模式識別受體rig-i在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，本發(fā)明從基因芯片中篩選出了腫瘤表達(dá)相關(guān)性及其對癌細(xì)胞生長具有調(diào)控作用的分子—模式識別受體RIG-I，由此本發(fā)明進(jìn)一步提供了模式識別受體RIG-I在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該應(yīng)用具體是指模式識別受體RIG-I與干擾素α聯(lián)用。本發(fā)明為腫瘤治療提供了新思路。
【專利說明】模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，具體涉及模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在病原生物感染機(jī)體的過程中，機(jī)體的固有免疫應(yīng)答首先被激活。固有免疫應(yīng)答的激活主要依賴于機(jī)體免疫細(xì)胞表面的模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)對病原生物特有成分的識別。目前發(fā)現(xiàn)的PRR主要分為三類:1、TLRs (Toll-likereceptors) ;2、RLHs (RIG-1-like helicases) ;3、NLRs (Nucleotide-oligomerizationdomain-like receptors)。在抗病毒固有免疫應(yīng)答的過程中，病毒成分如DNA或RNA等能夠被免疫細(xì)胞的TLRs和RLHs識別，進(jìn)而活化下游信號途徑，促使免疫細(xì)胞活化并表達(dá)促炎癥細(xì)胞因子和I型干擾素，提高細(xì)胞的抗病毒活性并能促使病毒感染細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮清除病毒感染的作用(Takeuchi, 0 等，MDA5/RIG-1 and virus recognition.Curr Op inImmunol.2008, 20:17-22)。
[0003]RLHs是細(xì)胞內(nèi)識別病毒RNA的主要受體，主要有兩個成員:RIG_I (retinoicacid-1nducible gene I)和 MDA5(melanoma differentiation-associated gene5)。RLHs的分子結(jié)構(gòu)由兩部分組成:N端的CARDs (caspase-recruitment domains)和C端的RNA解螺旋酶結(jié)構(gòu)域。RNA解螺旋酶結(jié)構(gòu)域主要司職病毒RNA的識別，其結(jié)構(gòu)與Dicer酶相似。CARDs結(jié)構(gòu)域主要司職與下游接頭分子結(jié)合，進(jìn)而傳導(dǎo)活化信號。在病毒感染或I型干擾素刺激的條件下，RLHs的表達(dá)能夠被顯著活化，進(jìn)而發(fā)揮增強(qiáng)病毒RNA識別及活化其下游抗病毒信號途徑的作用，達(dá)到清除病毒感染的目的(Meylan E等，Toll-likereceptors and RNA helicases:two parallel ways to trigger antiviral responses.Mol Cell.2006, 22:561-569)。
[0004]以往研究認(rèn)為，RIG-1主要識別病毒復(fù)制的產(chǎn)物dsRNA。然而，目前研究表明，5’端磷酸化的病毒RNA才是RIG-1識`別的主要配體。事實(shí)上，絕大多數(shù)胞內(nèi)感染病毒來源的RNA5’端都要經(jīng)過磷酸化修飾，RIG-1也正是通過識別RNA的5’端是否有磷酸化修飾來區(qū)分來源于自我和非我的RNA。然而，機(jī)體自身表達(dá)的RNA最初也有5’端的磷酸化修飾，但自身RNA表達(dá)都須在核內(nèi)進(jìn)行剪切或修飾，如mRNA需在5’端進(jìn)行甲基化加帽修飾、tRNA需經(jīng)過5’端的剪切、核糖體RNA需與核糖體蛋白結(jié)合等。因此，在正常情況下機(jī)體自身來源的RNA均不會在胞漿中激活RIG-1信號。但是，機(jī)體內(nèi)仍存在少量5’端磷酸化的自身RNA，這些自身RNA如何實(shí)現(xiàn)逃避RIG-1識別的機(jī)制還不十分清楚(YoneyamaΜ 等，F(xiàn)unction of RIG-1-like receptors in antiviral innate immunity.J BiolChem.2007, 282:15315-15318)。此外，RIG-1和MDA5雖然同為RLHs家族病毒RNA識別受體，但它們識別的病毒種類不盡相同。RIG-1主要識別的病毒包括水泡性口炎病毒(VSV)、新城雞瘟病毒(NDV)、仙臺病毒(SeV)、流感病毒(influenza virus)和乙型腦炎病毒(JEV)等；而MDA5主要識別小核糖核酸病毒，包括腦心肌炎病毒(EMCV)、腦脊髓炎病毒(Theiler’ svirus)和門戈病毒(Mengo virus)等(Kato H 等，Differential roles of MDA5and RIG-1helicases in the recognition of RNA viruses.Nature.2006，441:101-105)。
