一種螺旋體糊精槲皮素包合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及變性淀粉的生產(chǎn)方法，具體是指利用生物酶技術(shù)和添加誘導(dǎo)劑相結(jié)合制備螺旋體糊精槲皮素包合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]槲皮素是在植物界中大量存在的一種黃酮類(lèi)化合物，是黃酮類(lèi)化合物中的重要一員，屬于黃酮醇類(lèi)化合物，在植物中多以糖苷的形式存在于許多植物的花、葉、果實(shí)中，如蘆丁、槲皮甙、金絲桃甙等。槲皮素及其衍生物具有如抗氧化和清除氧自由基、降低血壓、保護(hù)心肌缺血、避免缺血再灌注損傷、增強(qiáng)免疫功能及抗癌、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛，抗心律失常、擴(kuò)張血管、抗腫瘤等作用，并且其對(duì)人體無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)致癌、無(wú)致死、無(wú)致畸等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)外曾試用于多種疾病的治療，并取得了良好的效果。因此近年來(lái)，對(duì)槲皮素及其衍生物的合成和藥理活性研究備受關(guān)注。但天然的槲皮素因含有五個(gè)極性較大的羥基基團(tuán)，親酯性與親水性都較弱，存在強(qiáng)烈的首過(guò)效應(yīng)、生物利用度極低、臨床治療方面應(yīng)用局限性強(qiáng)，使其在工業(yè)中的應(yīng)用受到了很大的限制。
[0003]螺旋體糊精是一種由D-吡喃葡萄糖單元通過(guò)α -1，4糖苷鍵連接而成的輕度分支或線(xiàn)形多糖，呈右手螺旋結(jié)構(gòu)，在螺旋內(nèi)部只含氫原子，是親油性的，羥基位于螺旋外側(cè)。在適當(dāng)條件下，螺旋體糊精分子可與無(wú)機(jī)或有機(jī)的分子絡(luò)合，形成螺旋狀內(nèi)絡(luò)物。螺旋體糊精和環(huán)糊精具有一個(gè)共同的性質(zhì)，即均能作為一種主體分子與各種客體分子發(fā)生包結(jié)絡(luò)合作用形成包結(jié)絡(luò)合物，客體分子可位于螺旋空腔內(nèi)部，也可位于兩個(gè)螺旋之間。但是現(xiàn)有技術(shù)用于研究螺旋體糊精包結(jié)絡(luò)合功能所用的螺旋體糊精多為從原淀粉中分離得到，成本較高，不利于螺旋體糊精包結(jié)絡(luò)合體的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)成本低、生物活性高的螺旋體糊精槲皮素包合物及其制備方法，以改善槲皮素的使用特性和應(yīng)用范圍。
[0005]本發(fā)明采用脫支酶對(duì)淀粉進(jìn)行脫支，得到大量的螺旋體糊精分子。通過(guò)普魯蘭脫支酶限制性酶解可控制螺旋體糊精的分子量和聚合度得到適于進(jìn)行包結(jié)絡(luò)合作用的螺旋體糊精。加入螺旋空腔誘導(dǎo)劑可促進(jìn)螺旋體糊精單螺旋結(jié)構(gòu)的形成同時(shí)又增大其空腔尺寸，進(jìn)而提高螺旋體糊精的包結(jié)絡(luò)合能力。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于利用脫支酶酶解作用制備螺旋體糊精并加入α-萘酚誘導(dǎo)劑制備螺旋體糊精包結(jié)絡(luò)合載體的方法還未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明螺旋體糊精通過(guò)疏水相互作用與槲皮素包結(jié)絡(luò)合，達(dá)到改善槲皮素溶解性及生物利用性低的缺點(diǎn)。本發(fā)明制備的螺旋體糊精槲皮素包結(jié)絡(luò)合物，槲皮素包結(jié)在螺旋體糊精的螺旋空腔內(nèi)，添加誘導(dǎo)劑后槲皮素與螺旋體糊精的結(jié)合更加緊密。
[0006]本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]—種螺旋體糊精槲皮素包合物的制備方法，包括如下步驟:
[0008]I)淀粉原料配成淀粉乳，在65?75°C下攪拌糊化；糊化完成后，將糊化液冷卻，調(diào)節(jié)pH值至4.5?6.0，加入脫支酶，用量為每克干淀粉加入脫支酶10?30u，在55?65°C下攪拌反應(yīng)2?5小時(shí)；調(diào)節(jié)溫度至90-99°C，并保持10?30分鐘，滅酶，加入用無(wú)水乙醇配制的α -萘酚溶液，恒溫?cái)嚢?0?30分鐘，得螺旋體糊精溶液；
