一種啟動子元件POsCold8及其使用方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種啟動 子元件POsColdS及其使用方法和應(yīng)用，該啟動子元件能夠在水稻轉(zhuǎn)基因調(diào)控體系中有條 件地驅(qū)動目標(biāo)基因的表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是最主要的糧食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米為主食。隨 著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，全球范圍內(nèi)對稻米產(chǎn)量和品質(zhì)提出了越來越高的要求。因而，利用各種方法 來提高水稻單產(chǎn)、改良稻米品質(zhì)，有著極其重要的意義。將現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用到水稻品種改 良中，可以解決一些常規(guī)方法難以解決的問題。自九十年代以來，水稻生物技術(shù)取得了很大 的發(fā)展，一些控制重要農(nóng)藝性狀基因的相繼分離和水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善為用基因工 程技術(shù)來改良水稻品種奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0003]冷脅迫包括冷害和凍害。是指最適溫度下限溫度的環(huán)境對植物的傷害。是眾多環(huán) 境脅近中對水稻影響尤為突出的一種。芽期、苗期、幼穗期、抽穗期是水稻對低溫敏感時期， 苗期遇到冷脅迫時生長緩慢，葉片外觀癥狀表現(xiàn)為秧苗青枯或黃枯，卷曲甚至死亡。在長期 進(jìn)化過程中，植物形成了復(fù)雜的途徑來感知外界信號進(jìn)而通過相應(yīng)的生理變化來應(yīng)答環(huán)境 脅迫。這是一個多系統(tǒng)的綜合生理過程，不僅受環(huán)境影響，也受物種本身遺傳基因的控制。
[0004] 近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在水稻耐寒性理論的研究方面取得許多進(jìn)展，包 括一些關(guān)鍵的耐冷相關(guān)基因或QTL相繼被克隆。利用這些關(guān)鍵基因，可以有效提高植物對 低溫的耐受性。但目前的基因工程操作中，大部分是利用組成型啟動子驅(qū)動這些關(guān)鍵基因 的表達(dá)，所獲轉(zhuǎn)基因植株雖然能夠表現(xiàn)出較強(qiáng)的低溫耐性，但組成型啟動子往往會帶來一 些不必要的表達(dá)，比如造成植株矮小，發(fā)育延滯和物質(zhì)能量浪費，不利于潛在的實際應(yīng)用推 廣。因此，利用冷誘導(dǎo)啟動子，特異的激活關(guān)鍵調(diào)控基因，將在植物抗冷基因改良中起到重 要作用。
[0005]因此，植物耐冷基因工程迫切需要解決的問題就是要尋找更廣泛的種質(zhì)資源，包 括耐冷基因和相關(guān)啟動子，從而達(dá)到充分挖掘植物本身潛在的耐冷能力的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種分離鑒定本底信號低、誘導(dǎo)系數(shù)高的新 型啟動子或啟動子元件，這種啟動子對作物基因工程將有著重要的意義。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種所述啟動子元件選自下組：
[0008] (a)核苷酸序列包含SEQIDNO: 1所示序列的多核苷酸；
[0009] (b)核苷酸序列與SEQIDNO: 1所示序列的同源性大于等于80%，優(yōu)選大于等于 85 %，更優(yōu)選大于等于90 %，更有選大于等于95 %，更優(yōu)選大于等于多98 %，且具有在低溫 誘導(dǎo)條件下特異性表達(dá)活性的多核苷酸；
[0010] (C)在SEQIDNO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1~60個，較佳地1~ 50,較佳地1~40,較佳地1~20,更佳地1~6個核苷酸，且具有在低溫誘導(dǎo)條件下特異 性表達(dá)活性的多核苷酸。
[0011] b)和c)中水稻冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子序列與SEQIDNo: 1所示的DNA序列具有相同 的功能，即在冷誘導(dǎo)條件下驅(qū)動目標(biāo)基因在植物中表達(dá)。
[0012] 序列表中SEQIDNo: 1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)的水稻冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子，本文中稱為P0sCold8或啟動子P0sCold8。具 體而言，本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻（OryzasativaLcv.Nipponbare)基因上游包括 轉(zhuǎn)錄起始位點在內(nèi)的1960bp的DNA序列，具有驅(qū)動目標(biāo)基因在冷誘導(dǎo)條件下表達(dá)的功能， 并且分離克隆、并鑒定了該DNA序列的功能。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的啟動子元件P0sCold8的DNA序列為SEQIDNo: 1所示的序 列，即P0sCold8或啟動子P0sCold8。其可以用作水稻冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子。