[0005]RIG-1通過其C端解螺旋酶結(jié)構(gòu)域識別病毒RNA后，分子構(gòu)像發(fā)生改變，暴露N端的CARDs結(jié)構(gòu)域，并與下游位于線粒體膜表面的接頭分子IPS-1 (IFN- β promoterstimulator)結(jié)合。IPS-1 亦稱為 MAVS (mitochondrial antiviral signaling)或 VISA(virus-1nduced signaling adaptor),其活化后與 TRAF3 (tumor necrosis factorreceptor-associated factor3)結(jié)合并活化下游兩條主要的信號通路:一是通過結(jié)合FADD(Fas-associated death domain-containing protein)進(jìn)而活化下游轉(zhuǎn)錄因子 NF_ κ B,激活促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)；二是通過活化TBK-1 (TANK binding kinase-1)進(jìn)而活化下游的IRF3和IRF7，促使細(xì)胞表達(dá)I型干擾素(Takeuchi等，MDA5/RIG-1 and virusrecognition.Curr Opin Immunol.2008, 20:17-22)。
[0006]RIG-1信號通路受胞內(nèi)調(diào)控蛋白的精確調(diào)控，主要分為正向調(diào)控蛋白和負(fù)向調(diào)控蛋白兩大類。正向調(diào)控蛋白一般直接參與了 RIG-1信號的活化，起到增強(qiáng)RIG-1信號并抑制病毒復(fù)制的作用，如 TRIM25(tripartite motif25)>RNF135(ring-finger proteinl35)等。負(fù)相調(diào)控蛋白起抑制RIG-1信號傳導(dǎo)的作用，避免因RIG-1信號過度活化導(dǎo)致的炎癥損傷。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RIG-1信號通路的負(fù)向調(diào)控蛋白有數(shù)十種，主要分為來源于機(jī)體自身表達(dá)的胞內(nèi)調(diào)控蛋白和來源于病毒表達(dá)的蛋白分子兩類(Komuro A等,Negative regulation ofcytoplasmic RNA-mediated antiviral signaling.Cytokine.2008，43:350-358)。前者主要包括 LGP2 (laboratory of genetics and physiology-2)、A20、Pinl、SIKE (suppressorof IKK ε )、Atg5-Atgl2、RNF125 (ring-finger proteinl25)、DUBA (deubiquitinatingenzyme A)、CYLD(cylindromatosis)、NLRX1(nucleotide-binding domain andleucine-rich repeat XI)、gClqR 和 ISG15 (IFN stimulated genel5)等。后者由病毒自身表達(dá)能夠通過許多巧妙的機(jī)制躲避和抑制宿主抗病毒固有免疫的識別與清除。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分被RLHs所識別的病毒能夠利用自身表達(dá)的蛋白負(fù)向調(diào)控RLHs下游信號通路，抑制干擾素的產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。具體為:流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1能夠直接結(jié)合RIG-1并抑制其功能；丙型肝炎病毒(HCV)表達(dá)的NS3-4A蛋白和甲型肝炎病毒(HAV)表達(dá)的3ABC蛋白能夠裂解IPS-1 ;埃博拉病毒(Ebola virus)的VP35蛋白和呼吸道合胞病毒virus的NS1、NS2蛋白能夠抑制IRF3的磷酸化；牛痘苗病毒(VACV)表達(dá)的E3L、N1L和K7R能夠抑制RIG-1的識別和下游信號等(Bowie AG等，Viral evasion and subversionof pattern-recognition receptor signalling.Nat Rev Immunol.2008，8:911-922)。
[0007]RIG-1信號通路的活化是機(jī)體I型干擾素表達(dá)的重要途徑，在抗病毒固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是機(jī)體抵御病毒感染的重要信號途徑。目前，關(guān)于RIG-1信號通路的調(diào)控機(jī)制以及病毒與宿主RIG-1信號的相互作用研究是固有免疫應(yīng)答乃至免疫學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。明確RIG-1信號的調(diào)控機(jī)制對于深刻理解機(jī)體抗病毒固有免疫應(yīng)答，探求病毒感染性疾病的發(fā)病過程及其與機(jī)體的相互作用關(guān)系，達(dá)到預(yù)防與治療病毒性疾病的目的，具有重要意義。
[0008]由于癌癥是危害人類健康的主要疾病之一，為了有效地治療和預(yù)防腫瘤(如肝細(xì)胞癌)，目前人們已經(jīng)越來越關(guān)注腫瘤的早期診斷和預(yù)后。
