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一種啟動子元件POsCold8及其使用方法和應(yīng)用

文檔序號:9367717閱讀:551來源:國知局
一種啟動子元件POsCold8及其使用方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言,本發(fā)明涉及一種啟動 子元件POsColdS及其使用方法和應(yīng)用,該啟動子元件能夠在水稻轉(zhuǎn)基因調(diào)控體系中有條 件地驅(qū)動目標(biāo)基因的表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是最主要的糧食作物之一,世界上三分之一以上的人口都以稻米為主食。隨 著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,全球范圍內(nèi)對稻米產(chǎn)量和品質(zhì)提出了越來越高的要求。因而,利用各種方法 來提高水稻單產(chǎn)、改良稻米品質(zhì),有著極其重要的意義。將現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用到水稻品種改 良中,可以解決一些常規(guī)方法難以解決的問題。自九十年代以來,水稻生物技術(shù)取得了很大 的發(fā)展,一些控制重要農(nóng)藝性狀基因的相繼分離和水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善為用基因工 程技術(shù)來改良水稻品種奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0003]冷脅迫包括冷害和凍害。是指最適溫度下限溫度的環(huán)境對植物的傷害。是眾多環(huán) 境脅近中對水稻影響尤為突出的一種。芽期、苗期、幼穗期、抽穗期是水稻對低溫敏感時期, 苗期遇到冷脅迫時生長緩慢,葉片外觀癥狀表現(xiàn)為秧苗青枯或黃枯,卷曲甚至死亡。在長期 進(jìn)化過程中,植物形成了復(fù)雜的途徑來感知外界信號進(jìn)而通過相應(yīng)的生理變化來應(yīng)答環(huán)境 脅迫。這是一個多系統(tǒng)的綜合生理過程,不僅受環(huán)境影響,也受物種本身遺傳基因的控制。
[0004] 近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,在水稻耐寒性理論的研究方面取得許多進(jìn)展,包 括一些關(guān)鍵的耐冷相關(guān)基因或QTL相繼被克隆。利用這些關(guān)鍵基因,可以有效提高植物對 低溫的耐受性。但目前的基因工程操作中,大部分是利用組成型啟動子驅(qū)動這些關(guān)鍵基因 的表達(dá),所獲轉(zhuǎn)基因植株雖然能夠表現(xiàn)出較強(qiáng)的低溫耐性,但組成型啟動子往往會帶來一 些不必要的表達(dá),比如造成植株矮小,發(fā)育延滯和物質(zhì)能量浪費,不利于潛在的實際應(yīng)用推 廣。因此,利用冷誘導(dǎo)啟動子,特異的激活關(guān)鍵調(diào)控基因,將在植物抗冷基因改良中起到重 要作用。
[0005]因此,植物耐冷基因工程迫切需要解決的問題就是要尋找更廣泛的種質(zhì)資源,包 括耐冷基因和相關(guān)啟動子,從而達(dá)到充分挖掘植物本身潛在的耐冷能力的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述問題,本發(fā)明的目的是提供一種分離鑒定本底信號低、誘導(dǎo)系數(shù)高的新 型啟動子或啟動子元件,這種啟動子對作物基因工程將有著重要的意義。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的,一方面,本發(fā)明提供一種所述啟動子元件選自下組:
[0008] (a)核苷酸序列包含SEQIDNO: 1所示序列的多核苷酸;
[0009] (b)核苷酸序列與SEQIDNO: 1所示序列的同源性大于等于80%,優(yōu)選大于等于 85 %,更優(yōu)選大于等于90 %,更有選大于等于95 %,更優(yōu)選大于等于多98 %,且具有在低溫 誘導(dǎo)條件下特異性表達(dá)活性的多核苷酸;
[0010] (C)在SEQIDNO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1~60個,較佳地1~ 50,較佳地1~40,較佳地1~20,更佳地1~6個核苷酸,且具有在低溫誘導(dǎo)條件下特異 性表達(dá)活性的多核苷酸。
[0011] b)和c)中水稻冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子序列與SEQIDNo: 1所示的DNA序列具有相同 的功能,即在冷誘導(dǎo)條件下驅(qū)動目標(biāo)基因在植物中表達(dá)。
[0012] 序列表中SEQIDNo: 1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻(OryzasativaL cv.Nipponbare)的水稻冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子,本文中稱為P0sCold8或啟動子P0sCold8。具 體而言,本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)基因上游包括 轉(zhuǎn)錄起始位點在內(nèi)的1960bp的DNA序列,具有驅(qū)動目標(biāo)基因在冷誘導(dǎo)條件下表達(dá)的功能, 并且分離克隆、并鑒定了該DNA序列的功能。
