一種混合酶酶解制備魷魚肝臟蛋白ace抑制肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)品精深加工領(lǐng)域，具體涉及一種混合酶酶解制備魷魚肝臟蛋白 ACE抑制肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 魷魚是重要的海洋頭足類水產(chǎn)物，廣泛分布于大西洋、印度洋和太平洋各海區(qū)。近 年來，我國魷魚捕獲量連年增加，魷魚加工已成為國內(nèi)水產(chǎn)品加工的主要組成部分之一。一 般來說，魷魚經(jīng)解凍加工后有30%左右的頭、足、內(nèi)臟及表皮等廢棄物產(chǎn)生。從世界范圍來 看，每年100多萬噸魷魚捕獲量將會(huì)產(chǎn)生25~30萬噸的魷魚廢棄物。對(duì)這些廢棄物，一般 處理方法是就地掩埋或者加工成魚粉，這不但對(duì)漁業(yè)資源造成浪費(fèi)，而且還存在環(huán)境污染。
[0003] 隨著現(xiàn)代海洋加工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，魚油廢棄物的綜合利用越來越受到重視。 國外有研究發(fā)現(xiàn)，占魷魚廢棄物總量8~13%的魷魚皮中含有豐富的蛋白質(zhì)資源，蛋白質(zhì) 含量約占魷魚皮干重的88 %左右。其中以膠原蛋白為主，含有豐富的甘氨酸、脯氨酸及羥脯 氨酸，其水解產(chǎn)物中還有生物活性肽。對(duì)于魷魚肝臟的利用，在國外，如西班牙、日本采用自 身酶解發(fā)酵法生產(chǎn)魷溶漿、魷魚粉等作為魚類飼料。魷魚肝臟在我國生物廢棄物中占有很 大的比例，解決魷魚肝臟的處理問題，最佳方式是再加工利用。目前，國內(nèi)僅有魷魚肝臟干 粉的加工，并且是用作飼料，技術(shù)水平不高，對(duì)于魷魚肝臟的利用研究還有比較大的發(fā)展空 間。
[0004] 中國專利公告號(hào)CN102250994A，公告日2011年11月23日，公布了一種利用魷魚 肝臟蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的方法，包括將提取魚油后的魷魚肝臟蛋白用丙酮 處理除脂，選用胃蛋白酶在水解溫度35~38 °C，pH為1. 5~2. 5,酶與底物的比為2~3 %， 底物濃度為1~3%條件下水解魷魚肝臟蛋白18~25h;將酶解液進(jìn)行超濾處理后，跟蹤其 ACE抑制活性，應(yīng)用凝膠過濾層析、DEAE陰離子交換柱、RP-HPLC等方法分離純化ACE抑制 肽，制得的ACE抑制肽在溫度2~100°C、pH在1~12之間對(duì)ACE的抑制活性基本沒有變 化，比較穩(wěn)定，而且模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)對(duì)組分的ACE抑制活性的影響不大，經(jīng)過胃腸消化后 仍具有較高的ACE抑制活性。該發(fā)明采用生物酶法利用魷魚肝臟制備ACE抑制肽，具有安 全性高、反應(yīng)條件溫和以及環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。但是該發(fā)明只采用了單酶酶解魷魚肝臟，目前對(duì)于 采用混合蛋白酶制備魷魚肝臟蛋白ACE抑制肽的研究尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種混合酶酶解制備魷魚肝臟蛋白ACE抑制肽的方法，為制備魷魚 肝臟蛋白ACE抑制肽提供更多的選擇途徑，以解決目前魷魚肝臟加工利用率低造成魷魚資 源浪費(fèi)的問題。
[0006] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：一種混合酶酶解制備魷魚肝臟蛋白ACE抑制肽的方 法，包括如下步驟：
[0007] (1)魷魚肝臟預(yù)處理：將魷魚肝臟絞碎與水按質(zhì)量比1:1~1:1. 5混合，在35~ 50°C下加入6mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7~9,保溫20~30min，然后升溫至70~ 90°C，反應(yīng)1~I. 5h，加入占肝臟重量2~4%的氯化鈉，鹽析5~15min，以4000~1000 Or/ min離心15~30min，去掉上層魚油，得到粗制的魷魚肝臟蛋白；
[0008] (2)魷魚肝臟蛋白脫脂：將粗制的魷魚肝臟蛋白脫水后，按料液比lg:3mL加入正 己烷和異丙醇的混合液洗滌2~3次，真空干燥得到脫脂魷魚肝臟蛋白；
[0009] (3)混合酶酶解：將脫脂魷魚肝臟蛋白配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3~5%的水溶液，調(diào)節(jié) pH6. 5~7. 5,加入占脫脂魷魚肝臟蛋白質(zhì)量1~6%的混合蛋白酶，在40~65°C的水浴鍋 中水解10~18h，所述的混合蛋白酶由復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶組成；
[0010] (4)酶滅活：酶解結(jié)束后，以100°C水浴加熱10~20min，使酶失活；