[0009]以原發(fā)性肝癌(即原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC))為例，該疾病是我國常見的惡性腫瘤，患者死亡率在所有惡性腫瘤中居第三位。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，全球每年新增約60萬HCC患者，而每年死于肝癌的人數(shù)也約為60萬。HCC的發(fā)生是一個多步驟漸進(jìn)的過程，和慢性肝炎及肝硬化緊密相關(guān)。我國約有1.2億乙肝病毒攜帶者，占全球感染人數(shù)的1/3。HCC根治術(shù)后5年的復(fù)發(fā)率約為60-70%，其中術(shù)后1年的復(fù)發(fā)率所占比例高達(dá)51.4-72.3%，即使是小肝癌獲根治性切除后的5年復(fù)發(fā)率也達(dá)30-40%。因此術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為進(jìn)一步提高肝癌治療效果的主要障礙。
[0010]術(shù)后灌注化療轉(zhuǎn)移等治療方法有可能降低肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率，但是一些長期研究顯示采用這些術(shù)后化療后患者的生存率反而相對與未行化療的患者降低。這些現(xiàn)象提示術(shù)后具有較高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險的患者可能會受益于這些術(shù)后治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險較低的患者采用這些術(shù)后治療可能會適得其反。如果能夠通過有效的預(yù)測方法預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險高的患者，就可以通過一系列的干預(yù)預(yù)防措施，降低復(fù)發(fā)率，延長患者的生存期。
[0011]因此，如何有效的診斷和干預(yù)HCC的發(fā)生并適應(yīng)性地選擇治療HCC患者的方法是一個緊迫的重要問題。
[0012]用臨床指標(biāo)(如TW分級、肝硬化程度)和單個分子指標(biāo)(如AFP、MMP)預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)有較長的歷史。但是，臨床指標(biāo)或者病理類型相似的患者卻有截然不同的臨床結(jié)局，所以用臨床指標(biāo)或者單獨(dú)的分子標(biāo)志來預(yù)測或評價患者難以取得滿意的效果。對腫瘤實(shí)行個體化、預(yù)見性的治療有助于更加深入理解臨床病理學(xué)特征，改善對患者的臨床處理，從而提高腫瘤患者的無瘤生存期及絕對生存期。確定肝癌相關(guān)基因及其參與肝癌發(fā)病機(jī)理，可為肝癌個體化預(yù)見性治療提供基礎(chǔ)，也為新的治療方案提供靶點(diǎn)，從而有利于提高 HCC 的治愈率(Thorgeirsson, S.等，Hunting for tumor suppressor genes inliver cancer (月干癌中腫瘤抑制基因的探索).Hepatology.2003; 37:739-741)。
[0013]目前，由腫 瘤基因表達(dá)模式所回顧的分子模擬，已經(jīng)被用于確定不同的癌癥類型包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和腦瘤的預(yù)后的新的分子標(biāo)準(zhǔn)。
[0014]1999年，Tamayo等率先利用基因芯片技術(shù)對急性白血病進(jìn)行研究，根據(jù)腫瘤的基因表達(dá)譜對白血病進(jìn)行分型，并根據(jù)所建立的模型對新的患者進(jìn)行腫瘤類型預(yù)測，從而為利用基因芯片對腫瘤的分類和預(yù)測開創(chuàng)了先河(Tamayo, P.等，Interpreting patternsof gene expression with self-organizing maps:methods and application tohematopoietic differentiation(具有自組織地圖的基因表達(dá)翻譯模式:造血分化的方法和應(yīng)用).Proc Natl Acad Sci USA.1999; 96:2907-12)。此后，類似的方法也用于對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和乳腺癌進(jìn)行分析預(yù)測。這些研究結(jié)果說明，基因芯片技術(shù)能夠從分子水平對腫瘤進(jìn)行更準(zhǔn)確的分類，并預(yù)測腫瘤亞型、預(yù)后和對治療的反應(yīng)性等特性。
[0015]Van’t Veer等基于70個基因的乳腺癌預(yù)后診斷模型和相關(guān)診斷用芯片MammqaPrint被FDA批準(zhǔn)上市，顯示出基于基因表達(dá)譜模型來基因疾病分型和預(yù)后判斷的良好前景。但是，基于微陣列的、由基因表達(dá)引起的HCC早期復(fù)發(fā)的預(yù)測的新近研究僅報道在一小組患者1年內(nèi)的肝內(nèi)復(fù)發(fā)并且使用6000個基因的基因芯片(Matoba，K.等，Tumor HLA-DR expression linked to early intrahepatic recurrence ofhepatocellular carcinoma (與肝細(xì)胞癌的早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)關(guān)聯(lián)的腫瘤HLA-DR表達(dá)).Int JCancer.2005; 115(2):231-40)。這就增加了 HCC預(yù)后判斷的復(fù)雜度，降低了可操作性。