[0013] 優(yōu)選地,本發(fā)明提供的啟動子元件P0sCold8的DNA序列為SEQIDNo: 1所示的序 列,即P0sCold8或啟動子P0sCold8。其可以用作水稻冷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子。
[0014] 另一方面,本發(fā)明提供一種構(gòu)建物,其特征是,所述構(gòu)建物含有目的基因以及與目 的基因可操作連接的所述啟動子元件。
[0015] 另一方面,本發(fā)明提供一種表達(dá)盒,其特征是,所述表達(dá)盒從5'至3'依次具有下 述元件:所述啟動子元件、基因ORF序列和終止子。
[0016] 另一方面,本發(fā)明提供一種載體,其特征是,所述載體含有所述啟動子元件或所述 表達(dá)盒。
[0017] 另一方面,本發(fā)明提供一種利用所述啟動子元件構(gòu)建相應(yīng)宿主細(xì)胞的方法,其特 征是,所述方法包括將所述啟動子元件導(dǎo)入宿主細(xì)胞,優(yōu)選地,所述宿主細(xì)胞為根癌農(nóng)桿菌 細(xì)胞。
[0018] 另一方面,本發(fā)明提供所述啟動子元件、所述構(gòu)建物以及所述表達(dá)盒的用途,其特 征是,所述啟動子元件、所述構(gòu)建物以及所述表達(dá)盒用于提高水稻的耐寒性能。
[0019] 另一方面,本發(fā)明提供一種構(gòu)建對寒冷環(huán)境具有特異性響應(yīng)功能的水稻品種的方 法,所述方法包括以下步驟:
[0020] (a)提供一種構(gòu)建物,所述構(gòu)建物含有目的基因以及與該目的基因可操作連接的 所述啟動子元件;
[0021] (b)將步驟(a)得到的構(gòu)建物導(dǎo)入水稻細(xì)胞,獲得轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞;
[0022] (C)將步驟(b)中轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞再生成水稻植株,從而構(gòu)建出對寒冷環(huán)境具有 特異性響應(yīng)功能的水稻品種。
[0023] 另一方面,本發(fā)明提供一種制備轉(zhuǎn)基因水稻的方法,所述方法包括以下步驟:
[0024] (a)提供下述水稻細(xì)胞,所述水稻細(xì)胞含有所述載體、或其染色體整合有所述啟動 子元件、或其染色體整合有所述表達(dá)盒;
[0025] (b)將(a)的水稻細(xì)胞再生為水稻植株,從而獲得轉(zhuǎn)基因水稻。
[0026] 另一方面,本發(fā)明提供一種獲取水稻愈傷組織或水稻體細(xì)胞胚胎的方法,其特征 是,所述方法包括:利用PCR擴(kuò)增方法對日本晴水稻DNA中權(quán)利要求1所述的啟動子元件進(jìn) 行擴(kuò)增;
[0027] 擴(kuò)增獲得的DNA序列利用T4連接酶與含有目的基因的預(yù)定載體相連接,獲得相應(yīng) 重組載體;
[0028] 利用凍融法將所獲得的重組載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌;
[0029] 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法利用所述根癌農(nóng)桿菌將權(quán)利要求1所述的 啟動子元件以及目的基因轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞;
[0030] 利用所述水稻細(xì)胞培養(yǎng)水稻愈傷組織或水稻體細(xì)胞胚胎。
[0031] 另一方面,本發(fā)明提供一種所述啟動子元件在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用,其特征 在于,所述應(yīng)用包括將所述啟動子元件連接于載體的待表達(dá)的基因序列上游,從而構(gòu)建重 組表達(dá)載體;將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育,優(yōu)選地,所述 應(yīng)用用于改良植物耐寒,所述植物為單子葉植物:水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥;所 述待表達(dá)的基因為耐寒基因。
[0032] 本發(fā)明中所提供的啟動子的DNA序列為(與序列表中SEQ ID No: 1中相同):
