利用DNALigationKit及其說明書中的方法，將 大小為2159bp的同源重組打靶序列和大小為5948bp的pBR322-TK骨架載體連接，獲得重 組質(zhì)粒PBR322-TK-105-2159,并對其進行測序。
[0171] 測序結果表明：重組質(zhì)粒PBR322-TK-105-2159為將序列表中序列3所示的同源重 組打靶序列插入PBR322-TK載體的Sail與Clal酶切位點間，且保持pBR322-TK載體的其 他序列不變得到的載體。
[0172] (4)無內(nèi)毒素大提及質(zhì)粒線性化
[0173] 1)無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取
[0174] 使用QiagenEndoFreePlasmidMaxiKit，提取pBR322-TK-105-2159 質(zhì)粒。操作 步驟參與說明書（Qiagen，貨號：12362)。
[0175] 2)質(zhì)粒線性化及純化回收：同（3)中的質(zhì)粒酶切方法，將pBR322-TK-105-2159 質(zhì)粒進行線性化，得到線性化的PBR322-TK-105-2159質(zhì)粒，并對其進行測序。結果表明： PBR322-TK-105-2159質(zhì)粒的核苷酸序列如序列表中序列5所示，將其命名DonorDNA。
[0176] 向酶切溶液中加入1/10體積NaAc(pH5. 2)和2. 5倍體積的無水乙醇?；靹蚝笫?溫放置2min，12000rpm4°C離心5min。加入lmL70%乙醇洗沉淀兩次，棄掉乙醇，干燥后用 Nclease-free水溶解過夜，測定 260/2800D。
[0177] 3、TALENmRNA對與DonorDNA共轉(zhuǎn)染細胞及細胞篩選
[0178] (1)細胞轉(zhuǎn)染
[0179] 取4微克的TALENmRNA對（1:1)和6微克的線性化的pBR322-TK-105-2159質(zhì)粒 共轉(zhuǎn)染到3. 5cm皿的實施例1的步驟二的1制備的離體純種梅山豬原代成纖維細胞中，使 用Lonza公司提供的電車專試劑AmaxaBasicNucleofectorKitforPrimaryMammalian Fibroblasts及核轉(zhuǎn)染儀進行轉(zhuǎn)染實驗。48h后收集細胞，取1/3的細胞提取細胞基因組 DNA進行內(nèi)源活性的檢測，其余的2/3細胞用于單克隆細胞的培養(yǎng)及凍存。
[0180] (2)有限稀釋法獲得單克隆細胞
[0181] 確定轉(zhuǎn)染細胞具有內(nèi)源活性后，對細胞進行有限稀釋以獲得單克隆細胞。取部分 細胞進行計數(shù)，將細胞稀釋至100個/1〇〇_，37°c、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)過 程中，通過加入GANC(丙氧鳥苷）可以在細胞增殖過程中利用自殺機制排除DonorDNA隨 機整合入基因組的細胞，待細胞克隆生長至直徑達2mm以上時，去除培養(yǎng)基，DPBS沖洗后， 用牛津杯罩在克隆團上，消化收集細胞將其轉(zhuǎn)移至48孔板中擴大培養(yǎng)。
[0182] (3)單克隆基因型檢測
[0183] 48孔板中細胞融合率約達90 %時，消化取一半細胞用于細胞克隆基因型鑒定，剩 余一半繼續(xù)在孔板中培養(yǎng)。用表4中的引物擴增測序檢測重組序列是否在打靶點整合到了 基因組上，同時該引物也可以進一步排除DonorDNA是否存在隨機整合的情況。
[0184] 表4、重組序列整合情況鑒定引物
[0185]
[0186] 測序鑒定結果表明：重組序列整合到打靶位點，且不存在DonorDNA整合情況；單 克隆細胞中的突變的MSTN基因為將野生型MSTN基因第3782-3796位核苷酸敲除且第3800 位核苷酸分子由T突變?yōu)镚得到的DNA分子（如序列表中序列1所示），將這類單克隆細胞 命名為突變型成纖維細胞，并作為供體細胞，進一步研究MSTN基因第3782-3796位核苷酸 缺失且第3800位核苷酸分子由T突變?yōu)镚后對豬的表型帶來的影響。
[0187] 二、MSTN突變梅山豬的獲得
[0188] 1、MSTN單等位基因突變克隆梅山豬的獲得
[0189] 挑選上述突變型成纖維細胞作為供體細胞，通過體細胞核移植技術構建重組胚 胎。具體步驟如下：
[0190] 1)采集梅山豬的卵巢組織，收集卵母細胞，并進行體外成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)41小時后， 得到體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞；
[0191] 2)用透明質(zhì)酸酶處理體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞，并吹打去除卵丘細胞，得到優(yōu)質(zhì) 卵母細胞；
[0192] 3)以步驟2)挑選的優(yōu)質(zhì)卵母細胞作為受體細胞，挑選以步驟一獲得的MSTN突變 陽性細胞作為供體細胞，在顯微操作儀下進行去核及體細胞移植操作，得到重構卵；
[0193] 4)將步驟3)得到的重構卵放入融合儀中進行融合與激活，得到重組胚胎；
[0194] 5)待步驟4)得到的重組胚胎發(fā)育5-7天后形成具有明顯內(nèi)細胞團的囊胚時進行 胚胎移植，將其移植到處于發(fā)情期的受體母豬的子宮內(nèi)；
[0195] 6)在胚胎移植28天后通過B超檢測受體母豬的妊娠情況，之后每兩周檢測一次以 確認其妊娠狀況直到妊娠約114天克隆豬出生，得到MSTN單等位基因突變克隆梅山豬。
[0196] 對MSTN單等位基因突變克隆梅山豬的MSTN基因進行測序，結果表明：MSTN單等 位基因突變克隆梅山豬的基因型為單等位基因突變型（MSTN+/)。單等位基因突變型為一條 同源染色體的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子發(fā)生缺失且第3800位核苷酸分子均由 T突變?yōu)镚，且另一條同源染色體的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子未發(fā)生缺失且第 3800位核苷酸分子未由T突變?yōu)镚。