[0016]雖然本領(lǐng)域中已知某些模式識別受體與腫瘤具有一定的相關(guān)性，如TLR4信號的活化促使胃癌惡化(X，Yuan 等，Activation of TLR4signaling promotes gastriccancer progression by inducing mitochondrial ROS production.Cell Death andDisease.2013;4，e794),幫助肺癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃逸(Weigang, H.等，TLR4signalingpromotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressivecytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology.2007;44(11):2850-2859) ;TLR3在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮促凋亡作用(Salaun B.等，TLR3can directly triggerapoptosis in human cancer cells.J Immunol.2006; 176:4894-4901)。但本領(lǐng)域中已知的PRR功能各異，要從中篩選出與腫瘤相關(guān)且可作為發(fā)病、治療方案選擇和預(yù)后指標(biāo)的特定PRR存在較大的難度。
[0017]目前，國內(nèi)外尚無有關(guān)模式識別受體RIG-1與腫瘤相關(guān)性的研究報道。
[0018]而本領(lǐng)域迫切需要尋找到可有效用于腫瘤診斷、腫瘤治療方案選擇、腫瘤預(yù)后評估的PRR分子，并將其用于這些用途中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]本發(fā)明的目的在于尋找到可有效用于腫瘤診斷、腫瘤治療方案選擇、腫瘤預(yù)后評估的PRR分子，本發(fā)明的另一目的在于提供該P(yáng)RR分子在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明從基因芯片中篩選出了腫瘤(尤其是肝癌)表達(dá)相關(guān)性及其對癌細(xì)胞生長的具有調(diào)控作用的分子一模式識別受體RIG-1，由此本發(fā)明進(jìn)一步提供了 RIG-1分子在用于對象中腫瘤診斷、腫瘤治療方案選擇、腫瘤預(yù)后評估中的新用途。
[0021]本發(fā)明提供了模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0022]所述的模式識別受體RIG-1來自:人、大鼠、小鼠、犬、馬、牛、兔或猴等。
[0023]所述的模式識別受體RIG-1，Gene ID:23586。
[0024]所述的模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，該應(yīng)用具體是指模式識別受體RIG-1與干擾素a (IFN- α )聯(lián)用。
[0025]所述的模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，該應(yīng)用具體是指提高模式識別受:體RIG-1表達(dá)量的試劑與干擾素a (IFN-α)聯(lián)用。
[0026]所述的提高模式識別受體RIG-1表達(dá)量的試劑，包括但不限于:RIG_I分子、RIG-1分子作為活性物質(zhì)的組合物、含有RIG-1分子的載體(如質(zhì)粒)等。
[0027]所述的提高模式識別受體RIG-1表達(dá)量的試劑，具體的給藥方式可采取直接裸DNA注射法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法、復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法、PEG修飾蛋白藥物注射法、脂質(zhì)體包裹蛋白靜脈注射法、蛋白微球制劑皮下注射法等(Hickman MA.等，Gene expression following directinjection of DNA into liver.Hum Gene Ther.1994;12:1477-1483 ;Siddhesh D.等，DNA—based therapeutics and DNA delivery systems:A comprehensive review.The AAPSJournal.2005;7(1):61-77 ；Boulikas T.等，Nuclear localization signal peptides forthe import of plasmid DNA in gene therapy.1nternational Journal of Oncology。1997 ；l:301-309)o