[0034]需要說明的是:上述啟動子的DNA序列中,序列開頭以斜體并加粗表示的序列 " TTTATTTTTTTTCAGGTATGCC"為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列,共計22bp ; 序列末尾以斜體并加粗表示的序列"GCTTGCTCATTCTGTTTATATC"為獲得啟動子過程中使用 的反向引物的留存序列(該留存序列與反向引物的相應(yīng)序列互補(bǔ)),共計22bp ;該DNA序列 中剩余的部分則為獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強(qiáng)調(diào)的是,本文中所提到的啟動子 既可以指上述整個DNA序列,也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要說明的 是,即便本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上,采用其他引物獲得了類似序列,其也落入本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0035] 綜上所述,本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻(OryzasativaL cv.Nipponbare)P0sCold8基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點在內(nèi)的1960bp的DNA序列,并將其命 名為啟動子P〇sCold8。在具體實施例中,本發(fā)明將該序列經(jīng)酶切后連接到植物雙元表達(dá)載 體PCAMBIA1391上,獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒(即重組表達(dá)載體),利用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng) 桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化,得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。對獲得 的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行Gus表達(dá)定量檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株在冷誘導(dǎo)條件下Gus基因表達(dá)水平 提高,從而證明該1960bp的序列具有驅(qū)動基因在冷誘導(dǎo)條件下特異性表達(dá)的活性。
[0036] 本發(fā)明所述的啟動子元件POsColdS可與植物雙元表達(dá)載體連接,用于取代組成 型啟動子。并且,該啟動子序列可以與所需的靶標(biāo)基因連接,構(gòu)建重組植物表達(dá)載體,經(jīng) 轉(zhuǎn)化后,在冷誘導(dǎo)條件下特異性的驅(qū)動靶標(biāo)基因的表達(dá),增加轉(zhuǎn)基因的效果,改良水稻的特 性。
[0037] 技術(shù)效果
[0038] 本發(fā)明所克隆的水稻啟動子POsColdS能夠調(diào)控基因在冷誘導(dǎo)條件下特異性集中 表達(dá),在實際應(yīng)用中具有顯著價值。通過該啟動子對農(nóng)作物品種進(jìn)行基因改造,如通過該啟 動子驅(qū)動目標(biāo)基因在植株中表達(dá),可以提高和改善水稻的特性,從而培育出理想的轉(zhuǎn)基因 植物品種。
【附圖說明】
[0039] 以下,結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案,其中:
[0040] 圖1為將P0sCold8啟動子構(gòu)建于pCAMBIA1391載體質(zhì)粒中的示意圖,其中圖1 中A為pCAMBIA1391示意圖,圖1中B為pCAMBIA1391-P0sCold8示意圖,其中示出了利用 P0sCold8啟動子驅(qū)動位于其下游的Gus基因表達(dá);
[0041] 圖2為對本發(fā)明啟動子進(jìn)行酶切驗證的結(jié)果示意圖;
[0042] 圖3以萌發(fā)后10天的P0sCold8驅(qū)動⑶S報告基因轉(zhuǎn)基因水稻為材料,在10°C下 低溫脅迫處理。在脅迫24小時后,通過對報告基因⑶S的定性染色。結(jié)果顯示,冷處理后, 在根莖葉各個組織中都出現(xiàn)代表⑶S活性的藍(lán)色信號;而未經(jīng)脅迫處理的植株各組織均沒 有檢測到⑶S表達(dá);這表明P0sCold8啟動子可受低溫脅迫顯著誘導(dǎo)。(標(biāo)尺=5mm)
[0043] 圖4為4°C低溫脅迫的不同時間(0小時/未處理,4小時,8小時,12小時,24小 時,48小時)采集萌發(fā)后10天的POsCold:⑶S轉(zhuǎn)基因水稻幼苗植株,提取RNA,通過定量 RT-PCR的方法檢查⑶S基因的表達(dá)強(qiáng)度來反應(yīng)P0sCold8的冷誘導(dǎo)活性。結(jié)果顯示,低溫誘 導(dǎo)后,P0sCold8表達(dá)強(qiáng)度顯著提高,在24小時處理后,活性可達(dá)處理前活性的168. 5倍。
【具體實施方式】
[0044] 以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解,這些實施例僅 用于說明本發(fā)明,其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0045] 下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的藥 材原料、試劑材料等,如無特殊說明,均
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