液為0.02-0.2mol/L的NaOH溶液。4.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的步驟I)中的酸溶液為0.01-0.06mol/L 的 H2SO4溶液。5.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的步驟2)中胰酶濃度為1200U/g.proto6.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的步驟2)中堿性蛋白酶濃度為1000U/g.proto7.權利要求1所述的多肽在抑制基質金屬蛋白酶活性中的應用。8.權利要求1所述的多肽在制備抑制基質金屬蛋白酶活性的制品中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抑制光老化皮膚中基質金屬蛋白酶活性多肽的制備方法，以魚皮為原料，利用堿性蛋白酶和胰酶組合酶建立酶傳感器-人工神經網絡在線監(jiān)控模型控制水解的進程使水解度在18％-19％，酶解液經0.22μm的微孔濾膜過濾后采用卷式超濾膜進行超濾截留分子量在300-1000Da的活性肽，最后采用SP-Sephadex？C25陽離子交換柱和Sephadex？G25凝膠柱進行逐級分離純化，冷凍干燥得到主要特征片段為Gly-Pro基質金屬蛋白酶(MMPs)拮抗目標肽。本發(fā)明制備的魚皮明膠來源的生物活性肽能夠顯著的抑制由紫外線導致的皮膚中MMPs含量的升高，并且呈現較好的抗氧化活性，為以魚皮明膠為原料制備具有抗皮膚光老化活性的生物活性肽的開發(fā)利用提供了更廣闊的前景。
【IPC分類】C12P21/06
【公開號】CN105087735
【申請?zhí)枴緾N201510603619
【發(fā)明人】侯虎, 陳鐵軍, 樊燕, 李八方, 陸姣含, 王石開, 司磊磊
【申請人】中國海洋大學
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月21日