一種過表達豬共刺激受體4-1bb載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物基因工程和基因遺傳修飾領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)進行的4-1BB基因修飾方法以及4-1BB轉(zhuǎn)基因豬的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 哺乳動物及其它脊椎動物在應(yīng)對外界各種病原微生物侵襲及排除異物維持自身 平衡的過程中，逐漸形成了強有力的免疫保護屏障。包括體液免疫和細(xì)胞免疫。T細(xì)胞是 大多數(shù)免疫反應(yīng)的核心。識別特異性抗原后，T細(xì)胞被活化、增殖、分化，從而具有效應(yīng)功能 或輔助作用。初始(NaYve)T細(xì)胞的活化需要來自抗原遞呈細(xì)胞的兩種刺激信號。第一種 是TCR/Q33與抗原遞呈細(xì)胞（Antigenpresentingcells,APCs)表面特異的MHC-抗原肽 復(fù)合物結(jié)合產(chǎn)生的特異性的抗原刺激信號；第二種是由T細(xì)胞表面的共刺激受體分子和抗 原遞呈細(xì)胞（APCs)表面相應(yīng)的配體結(jié)合產(chǎn)生的非特異性的刺激信號。如果缺失第二種信 號，TCR與抗原肽的識別通常導(dǎo)致T細(xì)胞的凋亡或無能狀態(tài)（Anergy)。
[0003] 4-1BB存在于初始(Na〗've>CD4+T和CD8+T細(xì)胞表面，與APCs表面的4-1BBL配體 結(jié)合，為T細(xì)胞的存活、增殖與分化提供重要的共刺激信號。研究表明，4-1BB信號途徑不僅 能夠有效誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)抗腫瘤，控制病毒感染，而且在調(diào)節(jié)自身免疫性疾病、移植排斥反 應(yīng)以及炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。此外，基于小鼠和豬模型發(fā)現(xiàn)，4-1BB在體外、體內(nèi)均 能夠刺激T細(xì)胞的激活、增殖和效應(yīng)功能，是潛在的廣譜抗病基因。
[0004] 作為養(yǎng)豬大國，豬病疫情嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬企業(yè)的擴張與發(fā)展。在我國，豬場常發(fā)的 傳染性疾病，如藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒II型感染、豬流感、豬瘟、豬氣喘病、豬大腸桿菌病和豬 附紅細(xì)胞體病等，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的危害。然而，我國豬用疫苗的應(yīng)用尚存在許多問題， 如副反應(yīng)較大，免疫效果不理想等。而4-1BB的生物學(xué)功能，提示可以通過轉(zhuǎn)基因的手段增 強豬群的抗病能力。
[0005]CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/ Cas(CRISPR-associated)系統(tǒng)是一種原核生物特有的針對外源性遺傳物質(zhì)的免疫系統(tǒng)，通 過序列特異的RNA介導(dǎo)，切割降解外源性DNA，包括噬菌體和外源質(zhì)粒。CRISPR/Cas系統(tǒng) 可以作為一種具有位點特異性的基因編輯系統(tǒng)，其最大的特點是操作簡單、成本低、作用高 效。2013年，科學(xué)家首次報道CRISPR/Cas系統(tǒng)在細(xì)胞上應(yīng)用成功，隨后，在斑馬魚、果蠅、小 鼠、大鼠、豬中迅速得到應(yīng)用。CRISPR/Cas系統(tǒng)在靶位點產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（doublestrand break,DSB),細(xì)胞可通過非同源末端連接（non-homologousendjoining,NHEJ)進行修復(fù)， 導(dǎo)致基因發(fā)生移碼突變，喪失功能。除此之外，該系統(tǒng)還能與同源重組載體、寡聚核苷酸共 同作用，使靶基因發(fā)生高效的精確修飾。2014年，ScottJG等利用CRISPR/Cas介導(dǎo)的同源 重組在斑馬魚上實現(xiàn)了基因的替換。HuiYang等利用相同的策略一步獲得了帶有報告基因 的小鼠。CRISPR/Cas系統(tǒng)憑借其巨大優(yōu)勢迅速成為基因編輯工具中的佼佼者，在基因功能 研究、疾病模型、基因治療等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種過表達4-1BB基因的同源重組載體及其應(yīng)用，即通過基 因工程手段增加宿主4-1BB基因的拷貝數(shù)，從而降低T細(xì)胞活化的閾值，增強T細(xì)胞的效應(yīng) 功能，達到廣譜抗病效果。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是利用CRISPR_Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)同源重組4-1BB基因修飾以獲得 4-1BB轉(zhuǎn)基因抗病豬。
[0008] 本發(fā)明提供的一種4-1BB基因的同源重組載體，通過以下方法制備得到：以目標(biāo) 生物基因組為模板，PCR擴增左右同源臂，4-1BB表達框，胚胎期特異性調(diào)控元件0CT4;將同 源左臂、4-1BB表達框、含LoxP位點的0CT4調(diào)控的Cre表達框和Neo表達框、同源右臂、負(fù) 篩選DTA依次連接，得到4-1BB同源重組載體。
[0009] 進一步地，本發(fā)明提供的4-1BB基因的同源重組載體，其目標(biāo)生物為豬；通過以下 步驟制備得到：
[0010] (1)以pd2EYFP-Nl為載體骨架，利用NdeI和KpnI插入豬rosa26基因內(nèi)含子1的 同源左臂，同時引入EcoRv酶切位點；
[0011] (2)利用EcoRV和KpnI插入4-1BB表達框；
