CTGTGATTACC-3'，該引物位于同源臂下游，PCR產(chǎn)物大 小為8000bp。消化24孔板單克隆細胞，提取基因組，以野生型豬成纖維細胞基因組為陰性 對照，用KOD聚合酶對長、短臂進行擴增，0. 8%瓊脂糖電泳檢測結果。PCR鑒定結果分別如 圖4、圖5所示。其中陽性克隆為1個，狀態(tài)良好，適宜做核移植供體細胞。
[0067] 實施例4核移植胚胎構建及轉基因豬的制備
[0068] 克隆胚胎的構建與移植方法參照李秋艷（2008)、李?。?010)等人的博士論文中 的描述。具體如下：
[0069] 1.豬卵母細胞體外成熟
[0070] 從屠宰場取卵巢，放入28°C~35°C含青霉素和硫酸鏈霉素的生理鹽水中，在2h內 運回實驗室，用配有18號針頭的20mL注射器抽吸卵巢上3~6mm的卵泡。將抽取液放入 50mL離心管，37°C靜置15min去上清，加入沖卵液PVA-DPBS重懸沉淀，靜置15min，去上清。 將重懸液加入直徑60mm塑料培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下，用口吸管挑選胞質均勾，卵丘致 密且包裹2層以上的卵丘細胞-卵母細胞復合體（COCs)，用成熟培養(yǎng)液洗滌3次，轉入在培 養(yǎng)箱中已平衡2h以上的培養(yǎng)液滴內（每100液滴放25枚）。用胚胎級礦物油覆蓋，置于 39°C，5%C02，100%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)42~44h。
[0071] 2?體細胞準備
[0072] 利用血清饑餓法，將實施例3中獲得的打靶陽性細胞待其生長至80%匯合時，進 行血清饑餓處理，即把培養(yǎng)液中的FBS濃度從20 %降至0. 5 %繼續(xù)培養(yǎng)2~5天，常規(guī)消化， 離心洗滌，最后加ImL顯微操作液重懸細胞沉淀備用。
[0073] 3?卵母細胞去核與核移植
[0074] 利用盲吸法進行成熟卵母細胞去核，把供體細胞以及成熟卵母細胞同時轉入 39°C，5%C02，100%濕度的培養(yǎng)箱平衡lOmin，然后在裝配有顯微操作儀及恒溫臺的倒置顯 微鏡上用固定吸管吸持卵母細胞，用去核/注射針吸取第一極體及其附近可能含有卵母細 胞核的胞質。然后挑選折光性強、表面光滑的體細胞，從去核時裂口處放入卵周隙，用注射 針點壓透明帶。每批操作30個卵母細胞，結束后將供體細胞-卵胞質構成的重構卵轉移到 培養(yǎng)液PZM3中，在39°C，5%C02,100%濕度的培養(yǎng)箱中恢復lh。
[0075] 4?融合與激活
[0076] 將恢復好的重構卵轉移到融合液中平衡2min，用融合/激活液洗滌3遍，每批 5~8個放入已經(jīng)鋪滿融合液的融合槽中，使供體細胞一受體卵細胞膜接觸面與電極平行， 100ys，I. 4kv/cm的直流電脈沖誘導融合，用PZM3培養(yǎng)液洗滌3遍，立即轉入礦物油覆蓋的 胚胎培養(yǎng)液中，放入39°C，5%C02,100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，在體視顯微鏡下判定融合。
[0077] 5?胚胎培養(yǎng)
[0078] 將融合的重構胚用胚胎培養(yǎng)液洗滌5遍，轉入預平衡2h以上的胚胎培養(yǎng)液PZM3 中，在39°C，5%C02,90%N2,飽和濕度條件下培養(yǎng)至48h和168h時，記錄卵裂和囊胚情況。
[0079] 6?胚胎移植
[0080] 用公豬試情結合壓背反應，挑選自然發(fā)情母豬。用刀片將手術切口部位（尾部倒 數(shù)第2對和第3對乳頭之間）的毛刮干凈，用碘酒棉球消毒2min，再用酒精棉球脫碘。鋪上 創(chuàng)巾，沿腹中線方向切開7~IOcm的切口，鈍性分離肌肉組織和脂肪組織。用兩把止血鉗 固定住腹膜后，在之間將腹膜切開，用手指將子宮夾出，并導出卵巢查看排卵情況。同時，將 克隆胚胎從保溫箱中取出，在顯微鏡下，將胚胎轉移至胚胎移植管中，盡量少帶培養(yǎng)液。然 后將胚胎移植管從輸卵管傘口探入輸卵管至少5cm大致壺腹-峽部結合處，將克隆胚胎緩 慢注射到輸卵管中。將子宮和輸卵管回位，分別對腹膜、白膜、肌肉層和皮層進行縫合，并用 碘酒消毒傷口。術后第10天，肌肉注射800IUhGG，第13天注射500IUPMSG。30天后，B 超檢測是否妊娠。
[0081] 克隆豬出生后，采用實施例3中的PCR方法對克隆豬進行鑒定，確定其為4-1BB轉 基因豬。
[0082] 上述結果表明，本發(fā)明已成功獲得上調表達共刺激受體4-1BB分子轉基因豬。本 發(fā)明提供的4-1BB轉基因豬，其T淋巴細胞高表達4-1BB受體，可以增強在受到抗原刺激時 的活化、增殖和效應功能，進而增強宿主的適應性免疫應答，增強疫苗免疫效果。
[0083] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、【具體實施方式】及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描 述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見 的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的 范圍。
【主權項】