[0197] 2、自然交配獲得MSTN雙等位基因突變克隆梅山豬
[0198] 待MSTN單等位基因突變克隆梅山豬（MSTN+/)發(fā)育成熟后將其與野生型梅山母豬 (MSTN+/+)交配，獲得F1代單等位基因突變的公豬和F1代單等位基因突變的母豬；將F1代 單等位基因突變的公豬和F1代單等位基因突變的母豬交配，獲得F2代公豬和F2代母豬。
[0199] 對F2代公豬和F2代母豬的個體基因型進行檢測，個體基因型檢測的方法如下：提 取個體耳組織的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用表1中的引物進行PCR擴增，得到 PCR擴增產(chǎn)物，并對PCR擴增產(chǎn)物測序，根據(jù)測序結果判斷個體的基因型。
[0200] 經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)：在F2代公豬和F2代母豬的個體中，共存在三種基因型：野生型 (MSTN+/+)、單等位基因突變型（MSTN+/)和雙等位基因突變型（MSTN7)。雙等位基因突變型 為兩條同源染色體的MSTN基因均僅第3782-3796位核苷酸分子均發(fā)生缺失，且第3800位 核苷酸分子均由T突變?yōu)镚的基因型；單等位基因突變型為一條同源染色體的MSTN基因第 3782-3796位核苷酸分子發(fā)生缺失且第3800位核苷酸分子均由T突變?yōu)镚，且另一條同源 染色體的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子未發(fā)生缺失且第3800位核苷酸分子未由T 突變?yōu)镚的基因型；野生型為兩條同源染色體的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均未 發(fā)生缺失且第3800位核苷酸分子均未由T突變?yōu)镚的基因型。其中，基因型為MSTN7克 隆梅山豬的MSTN打靶區(qū)域的測序結果如圖4?？寺∶飞截i及后代的MSTN基因變化情況與 其來源的細胞克隆相一致。
[0201] 三、MSTN突變梅山豬MSTNmRNA及蛋白表達情況
[0202] 采集F2代8月齡的基因型為MSTN7的梅山豬個體（MSTN/個體）、基因型為 MSTN+/的梅山豬個體（MSTN+/個體）和基因型為MSTN+/+的梅山豬個體（MSTN+/+個體）的背 肌及血清樣品液氮中速凍后，-80°C保存。取一定量的背肌樣品液氮中研磨成粉末，分別提 取RNA和蛋白樣品。
[0203] 1、序列分析
[0204] 對基因型為MSTN7的個體（MSTN7個體）和基因型為MSTN+/+的個體（MSTN+/+個 體）的背肌中MSTN基因的cDNA序列進行測序分析。具體步驟如下：
[0205] 1)使用Trizol(Invitrogen)法提取MSTN7個體和MSTN+/+個體組織的總RNA，并 使用第一鏈cDNA合成試劑盒（Fermentas)將mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。
[0206] 2)以獲得的cDNA為模板，采用MSTN-CDS引物（表5)進行PCR擴增，得到PCR擴 增產(chǎn)物即MSTN基因的⑶S區(qū)。
[0207]PCR反應體系：10yL5XBuffer、lyL10mMdNTP、lyL25yM正、反向引物、 0? 5yLRocheExpandHighFidelityPLUSPolymerase、2uLcDNA，加超純水至 50uL〇
[0208]PCR擴增程序：95°C5min;95°C30s，58°C30s，72°C70s，循環(huán) 30 次，最后 72°C延伸 5min〇
[0209]3)PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送測序公司測序。
[0210]PCR擴增產(chǎn)物的電泳結果如圖5所示：從圖中可以看出：MSTN+/個體擴增出現(xiàn)兩 條帶，MSTN+/+、MSTN/個體各有一條擴增條帶，而且MSTN/個體的擴增條帶比野生型個體小 約200bp，初步推測該片段缺失是由內(nèi)含子前段第二個堿基由T突變?yōu)镚，破壞了內(nèi)含子的 "GT-AG"剪接原則導致內(nèi)含子剪接前移的結果。
[0211] 測序結果如圖6所示：圖中不同顏色字母分別代表：紅色為第二外顯子堿基；藍色 為第二、三外顯子間內(nèi)含子的堿基；綠色為第三外顯子堿基。MSTN/個體的cDNA序列相對 MSTN+/+個體存在193bp的缺失，而且堿基缺失位置正好在第二外顯子末端向前193位，且 該處正好為存在"GT"的堿基對，這一缺失會導致翻譯提前終止，無法形成有功能的MSTN蛋 白。
[0212] 2、相對定量PCR檢測
[0213] 對MSTN7個體、MSTN+/個體和MSTN+/+個體的背肌中MSTN基因RNA水平的表達情 況進行了相對定量PCR檢測。具體步驟如下：
[0214] 1)使用Trizol(Invitrogen)法提取F2代8 月齡MSTN7個體、MSTN+/個體和 MSTN+/+個體組織的總RNA，并使用第一鏈cDNA合成試劑盒（Fermentas)將mRNA反轉(zhuǎn)錄獲 得cDNA。
[0215] 2)分別以MSTN7個體、MSTN+/個體和MSTN+/+個體的cDNA為模板，采用表5中 MSTN-qPCR引物進行相對定量PCR。
[0216] 檢測結果如圖7所示：和MSTN+/+個體相比，MSTN+/個體沒有MSTN基因的完整轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物，而MSTN/個體沒有MSTN基