[0012] (3)利用EcoRI和NotI將Neo表達框與Cre基因連接起來，再利用NdeI和NotI 將其連在 0CT4 啟動子下游，組成LoxP-0CT4-Cre-3'utr-SV40-Ne〇-3'utr-LoxP，利用KpnI 和NotI將上述雙框連到含4-1BB的骨架載體上，同時引入AscI酶切位點；
[0013] (4)利用AscI和PacI插入豬rosa26基因內(nèi)含子1的同源右臂；
[0014] (5)利用PacI和NotI插入DTA表達框，構(gòu)建成p4B0CNDR同源重組載體。
[0015] 在p4B0CNDR同源重組載體中，4B代表豬共刺激受體分子4-1BB基因；0代表豬早 期胚胎發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子0CT4的特異性啟動子；C代表編碼重組酶Cre基因；N代表真核細(xì)胞常 用的藥物篩選標(biāo)記基因Neo ;D代表負(fù)篩選白喉毒素A基因DTA ;R代表插入位點rosa26基 因。
[0016] 所述同源左臂為豬基因組rosa26位點內(nèi)含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 1 所示；
[0017] 所述同源右臂是rosa26位點內(nèi)含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQIDNO. 2 所示；
[0018] 所述4-IBB表達框的序列如SEQIDNO. 3所示；
[0019] 所述Cre表達框的核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示，由胚胎期特異性啟動子0CT4 調(diào)控。
[0020]Neo為正篩選標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示；所述DTA為負(fù)篩選標(biāo)記， 如SEQIDNO. 6 所示。
[0021] 本發(fā)明的4-1BB基因的同源重組載體，用于PCR擴增豬r〇sa26基因內(nèi)含子1的同 源左臂的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO. 7-8所示；
[0022] 用于PCR擴增豬rosa26基因內(nèi)含子1的同源右臂的引物對的核苷酸序列如SEQ IDNO. 9-10 所示；
[0023] 用于PCR擴增4-1BB表達框的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO. 11-12所示；
[0024] 用于PCR擴增0CT4啟動子的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO. 13-14所示；
[0025] 用于PCR擴增Cre的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO. 15-16所示。
[0026] 用于PCR擴增Neo的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO. 17-18所示；
[0027] 用于PCR擴增DTA的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO. 19-20所示。
[0028] 本發(fā)明提供了同源重組載體P4B0CNDR在制備抗病轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明提供了特異性靶向豬rosa26基因內(nèi)含子1的SgRNA，其DNA序列如SEQID NO. 21所示或如SEQIDNO. 22所示。二者為互補配對的寡聚核苷酸。
[0030] 本發(fā)明提供了含有上述SgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶載體。
[0031] 本發(fā)明的含有上述CRISPR/Cas9打靶載體，其通過以下方法制備得到，將SEQID NO. 21、22所示的寡聚核苷酸在94°C，5min，再37°C，10min，然后4°C，5min;pX330骨架載體 用限制性內(nèi)切酶BbsI進行酶切過夜，回收后，與退火的寡聚核苷酸連接。
[0032] 進一步地，本發(fā)明提供了一種4-1BB轉(zhuǎn)基因豬的制備方法，將本發(fā)明的4-1BB基因 的同源重組載體與本發(fā)明的含有上述的sgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶載體共轉(zhuǎn)入 豬胎兒成纖維細(xì)胞中，獲得經(jīng)鑒定為定點整合4-1BB基因的陽性細(xì)胞；以陽性細(xì)胞為核移 植供體細(xì)胞，卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得克隆胚胎；將克隆胚 胎移入豬子宮內(nèi)妊娠獲得在rosa26基因第一個內(nèi)含子定點整合有4-1BB基因且自動刪除 標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因豬。
[0033] 上述方法中，鑒定定點整合4-1BB基因的陽性細(xì)胞的PCR方法使用的引物為：
[0034]短臂引物SF:5'-CGCACCCTTACCTTGTCCCA-3'（SEQIDNO. 23)，該引物位于同源臂 上游；短臂引物SR:5' -GAAGGTGGGATGGAGGGTGA-3'（SEQIDNO. 24)，該引物位于 4-1BB啟 動子上，PCR產(chǎn)物大小為2500bp。
[0035]長臂引物L(fēng)F:5' -ACCGCTTCCTCGTGCTTTAC-3'（SEQIDNO. 25)，該引物位于Neo基 因上；長臂引物L(fēng)R:5' -AGCTGCCTCCTGTGATTACC-3'（SEQIDNO. 26)，該引物位于同源臂下 游，PCR產(chǎn)物大小為8000bp。
[0036] 本發(fā)明首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)4-1BB基因同源重組，增加宿主4-1BB基 因的拷貝數(shù)，從而降低宿主T細(xì)胞活化的閾值，增強T細(xì)胞的效應(yīng)功能。該方法成本低，大幅 縮短獲得純合子豬的時間，并保證目的基因表達不受基因編輯的影響，為利用CRISPR/Cas9 技術(shù)介導(dǎo)4-1B