[0028]所述的RIG-1分子，包括基因、蛋白。所述的RIG-1基因在對象體內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯為RIG-1蛋白產(chǎn)物。[0029]所述的腫瘤具體為肝癌，所述的肝癌選自:原發(fā)性肝癌、肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性肝癌、或繼發(fā)性肝癌等。
[0030]本發(fā)明經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示:在HCC細(xì)胞系SMMC-7721、BEL-7402中，干擾RIG-1的表達(dá)能夠抑制IFN-α對細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。RIG-1在體外能夠協(xié)助IFN-a發(fā)揮抑癌作用，從而提示RIG-1高表達(dá)的腫瘤患者可能對IFN-α治療有較好反應(yīng)。
[0031]瘤內(nèi)注射膽固醇偶聯(lián)的RIG-1 siRNA顯著影響了 IFN-a對腫瘤的生長和血清AFP的含量的抑制作用。RIG-1在體內(nèi)協(xié)助IFN-a發(fā)揮抑癌作用，從而提示RIG-1高表達(dá)的腫瘤患者可能對IFN-a治療有較好反應(yīng)。
[0032]本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者、腫瘤預(yù)后不良的患者，適于采用提高RIG-1分子的量的治療方法來優(yōu)化干擾素α治療腫瘤的療效。
[0033]所述的提高模式識別受體RIG-1表達(dá)量，具體指RIG-1分子的水平至少比正常對照值高10-50%，優(yōu)選20-40%，更優(yōu)選30-35%。
[0034]所述的正常對照值為:由非腫瘤的正常生物樣品(例如獲自該對象非腫瘤癌旁組織或正常組織的樣品)中測得的RIG-1分子水平、通過統(tǒng)計學(xué)確定的群體標(biāo)準(zhǔn)水平、或經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的水平。
[0035]在本發(fā)明中，正常對照值，是經(jīng)qRT-PCR檢測，，并使用SPSS17.0中的T test計算得到的值，具體為56。
[0036]本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究發(fā)現(xiàn):腫瘤患者的腫瘤組織中RIG-1分子的表達(dá)會顯著下調(diào)，且下調(diào)的幅度與患者的生存時間存在相關(guān)性，其低表達(dá)與患者的預(yù)后差顯著相關(guān)，從而證實(shí)了 RIG-1分子在腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后中起重要作用。發(fā)明人在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn):RIG-1分子可在體、內(nèi)外有效抑制腫瘤細(xì)胞的繁殖和生長，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。由此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 RIG-1分子在用于對象中腫瘤發(fā)展判斷、治療方案選擇和/或預(yù)后評估中的新用途，從而在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0037]如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上
由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”
屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0038]檢測試劑
[0039]如本文所用，術(shù)語“檢測試劑”或“檢測RIG-1分子的試劑”或“檢測生物樣品中模式識別受體RIG-1表達(dá)量的試劑”可互換使用，均是指特異性針對RIG-1分子，且可用于直接或間接檢測出RIG-1分子的存在和/或含量的試劑。
[0040] 由于RIG-1分子的序列在本領(lǐng)域中是已知的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可基于常規(guī)手段制備或通過市售獲得特異性針對RIG-1分子的試劑。例如，本發(fā)明中可用的檢測試劑包括但不限于:對RIG-1分子具有檢測特異性的探針、基因芯片、或PCR引物，如RIG-1分子的反義序列、本發(fā)明實(shí)施例中所用的SEQ ID N0:2-4所示的序列、寡核苷酸或其他引物序列。
[0041]為了便于檢測，本發(fā)明的檢測試劑還可帶有可檢測標(biāo)記，所述可檢測標(biāo)記包括但不限于:放射性同位素、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光部分、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、染料、金屬離子、配體(如，生物素或半抗原)等。
[0042]本發(fā)明的檢測試劑可存在于溶液中、固定于載體(如基片、吸附物)上或以其它本領(lǐng)域中常規(guī)的方式存在，只要該存在方式適于對生物樣品中RIG-1分子的檢測即可。例如，當(dāng)本發(fā)明的檢測試劑為核苷酸探針時，其可以生物芯片(或稱“微陣列”)的形式存在。