1. 一種4-1BB基因的同源重組載體，其特征在于，通過以下方法制備得到：以目標生物 基因組為模板，PCR擴增左右同源臂，4-1BB表達框，胚胎期特異性調控元件0CT4 ;將同源左 臂、4-1BB表達框、含LoxP位點的0CT4調控的Cre表達框和Neo表達框、同源右臂、負篩選 DTA依次連接，得到4-1BB同源重組載體。2. 如權利要求1所述的同源重組載體，其特征在于，所述的目標生物為豬；通過以下步 驟制備得到： (1) 以pd2EYFP-Nl為載體骨架，利用NdeI和KpnI插入豬rosa26基因內含子1的同源 左臂，同時引入EcoRv酶切位點； (2) 利用EcoRV和KpnI插入4-1BB表達框； (3) 利用EcoRI和NotI將Neo表達框與Cre基因連接起來，再利用NdeI和NotI將其 連在 0CT4 啟動子下游，組成 LoxP-0CT4-Cre-3' utr-SV40-Ne〇-3' utr-LoxP，利用 KpnI 和 NotI將上述雙框連到含4-1BB的骨架載體上，同時引入AscI酶切位點； (4) 利用AscI和PacI插入豬rosa26基因內含子1的同源右臂； (5) 利用PacI和NotI插入DTA表達框，構建成p4B0CNDR同源重組載體。3. 如權利要求2所述的同源重組載體，其特征在于，所述同源左臂為豬基因組rosa26 位點內含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述同源右臂是rosa26位點內含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 示； 所述4-1BB表達框的序列如SEQ ID NO. 3所示； 所述Cre表達框的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，由胚胎期特異性啟動子0CT4調控。4. 如權利要求2所述的同源重組載體，其特征在于，Neo為正篩選標記，其核苷酸序列 如SEQ ID NO. 5所示；所述DTA為負篩選標記，如SEQ ID NO. 6所示。5. 如權利要求3所述的同源重組載體，其特征在于，用于PCR擴增豬rosa26基因內含 子1的同源左臂的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7-8所示； 用于PCR擴增豬rosa26基因內含子1的同源右臂的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9-10 所示； 用于PCR擴增4-1BB表達框的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO. 11-12所示； 用于PCR擴增0CT4啟動子的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13-14所示； 用于PCR擴增Cre的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15-16所示。6. 權利要求1-4任一所述的同源重組載體在制備抗病轉基因豬中的應用。7. 特異性靶向豬rosa26基因內含子1的sgRNA，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO. 21所示或如SEQ ID NO. 22所示。8. 含有權利要求7所述SgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶載體。9. 如權利要求8所述的CRISPR/Cas9打靶載體，其通過以下方法制備得到，將SEQ ID NO. 21、22所示的寡聚核苷酸在94°C，5min，再37°C，lOmin，然后4°C，5min ;pX330骨架載體 用限制性內切酶Bbs I進行酶切過夜，回收后，與退火的寡聚核苷酸連接。10. -種4-1BB轉基因豬的制備方法，其特征在于，將權利要求1-5任一所述的4-1BB 基因的同源重組載體與權利要求8-9任一所述的CRISPR/Cas9打靶載體共轉入豬胎兒成纖 維細胞中，獲得經(jīng)鑒定為定點整合4-1BB基因的陽性細胞；以陽性細胞為核移植供體細胞， 卵母細胞為核移植受體細胞，通過體細胞核移植技術獲得克隆胚胎；將克隆胚胎移入豬子 宮內妊娠獲得在rosa26基因第一個內含子定點整合有4-1BB基因且自動刪除標記基因的 轉基因豬。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種過表達豬共刺激受體4-1BB載體及其應用。PCR擴增rosa26基因內含子1左右同源臂，4-1BB調控序列，OCT4特異啟動子；將同源左臂、4-1BB表達框、含LoxP位點的Cre、Neo表達框、同源右臂、負篩選DTA依次連接，得到4-1BB同源重組載體p4BOCNDR。將該載體與含特異性靶向豬rosa26基因內含子1的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶載體共轉入豬胎兒成纖維細胞中，以陽性細胞為供體細胞，卵母細胞為受體細胞，通過體細胞核移植技術獲得克隆胚胎；將克隆胚胎移入豬子宮內妊娠獲得在rosa26基因第一內含子定點整合有4-1BB基因且自動刪除標記基因的轉基因豬。
【IPC分類】C12N15/85, A01K67/027, C12N15/66
【公開號】CN105087620
【申請?zhí)枴緾N201510547191
【發(fā)明人】李秋艷, 索勛, 黃廣平, 李志遠, 李向清, 劉賢勇, 付怡靜, 王一丁, 田秀玲, 索靜霞, 胡丹丹
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月31日