[0011] (5)離心：失活的酶解液在4000~10000r/min條件下離心20~40min，取上清 液，冷凍干燥，凍干的粉末即為魷魚肝臟蛋白ACE抑制肽。
[0012] 不同的蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的作用位點(diǎn)不同，單種酶水解作用位點(diǎn)較單一，導(dǎo)致蛋白 質(zhì)水解度低，本發(fā)明采用復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶混合作用于魷魚肝臟蛋 白，可以提高魷魚肝臟蛋白的水解度，獲得分子量更低的活性肽。同時(shí)由于復(fù)合蛋白酶、中 性蛋白酶、木瓜蛋白酶的最適溫度和最適PH比較接近，協(xié)同效果會(huì)更好。
[0013] 作為優(yōu)選，所述步驟（2)中正己烷和異丙醇的體積比為4:3。正己烷和異丙醇的混 合液可以有效脫去粗制的魷魚肝臟蛋白中的脂類，獲得純度更高的魷魚肝臟蛋白。
[0014] 作為優(yōu)選，所述步驟（3)中，復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分 別為 35 ~40%、35 ~40%、20 ~30%。
[0015] 作為優(yōu)選，在所述步驟（5)失活的酶解液離心之前，采用保加利亞乳桿菌和瑞士 乳桿菌混合菌對(duì)酶解液進(jìn)行脫腥處理，處理?xiàng)l件為：接種量占酶解液質(zhì)量3~8%，發(fā)酵溫 度為35~45°C，發(fā)酵時(shí)間為3~6h。魷魚內(nèi)臟本身具有很濃的腥味，采用酶解法獲得的酶 解液不可避免的帶有腥味，為了提高魷魚肝臟蛋白活性肽的應(yīng)用價(jià)值，有必要對(duì)酶解液進(jìn) 行脫腥處理。本發(fā)明采用保加利亞乳桿菌和瑞士乳桿菌協(xié)同作用于酶解液，能較好的脫除 酶解液的腥味。
[0016] 作為優(yōu)選，所述保加利亞乳桿菌和瑞士乳桿菌的菌種質(zhì)量比為1:0. 5~1:1. 5。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用混合酶酶解魷魚肝臟蛋白，由于不同的酶底物 特異性不同，相對(duì)于一種酶，魷魚肝臟蛋白在混合酶的作用下能夠水解的更充分，因而最終 獲得的活性肽分子量更低，更易于人體吸收；本發(fā)明采用混合菌種對(duì)酶解液進(jìn)行脫腥處理， 有效改善了魷魚肝臟蛋白活性肽的腥味，提高了其感官價(jià)值；同時(shí)本發(fā)明將魷魚肝臟廢棄 物進(jìn)行深加工，不僅改變了當(dāng)前魷魚肝臟加工利用率低造成魷魚資源浪費(fèi)的現(xiàn)狀，而且減 少了廢物排放，減輕了環(huán)境治理的負(fù)擔(dān)。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明。
[0019] 本發(fā)明使用的復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶均購于諾維信（中國）生物技 術(shù)有限公司；保加利亞乳桿菌和瑞士乳桿菌購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 一種混合酶酶解制備魷魚肝臟蛋白ACE抑制肽的方法，具體包括以下步驟：
[0022] (1)魷魚肝臟預(yù)處理：將魷魚肝臟絞碎與水按質(zhì)量比1:1混合，在35°C下加入 6mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7,保溫20min，然后升溫至70°C，反應(yīng)lh，加入占肝臟重 量2%的氯化鈉，鹽析5min，以4000r/min離心15min，去掉上層魚油，得到粗制的魷魚肝臟 蛋白；
[0023] (2)魷魚肝臟蛋白脫脂：將粗制的魷魚肝臟蛋白脫水后，按料液比lg:3mL加入正 己烷和異丙醇的混合液（其中正己烷和異丙醇的體積比為4:3)，洗滌2次，真空干燥得到脫 脂魷魚肝臟蛋白；
[0024] (3)混合酶酶解：將脫脂魷魚肝臟蛋白配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的水溶液，調(diào)節(jié)pH至 6. 5,加入占脫脂魷魚肝臟蛋白質(zhì)量1 %的混合蛋白酶，在40°C的水浴鍋中水解10h，混合蛋 白酶由復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶組成，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為35%、35%、30 %;
[0025] (4)酶滅活：酶解結(jié)束后，以100°C水浴加熱lOmin，使酶失活；
[0026] (5)離心：失活的酶解液在4000r/min條件下離心20min，取上清液，冷凍干燥，凍 干的粉末即為魷魚肝臟蛋白ACE抑制肽。
[0027] 將得到的魷魚肝臟蛋白ACE抑制肽經(jīng)ACE抑制活性的測定，其對(duì)ACE活性的抑制 率為82%，感官評(píng)分為1。
[0028] 實(shí)施例2
[0029] 一種混合酶