[0043]檢測試劑盒和生物樣品
[0044]本發(fā)明中還提供了一種檢測試劑盒，其包含:(i)檢測有效量的檢測RIG-1分子的一種或多種試劑；(ii)選自下組的一種或多種物質(zhì):容器、使用說明書、陽性對照物、陰性對照物、緩沖劑、助劑或溶劑，例如用于混懸或固定細(xì)胞的溶液，可檢測的標(biāo)簽或標(biāo)記，使核酸易于雜交的溶液，用于裂解細(xì)胞的溶液，或用于核酸純化的溶液。
[0045]本發(fā)明的檢測試劑盒中還可附有試劑盒的使用說明書，其中記載了如何采用試劑盒進(jìn)行檢測，和如何利用檢測結(jié)果對腫瘤發(fā)展進(jìn)行判斷、對治療方案進(jìn)行選擇和/或?qū)︻A(yù)后進(jìn)行評估。
[0046]采用本發(fā)明的試劑盒，可通過選自下組的各種方法(包括但不限于)檢測RIG-1分子:實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄PCR、生物芯片檢測法、DNA印跡法、或RNA印跡法或原位雜交法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際條件和需要對檢測方式進(jìn)行調(diào)整和改變。
[0047]生物芯片檢測法、DNA印跡法、RNA印跡法和原位雜交法可參考《分子印跡技術(shù)》劉朝奇等主編，化學(xué)工業(yè)出版社出版。
[0048]當(dāng)然，所述試劑盒還包含臨床上用于對象中腫瘤發(fā)展的判斷、治療方案的選擇和/或預(yù)后評估的其它試劑，以輔助或驗(yàn)證通過檢測RIG-1分子所得到的結(jié)果。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)具體需要進(jìn)行常規(guī)選擇。
[0049]如本文所用，術(shù)語“生物樣品”或“待測樣品”可互換使用，均是指獲自對象且用于RIG-1分子檢測的樣品。生物樣品可以是獲自對象的新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織、體液、血液、或細(xì)胞等，優(yōu)選為新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織。這些樣品可為切片、涂片、懸液、溶液、RNA提取物等適于檢測的各種形式存在，例如可在檢測前抽提組織或細(xì)胞中的總RNA。
[0050]腫瘤發(fā)展判斷、抗腫瘤藥物制備和/或預(yù)后評估
[0051]不受如下原理限制:本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)RIG-1分子可在體、內(nèi)外有效抑制腫瘤細(xì)胞的繁殖和生長，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。由此可推測RIG-1分子水平的下降與腫瘤的發(fā)生(從而用于判斷是否已患有腫瘤)、治療(可針對性地提高患者RIG-1分子的水平)和預(yù)后具有密切的聯(lián)系，從而可用作腫瘤發(fā)展判斷、抗腫瘤藥物制備和/或預(yù)后評估的標(biāo)志物。
[0052]通常，可利用本發(fā)明的檢測試劑盒，采用如下方法進(jìn)行腫瘤發(fā)展判斷、抗腫瘤藥物制備和/或預(yù)后評估:(a)從對象獲得待測樣品；(b)使待測樣品與本發(fā)明檢測試劑盒中的檢測試劑接觸；(c)檢測該待測樣品中RIG-1分子的水平，并將該水平與對照水平相比較；(d)根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行腫瘤發(fā)展判斷、抗腫瘤藥物制備和/或預(yù)后評估:如檢測結(jié)果顯示對象組織中的RIG-1分子的水平低于對照水平，則提示所述對象已患有腫瘤、適于采用提高RIG-1分子的量的治療方法來治療腫瘤、或腫瘤預(yù)后不良。
[0053]如本文所用，術(shù)語“對照水平”是指用作參照的RIG-1分子的水平，其包括但不限于:由同一對象的非腫瘤正常生物樣品(例如獲自該對象非腫瘤癌旁組織或正常組織的樣品)中測得的RIG-1分子水平、通過統(tǒng)計學(xué)確定的群體標(biāo)準(zhǔn)水平、或經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的水平。
[0054]可用于提示所述對象已患有腫瘤、適于采用提高RIG-1分子的量的治療方法來治療腫瘤、或腫瘤預(yù)后不良的水平差異可為:待測樣品中的RIG-1分子水平比對照水平低10-50%,優(yōu)選 20-40%，更優(yōu)選 30-35%。
[0055]提高RIG-1分子的量的治療方法包括但不限于:給予患者有效量的RIG-1分子、或包含上述活性物質(zhì)的組合物。可通過如下方法(例如但不限于)將這些物質(zhì)給予對象:直接裸DNA注射法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法或復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法。
[0056]如本文所用，術(shù)語“預(yù)后”是指預(yù)測疾病的可能病程和結(jié)局，其包括判斷疾病的特定后果(如康復(fù)，某種癥狀、體征和并發(fā)癥等其它異常的出現(xiàn)或消失及死亡)。本發(fā)明中所述的預(yù)后不良包括但不限于:生存期縮短、易發(fā)肝硬化、腫瘤數(shù)量增加快、腫瘤變大加快、門靜脈癌栓出現(xiàn)比例增加、TNM分級上升等。在預(yù)測了患者預(yù)后情況后，可結(jié)合提高RIG-1分子的量的治療方法改善患者的預(yù)后。