[0009]2)將所得螺旋體糊精溶液的溫度調(diào)節(jié)至30?80°C，滴加溶有質(zhì)量百分比為10?20%的槲皮素冰醋酸溶液，恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)I?6小時(shí)，每克干淀粉加入槲皮素冰醋酸溶液
0.25?0.5g ;冷卻至室溫后冷藏；
[0010]3)將步驟(2)的產(chǎn)品離心、洗滌、干燥、粉碎后得黃色粉末狀產(chǎn)品。
[0011]為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述淀粉原料為木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、小麥淀粉、蠟質(zhì)玉米淀粉、蠟質(zhì)小麥淀粉或玉米淀粉。
[0012]優(yōu)選地，所述脫支酶為普魯蘭酶。
[0013]優(yōu)選地，所述α -萘酸的濃度為1.0?3.0mg/mL，用量為每克干淀粉加入α -萘酸溶液2.0?6.0mL0
[0014]優(yōu)選地，所述淀粉原料配成淀粉乳是淀粉原料用NaOH溶液配成淀粉乳；所述的質(zhì)量百分比濃度為8%?20% ;所述NaOH溶液的pH值為8_9。
[0015]優(yōu)選地，所述糊化的時(shí)間為20?30分鐘。
[0016]優(yōu)選地，所述冷藏為放入4°C冰箱中冷藏18?36小時(shí)。
[0017]優(yōu)選地，所述洗滌為用去離子水洗滌多次，直至溶液中無(wú)殘留冰醋酸。
[0018]—種螺旋體糊精槲皮素包合物，由上述制備方法制得；每克螺旋體糊精槲皮素包合物中槲皮素的含量為32-40毫克，包合率為79-84%。
[0019]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0020](I)采用生物酶解及添加誘導(dǎo)劑的技術(shù)對(duì)淀粉原料進(jìn)行改性，得到具有良好包結(jié)絡(luò)合功能的螺旋體糊精，將其應(yīng)用于包結(jié)絡(luò)合槲皮素；經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，淀粉經(jīng)酶解及添加誘導(dǎo)劑處理后，制備得到的螺旋體糊精槲皮素包合物，每克包合物中槲皮素的含量為32-40毫克，包合率為79-84%，并且槲皮素的生物活性也得到改善，擴(kuò)大了槲皮素應(yīng)用范圍。
[0021](2)本發(fā)明具有生產(chǎn)效率高，成本低，產(chǎn)品質(zhì)量好的特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為未包合凝沉木薯螺旋體糊精(a)和實(shí)施例1所得木薯螺旋體糊精槲皮素包合物的紅外圖譜(b)。
[0023]圖2為未包合凝沉木薯螺旋體糊精(a)和實(shí)施例1所得木薯螺旋體糊精槲皮素包合物的X-射線(xiàn)衍射圖譜(b)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地說(shuō)明。本發(fā)明有許多成功的實(shí)施例，下面列舉六個(gè)具體的實(shí)施例，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。
[0025]實(shí)施例1
[0026]第一步木薯淀粉(30g，干基)用pH為8.0的NaOH溶液配成質(zhì)量百分比濃度為15%的淀粉乳，置于三口燒瓶中在70°C下攪拌糊化25分鐘；完成后，將糊液冷卻，調(diào)節(jié)pH至4.5，加入普魯蘭酶(OPTIMAXL-1000，杰能科生物工程有限公司)，用量為每克干淀粉加入普魯蘭酶10u，在60°C下攪拌反應(yīng)4小時(shí)；調(diào)節(jié)溫度至99°C并保持20分鐘滅酶，加入用無(wú)水乙醇配制的α -萘酚溶液，控制α -萘酚濃度為1.5mg/mL，用量為每克干淀粉加入α -萘酚溶液4.0mL，恒溫?cái)嚢?5分鐘，得木薯螺旋體糊精溶液；
[0027]第二步將步驟(I)所得木薯螺旋體糊精溶液的溫度調(diào)節(jié)至60°C，將溶有質(zhì)量百分比為10%的槲皮素冰醋酸溶液15g滴加入上述溶液中，恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)；冷卻至室溫后，放入4°C冰箱中冷藏18小時(shí)；