[0014] 另一方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建物，其特征是，所述構(gòu)建物含有目的基因以及與目 的基因可操作連接的所述啟動子元件。
[0015] 另一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)盒，其特征是，所述表達(dá)盒從5'至3'依次具有下 述元件：所述啟動子元件、基因ORF序列和終止子。
[0016] 另一方面，本發(fā)明提供一種載體，其特征是，所述載體含有所述啟動子元件或所述 表達(dá)盒。
[0017] 另一方面，本發(fā)明提供一種利用所述啟動子元件構(gòu)建相應(yīng)宿主細(xì)胞的方法，其特 征是，所述方法包括將所述啟動子元件導(dǎo)入宿主細(xì)胞，優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為根癌農(nóng)桿菌 細(xì)胞。
[0018] 另一方面，本發(fā)明提供所述啟動子元件、所述構(gòu)建物以及所述表達(dá)盒的用途，其特 征是，所述啟動子元件、所述構(gòu)建物以及所述表達(dá)盒用于提高水稻的耐寒性能。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建對寒冷環(huán)境具有特異性響應(yīng)功能的水稻品種的方 法，所述方法包括以下步驟：
[0020] (a)提供一種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有目的基因以及與該目的基因可操作連接的 所述啟動子元件；
[0021] (b)將步驟（a)得到的構(gòu)建物導(dǎo)入水稻細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞；
[0022] (C)將步驟（b)中轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞再生成水稻植株，從而構(gòu)建出對寒冷環(huán)境具有 特異性響應(yīng)功能的水稻品種。
[0023] 另一方面，本發(fā)明提供一種制備轉(zhuǎn)基因水稻的方法，所述方法包括以下步驟：
[0024] (a)提供下述水稻細(xì)胞，所述水稻細(xì)胞含有所述載體、或其染色體整合有所述啟動 子元件、或其染色體整合有所述表達(dá)盒；
[0025] (b)將（a)的水稻細(xì)胞再生為水稻植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因水稻。
[0026] 另一方面，本發(fā)明提供一種獲取水稻愈傷組織或水稻體細(xì)胞胚胎的方法，其特征 是，所述方法包括：利用PCR擴(kuò)增方法對日本晴水稻DNA中權(quán)利要求1所述的啟動子元件進(jìn) 行擴(kuò)增；
[0027] 擴(kuò)增獲得的DNA序列利用T4連接酶與含有目的基因的預(yù)定載體相連接，獲得相應(yīng) 重組載體；
[0028] 利用凍融法將所獲得的重組載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌；
[0029] 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法利用所述根癌農(nóng)桿菌將權(quán)利要求1所述的 啟動子元件以及目的基因轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞；
[0030] 利用所述水稻細(xì)胞培養(yǎng)水稻愈傷組織或水稻體細(xì)胞胚胎。
[0031] 另一方面，本發(fā)明提供一種所述啟動子元件在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其特征 在于，所述應(yīng)用包括將所述啟動子元件連接于載體的待表達(dá)的基因序列上游，從而構(gòu)建重 組表達(dá)載體；將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育，優(yōu)選地，所述 應(yīng)用用于改良植物耐寒，所述植物為單子葉植物：水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥；所 述待表達(dá)的基因為耐寒基因。
[0032] 本發(fā)明中所提供的啟動子的DNA序列為（與序列表中SEQ ID No: 1中相同）：
