一種從葡萄成熟果實(shí)中提取總rna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是從完全成熟后采摘、富含花色素的 葡萄果實(shí)組織中提取總RNA的方法。 技術(shù)背景：
[0002] RNA提取是分子生物學(xué)的基本技術(shù)之一，高質(zhì)量的RNA是后續(xù)進(jìn)行RT-PCR、熒光定 量PCR、Stem-loopRT-PCR、Northernblot等分子生物學(xué)研究的必要前提。目前，已經(jīng)發(fā) 展了多種RNA的提取方法，如異硫氰酸胍法、熱硼酸法、十二烷基硫酸鈉（SodiumDodecyl Sulfate，SDS)法、十六烷基三甲基溴化銨（CetyltrimethylammoniumBromide，CTAB)法 等。異硫氰酸胍能強(qiáng)烈抑制組織及提取液中RNase的活性，方法操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高、成本低， 但提取的RNA純度不是很高，需要做進(jìn)一步純化。熱硼酸法是通過(guò)高濃度的硼酸鹽抑制氧 化酶，使RNA免受多酚的干擾，且蛋白酶K可降解能氧化酚類和次生物質(zhì)的酶類，因此獲得 的RNA純度最高，但是該法所需藥品多、價(jià)格高、操作較復(fù)雜、容易被外源RNA酶降解。SDS 法可以去除果實(shí)中的多糖和酚類物質(zhì)，但提取的RNA純度仍不是很高。而CTAB法能較好地 解決以上4種方法中存在的問(wèn)題，所提取的總RNA完整性最好，獲得的數(shù)量也比較大，且所 需藥品簡(jiǎn)單，是提取果實(shí)總RNA較有效的一種方法。
[0003] 葡萄果實(shí)是一種富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織。酚類化合物在勻漿時(shí) 極易被氧化成醌類物質(zhì)，與RNA不可逆地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。多糖的理化性質(zhì) 與RNA相似，在提取過(guò)程中能與RNA共沉淀，很難將它們分開，這些都會(huì)嚴(yán)重影響到RNA的 提取質(zhì)量。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄果實(shí)中酚類化合物及次生代謝物的含量也隨之增加， 使得RNA的提取更加困難。采用傳統(tǒng)的CTAB法已經(jīng)不能實(shí)現(xiàn)從葡萄成熟果實(shí)中提取高質(zhì) 量的總RNA。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的是建立一種簡(jiǎn)便，易行，效果良好的從葡萄果實(shí)中提取總RNA的方 法，有效解決從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取總RNA的難題。
[0005] 本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，研究出了適用于從完全成熟的、富含花色素的、不同貯藏 期間的葡萄果實(shí)組織中提取總RNA的方法，具體包括如下步驟：
[0006] (1)吸取RNA提取液于離心管中，65°C預(yù)熱；所述的RNA提取液組份為：2% (W/V) 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)，2% (W/V)聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K40)，100mmol .L1三羥 甲基氨基甲烷（1^8-11(：1，？118.0)，100111111〇1噸1乙二胺四乙酸伍0丁厶，？118.0)，2.5111〇1噸1 氯化鈉（似(：1)，0.58，1/亞精胺；
[0007] (2)按每1克葡萄果實(shí)加入10毫升RNA提取液的比例，稱取葡萄果實(shí)，迅速轉(zhuǎn)移至 用液氮預(yù)冷的研缽中，充分研磨直至成粉末狀；
[0008] (3)向步驟（1)中預(yù)熱的RNA提取液中加入少許巰基乙醇，迅速將葡萄果實(shí)粉 末轉(zhuǎn)移至離心管中，晃動(dòng)離心管，使液氮完全揮發(fā)，蓋住離心管蓋，劇烈震蕩混勻，60-65°C 孵育 10-20min;
[0009] (4)加入等體積的體積比為24 :1的氯仿-異戊醇，渦旋混勻；于4°C，8500rpm離 心15-25min，取上清至新的離心管中；