[0028]第三步將步驟(2)的產(chǎn)品離心、洗滌、干燥、粉碎后得淡黃色粉末狀產(chǎn)品。得到的產(chǎn)品通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定表明，每克產(chǎn)品中槲皮素的含量為39.75毫克，包合率達(dá)到84.11%。通過(guò)熒光淬滅實(shí)驗(yàn)對(duì)該產(chǎn)品的抗氧化性能進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明由添加α-萘酚誘導(dǎo)劑的螺旋體糊精槲皮素包合物產(chǎn)品，其氧自由基清除能力為116.2 ymolTrolox/g，與未添加誘導(dǎo)劑的包合物(氧自由基清除能力為98.2 ymolTrolox/g)相比，氧自由基清除能力明顯增強(qiáng)。
[0029]有關(guān)槲皮素的含量，包合率，抗氧化性能的測(cè)試方法說(shuō)明如下:
[0030]紫外分光光度法是測(cè)定槲皮素含量的常用方法，具體測(cè)定方法為:精密稱(chēng)取絕干的包合物12.5mg，加60%無(wú)水乙醇使其溶解，用60%無(wú)水乙醇定容至50mL，用分光光度計(jì)在373nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度值，取三次測(cè)量的平均值，對(duì)照槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算包合物中槲皮素的含量及包合率。槲皮素含量的計(jì)算方法如下:
[0031]包合物樣品中的槲皮素含量公式..X= (C1XyiXN)Z(In0XlOOO);其中:X為每克樣品中的槲皮素含量mg/g，C1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上確定的樣品液中的槲皮素含量mg/mL，V i為樣品總體積mL，N為定容后的稀釋倍數(shù)，m。為樣品質(zhì)量g。
[0032]包合物樣品中的槲皮素包合率公式:Y= (Ih1XXX 100% )/(m2X 1000);其中:Y為槲皮素包合率％，Hi1為得到包合物的質(zhì)量g，X為每克樣品中槲皮素的含量mg/g，m2為反應(yīng)時(shí)加入槲皮素的質(zhì)量g。
[0033]當(dāng)螺旋體糊精中包結(jié)絡(luò)合的槲皮素達(dá)到一定量時(shí)，通過(guò)紅外光譜可測(cè)得其結(jié)構(gòu)的變化，主要表現(xiàn)為在1715cm 1左右出現(xiàn)一個(gè)新的槲皮素羰基吸收峰(如圖1)。螺旋體糊精包結(jié)絡(luò)合有機(jī)物形成包合物后，其結(jié)晶結(jié)構(gòu)通常為典型的V型，由圖2可知，與未包合的凝沉螺旋體糊精的B型結(jié)晶結(jié)構(gòu)不同，本發(fā)明所得包結(jié)絡(luò)合產(chǎn)品，其結(jié)晶結(jié)構(gòu)為明顯的V型。
[0034]氧自由基清除能力是衡量槲皮素抗氧化性能大小的重要指標(biāo)。熒光淬滅實(shí)驗(yàn)是測(cè)定抗氧化性能的常用實(shí)驗(yàn)方法。
[0035]具體方法為:在96孔熒光板各微孔中加入待測(cè)樣品20 μ L(將Trolox用相應(yīng)的緩沖液做適當(dāng)?shù)南♂?，接著加入75mmol/L磷酸鹽緩沖液和70nmol/LFL各20 μ L，并將微孔板置于酶標(biāo)儀中，在37°C下孵化15min后，用多道移液器迅速在各孔中加入12mmol/LAAPH140 μ L啟動(dòng)反應(yīng)，在37°C以激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)520nm，每2min測(cè)定一次各微孔的熒光強(qiáng)度，測(cè)定時(shí)間設(shè)在熒光衰減呈基線(xiàn)后為止，即設(shè)為2h，并計(jì)算樣品ORAC值。
[0036]實(shí)施例2
[0037]第一步馬鈴薯淀粉(30g，干基)用pH為8.0的NaOH溶液配成質(zhì)量百分比濃度為10%的淀粉乳，置于三口燒瓶中在65°C下攪拌糊化30分鐘；完成后，將糊液冷卻，調(diào)節(jié)pH至5.0，加入普魯蘭酶(OPTIMAXL-1000，杰能科生物工程有限公司)，用量為每克干淀粉加入普魯蘭酶15u，在55°C下攪拌反應(yīng)5小時(shí)；調(diào)節(jié)溫度至95°C并保持15分鐘滅酶，加入用無(wú)水乙醇配制的α -萘酚溶液，控制α -萘酚濃度為1.0mg/mL，用量為每克干淀粉加入α -萘酚溶液6.0mL,恒溫?cái)嚢?0分鐘，制得馬鈴薯螺旋體糊精溶液；
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