[0057]本發(fā)明的有益效果在于:
[0058]本發(fā)明揭示了 RIG-1分子在腫瘤發(fā)展判斷、抗腫瘤藥物制備和/或預(yù)后評估中的新用途，為RIG-1樣受體、乃至模式識別受體的研究和開發(fā)利用提供了新的思路和途徑；
[0059]本發(fā)明的RIG-1分子可有效用于腫瘤發(fā)展判斷、治療方案選擇和/或預(yù)后評估，從而為本領(lǐng)域提供了一種新穎的腫瘤診斷劑和/或治療劑，具有一定的臨床應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]圖1:HCC中RIG-1的表達(dá)與患者生存時間的相關(guān)性，將組1組2中對照患者，即未接受IFN-α治療的患者，以RIG-1表達(dá)中位數(shù)為界分為RIG-1高表達(dá)與低表達(dá)兩組，其中:
[0061]圖1A為無瘤生存時間的Kaplan-Meier生存曲線；
[0062]圖1B為總體生存時間的Kaplan-M`eier生存曲線；
[0063]P 值使用 SPSS17.0 中的 log-rank test 計算。
[0064]圖2:HCC中RIG-1的表達(dá)與患者IFN- α治療療效的相關(guān)性，其中:
[0065]圖2Α為組1患者、RIG-1高表達(dá)患者、RIG-1低表達(dá)患者總體生存時間的Kaplan-Meier 生存曲線；
[0066]圖2B為組2患者、RIG-1高表達(dá)患者、RIG-1低表達(dá)患者總體生存時間的Kaplan-Meier 生存曲線；
[0067]P 值使用 SPSS17.0 中的 log-rank test 計算。
[0068]圖3:RIG_I表達(dá)對IFN-α治療體外HCC實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷淖饔?。在肝癌?xì)胞系SMMC-7721、BEL-7402中，瞬時轉(zhuǎn)染對照RNA和RIG-1小干擾RNA，接著進(jìn)行IFN- α治療觀察療效，其中:
[0069]圖3A為細(xì)胞增殖的MTT法檢測結(jié)果；
[0070]圖3B和圖3C分別為用流式細(xì)胞法檢測的細(xì)胞凋亡結(jié)果；
[0071]結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=4) ;*，Ρ〈0.05 ;**，Ρ〈0.01。
[0072]圖4:RIG-1表達(dá)對IFN-α治療體內(nèi)HCC實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷淖饔?。其中?br> [0073]圖4A為荷瘤小鼠模型SMMC-LraM瘤內(nèi)注射膽固醇偶聯(lián)對照RNA和RIG-1干擾RNA，皮下注射PBS或IFN-a后腫瘤生長曲線；
[0074]圖4B為ELISA檢測血清中AFP含量；
[0075]圖4C為裸鼠皮下接種SMMC-7721正常細(xì)胞系和RIG-1干擾穩(wěn)篩細(xì)胞系，皮下注射PBS或IFN-α后腫瘤生長曲線；
[0076]結(jié)果顯示平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(n=4) ;*，Ρ〈0.05 ;**，Ρ〈0.01。
[0077]圖5:RIG_I體外有效協(xié)助凋亡相關(guān)IFN-α誘導(dǎo)基因的產(chǎn)生，在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、BEL-7402中，瞬時轉(zhuǎn)染對照RNA和RIG-1小干擾RNA，IFN- α刺激后檢測TRAIL、PML、XAF1、0AS1 的表達(dá)，結(jié)果顯示平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(n=4) ;*，Ρ〈0.05 ;**，Ρ〈0.01。
[0078]圖6:RIG-1體內(nèi)有效協(xié)助凋亡相關(guān)IFN-α誘導(dǎo)基因的產(chǎn)生，其中，
[0079]圖6A為荷瘤小鼠模型SMMC-LraM瘤內(nèi)注射膽固醇偶聯(lián)對照RNA和RIG-1干擾RNA，IFN- α刺激后TRAIL、PML的表達(dá)情況；
[0080]圖6B為野生型和RIG-1缺陷小鼠正常原代肝臟細(xì)胞，IFN- α刺激后TRAIL、PML的表達(dá)情況；
[0081]圖6C為DEN誘導(dǎo)HCC的野生型和RIG-1缺陷小鼠，IFN- α刺激后肝癌組織TRAIL、PML的表達(dá)情況；
[0082]結(jié)果顯示平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(n=4) ;*，Ρ〈0.05 ;**，Ρ〈0.01。
【具體實(shí)施方式】
[0083]現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0084]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室指南》(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0085]實(shí)施例1:檢測試劑盒的制備