[0010] (5)重復(fù)步驟（4) 2-3 次；
[0011] (6)在上清液中加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻后于4°C放置0. 5-lh;之后4°C， 8500rpm離心20-30min，去上清，得到透明膠狀RNA粗提沉淀；
[0012] (7)用DEPC水配制的75-90 %乙醇清洗沉淀2次，室溫下風(fēng)干，將沉淀溶于DEPC 水中得到RNA溶液；
[0013] (8)在RNA溶液中加入等體積的體積比為5:1的酸性酚-氯仿，渦旋混勻， 14000rpm，4°C離心10_20min，取上清置于新的離心管中；
[0014] (9)重復(fù)步驟（8) 1次；
[0015] (10)在上清液中加入5mol?LWaCl溶液和體積比為24:1的氯仿-異戊醇，渦旋 混勾，14000rpm，4°C離心10_15min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中；
[0016] (11)在上清液中加入等體積的異丙醇，混勻后于4°C放置0. 5-lh沉淀RNA;之后 4°C，8500rpm離心20-30min，去上清，得到透明膠狀RNA沉淀；
[0017] (12)用DEPC7K配制的75-90 %乙醇清洗RNA沉淀2次，室溫下風(fēng)干，將沉淀溶于 DEPC水中。
[0018] 所述的RNA提取液中的亞精胺可用三鹽酸精脒代替。所述步驟（8)中的酸性酚為 pH值為4. 5 ±0. 2的水飽和酚。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0020] 在本發(fā)明中，亞精胺作為RNase抑制劑，有效地保證了RNA的完整性。
[0021 ] 在RNA提取液中加入可溶性PVP(K40)，PVP能與酚類物質(zhì)充分結(jié)合形成螯合物，通 過(guò)氯仿抽提將其除去，有效阻止酚類物質(zhì)與RNA結(jié)合。
[0022] 于加樣前在預(yù)熱的提取液中加入強(qiáng)還原劑0 -巰基乙醇，與PVP協(xié)同作用，有效抑 制了酚類物質(zhì)的氧化，這種處理比在提取液中單獨(dú)加入0 _巰基乙醇或PVP的效果要好。
[0023] 提高RNA提取液中NaCl的濃度為2. 5mol?L\在高濃度NaCl溶液中，由于溶解 度差異，CTAB與多糖形成復(fù)合物沉淀，以有效去除多糖。
[0024] 酸性酚在酸性條件下，RNA被分配于水相，DNA和蛋白質(zhì)在有機(jī)相，從而最大限度 的除去蛋白和DNA，提高RNA的產(chǎn)率和純度。
[0025] 本發(fā)明的方法經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定，提取的RNA樣品純度高、完整性好，適用于從葡萄成熟 果實(shí)中提取總RNA。
【附圖說(shuō)明】：
[0026] 圖1為玫瑰香葡萄果實(shí)貯藏期間對(duì)照組與302保鮮組總RNA的凝膠電泳圖。泳道 1 :貯藏初期葡萄果實(shí)總RNA;泳道2、4 :對(duì)照組在貯藏20d、60d后葡萄果實(shí)總RNA;泳道3、 5 :S02保鮮組在貯藏20d、60d后葡萄果實(shí)總RNA。
[0027]圖2為玫瑰香葡萄果實(shí)不同貯藏時(shí)期對(duì)照組與S02保鮮組中相關(guān)基因的RT-PCR分 析。
【具體實(shí)施方式】：
[0028] 實(shí)施例1 :
[0029] 玫瑰香葡萄果實(shí)不同貯藏時(shí)期對(duì)照組與302保鮮組總RNA提取
[0030] (1)吸取2ml提取液于離心管中，65°C預(yù)熱；RNA提取液組份為：2% (W/V)十六烷 基三甲基溴化銨（CTAB)，2% (W/V)聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K40)，100mmol?L1三羥甲基氨 基甲烷（Tris-HCl，pH8. 0)，lOOmmol?L1乙二胺四乙酸（EDTA，pH8. 0)，2. 5mol?L1氯化 鈉（NaCl)，0. 5g?L1亞精胺。
[0031] (2)取液氮速凍的不同貯藏時(shí)期對(duì)照組與S02保鮮組（貯藏初期、貯藏20d和60d) 玫瑰香葡萄果實(shí)各200mg左右，在液氮中將其研磨成粉末。
[0032] (3)向向步驟⑴中預(yù)熱的RNA提取液中加入25yL0 -巰基乙醇，迅速將葡萄果 實(shí)粉末轉(zhuǎn)移至離心管中，晃動(dòng)離心管，使液氮完全揮