[0034]需要說明的是：上述啟動子的DNA序列中，序列開頭以斜體并加粗表示的序列 " TTTATTTTTTTTCAGGTATGCC"為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列，共計22bp ; 序列末尾以斜體并加粗表示的序列"GCTTGCTCATTCTGTTTATATC"為獲得啟動子過程中使用 的反向引物的留存序列（該留存序列與反向引物的相應(yīng)序列互補(bǔ)），共計22bp ;該DNA序列 中剩余的部分則為獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強(qiáng)調(diào)的是，本文中所提到的啟動子 既可以指上述整個DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要說明的 是，即便本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0035] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)P0sCold8基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點在內(nèi)的1960bp的DNA序列，并將其命 名為啟動子P〇sCold8。在具體實施例中，本發(fā)明將該序列經(jīng)酶切后連接到植物雙元表達(dá)載 體PCAMBIA1391上，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒（即重組表達(dá)載體），利用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng) 桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。對獲得 的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行Gus表達(dá)定量檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株在冷誘導(dǎo)條件下Gus基因表達(dá)水平 提高，從而證明該1960bp的序列具有驅(qū)動基因在冷誘導(dǎo)條件下特異性表達(dá)的活性。
[0036] 本發(fā)明所述的啟動子元件POsColdS可與植物雙元表達(dá)載體連接，用于取代組成 型啟動子。并且，該啟動子序列可以與所需的靶標(biāo)基因連接，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體，經(jīng) 轉(zhuǎn)化后，在冷誘導(dǎo)條件下特異性的驅(qū)動靶標(biāo)基因的表達(dá)，增加轉(zhuǎn)基因的效果，改良水稻的特 性。
[0037] 技術(shù)效果
[0038] 本發(fā)明所克隆的水稻啟動子POsColdS能夠調(diào)控基因在冷誘導(dǎo)條件下特異性集中 表達(dá)，在實際應(yīng)用中具有顯著價值。通過該啟動子對農(nóng)作物品種進(jìn)行基因改造，如通過該啟 動子驅(qū)動目標(biāo)基因在植株中表達(dá)，可以提高和改善水稻的特性，從而培育出理想的轉(zhuǎn)基因 植物品種。
【附圖說明】
[0039] 以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0040] 圖1為將P0sCold8啟動子構(gòu)建于pCAMBIA1391載體質(zhì)粒中的示意圖，其中圖1 中A為pCAMBIA1391示意圖，圖1中B為pCAMBIA1391-P0sCold8示意圖，其中示出了利用 P0sCold8啟動子驅(qū)動位于其下游的Gus基因表達(dá)；
[0041] 圖2為對本發(fā)明啟動子進(jìn)行酶切驗證的結(jié)果示意圖；
[0042] 圖3以萌發(fā)后10天的P0sCold8驅(qū)動⑶S報告基因轉(zhuǎn)基因水稻為材料，在10°C下 低溫脅迫處理。在脅迫24小時后，通過對報告基因⑶S的定性染色。結(jié)果顯示，冷處理后， 在根莖葉各個組織中都出現(xiàn)代表⑶S活性的藍(lán)色信號；而未經(jīng)脅迫處理的植株各組織均沒 有檢測到⑶S表達(dá)；這表明P0sCold8啟動子可受低溫脅迫顯著誘導(dǎo)。（標(biāo)尺=5mm)
[0043] 圖4為4°C低溫脅迫的不同時間（0小時/未處理，4小時，8小時，12小時，24小 時，48小時）采集萌發(fā)后10天的POsCold:⑶S轉(zhuǎn)基因水稻幼苗植株，提取RNA，通過定量 RT-PCR的方法檢查⑶S基因的表達(dá)強(qiáng)度來反應(yīng)P0sCold8的冷誘導(dǎo)活性。結(jié)果顯示，低溫誘 導(dǎo)后，P0sCold8表達(dá)強(qiáng)度顯著提高，在24小時處理后，活性可達(dá)處理前活性的168. 5倍。
【具體實施方式】
[0044] 以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅 用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0045] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的藥 材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均