[0086]按如下組成制備檢測試劑盒，該試劑盒適于以實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄PCR (qRT-PCR)方法檢測生物樣品中RIG-1的表達(dá):
[0087](a)裝有反轉(zhuǎn)錄酶(200U/ μ 1)的容器；
[0088](b)裝有RNA酶抑制劑(40U/ μ 1)的容器；
[0089](c)裝有反轉(zhuǎn)錄 5Χ 緩沖液(75mM KC1, 500mM Tris-Cl, ρΗ8.3，25 °C，3mMMgCl2, lOmM DTT)的容器；
[0090](d)裝有目的RIG-1分子PCR上游引物和下游引物(10 μ Μ)的容器:RIG_I反轉(zhuǎn)錄引物為:01igo (dT)；
[0091]定量PCR引物:
[0092]5，-TGT GCT CCT ACA GGT TGT GGA-3，(上游，SEQ ID N0:1)和
[0093]5，-CAC TGG GAT CTG ATT CGC AAA A_3，(下游，SEQ ID NO:2)；
[0094](e)裝有內(nèi)參反轉(zhuǎn)錄引物和PCR上游引物和下游引物(10 μ M)的容器:內(nèi)參β -actin的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物為:01igo (dT)；
[0095]定量PCR引物為:
[0096]5，-ACA ATG AGC TGC TGG TGG CT-3，(上游，SEQ ID NO:3);和
[0097]5，-GAT GGG CAC AGT GTG GGT GA-3，(下游，SEQ ID NO:4)；
[0098](f)裝有 10XPCR 緩沖液(50mM KC1, lOOmM Tris-Cl, pH9.0，25 °C，1.0%TritonX-100)；[0099](g)裝有dNTP (每種lOmM)的容器；
[0100](h)裝有Taq DNA聚合酶(3U/ μ 1)的容器；
[0101](i)裝有熒光染料(SYBR I)的容器；以及
[0102](j)使用說明書。
[0103]實(shí)施例2:HCC中RIG-1的表達(dá)與患者生存時間的相關(guān)性
[0104]采用免疫組化方法，對1999至2006年收集的兩組74例HCC對照患者(未接受IFN- α治療)的HCC組織中RIG-1蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行了分析。將74例HCC對照患者按RIG-1表達(dá)中位數(shù)分為高低兩組，各37人。(組1組織切片來自香港大學(xué)，組2組織切片來自上海中山醫(yī)院)
[0105]分別對RIG-1的低表達(dá)與患者生存時間的相關(guān)性進(jìn)行分析，Ρ值使用SPSS17.0中的log-rank test計算,結(jié)果分別如圖1A和圖1B所示。
[0106]結(jié)果發(fā)現(xiàn):RIG_I的低表達(dá)與患者更低的無瘤生存時間顯著相關(guān)(圖1A)。
[0107]結(jié)果發(fā)現(xiàn):RIG_I的低表達(dá)與患者更低的總體生存時間顯著相關(guān)(圖1B)。
[0108]對影響HCC預(yù)后的危險因素進(jìn)行Cox回歸分析，危害比(95%可信區(qū)間)和P值使用SPSS17.0中的單因素和多因素Cox回歸分析計算。表1-2示出了影響HCC患者預(yù)后危險因素的單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果，其中HCC患者兩組共計148例(與圖1相同)。多因素分析使用了年齡性別校正。
[0109]表1影響對照HCC患者無瘤生存危險因素的單因素和多因素Cox回歸分析
[0110]
【權(quán)利要求】
1.模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用是指模式識別受體RIG-1與干擾素α聯(lián)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用是指提高模式識別受體RIG-1表達(dá)量的試劑與干擾素α聯(lián)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的提高模式識別受體RIG-1表達(dá)量的試劑，包括RIG-1分子、RIG-1分子作為活性物質(zhì)的組合物、含有RIG-1分子的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的RIG-1分子，包括RIG-1基因、RIG-1蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤為肝癌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的模式識別受體RIG-1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的肝癌為原發(fā)性肝癌、 肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性肝癌，或繼發(fā)性肝癌。
【文檔編號】A61K48/00GK103656683SQ201310688934
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】侯晉, 曹雪濤, 周燁 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)