一種從黃酒麥曲中提取微生物總dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從黃酒麥曲中提取微生物總DNA的方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃酒麥曲是以乳碎的小麥為原料，經(jīng)過加水拌曲、壓塊成型并堆放在一定的溫度 和濕度條件下，富集培養(yǎng)釀酒有益微生物制得的糖化發(fā)酵劑。麥曲中微生物群系復(fù)雜，是黃 酒釀制的主要微生物來(lái)源，這些微生物在黃酒制作過程中共同作用，最終形成了黃酒獨(dú)特 的風(fēng)格，因此黃酒麥曲有著"酒之骨"的美譽(yù)。
[0003] 黃酒麥曲中微生物的研究一直是麥曲的研究重點(diǎn)，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)不僅工作量 大，耗時(shí)耗力，而且無(wú)法全面的了解微生物的組成，利用分子手段研究麥曲則能夠避免傳統(tǒng) 方法的不便。利用分子手段分析一定環(huán)境下微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)，基因組提取的質(zhì)量對(duì)后續(xù) 的分析有著很大的影響，高質(zhì)量的提取麥曲中的宏基因組對(duì)全面的剖析麥曲微生物群落結(jié) 構(gòu)有著重要作用。
[0004] 麥曲的制作在自然開放的環(huán)境中完成，且制曲時(shí)間較長(zhǎng)（3個(gè)月左右），微生物來(lái) 源廣泛（制曲用水、小麥、空氣微生物等），造就了麥曲復(fù)雜的微生物體系。相關(guān)研究中將麥 曲制作過程中微生物的生長(zhǎng)變化分為孢子發(fā)芽期、生長(zhǎng)繁殖期和產(chǎn)酶成熟期3個(gè)階段，之 后麥曲還要經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的放置過程，隨著水分含量的降低，麥曲中的大量霉菌、細(xì)菌產(chǎn)生成 孢子、芽孢，所以麥曲是一種含有真菌、細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)體、孢子和芽孢的復(fù)雜體系，在進(jìn)行群落 結(jié)構(gòu)解析時(shí)需要同時(shí)獲得他們的基因組。麥曲在制作過程中經(jīng)過了小麥乳碎的操作，小麥 中含有豐富的淀粉、蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直接進(jìn)入了麥曲體系，長(zhǎng)時(shí)間的麥曲制作過程使其中 的微生物能夠充分的利用麥曲中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也產(chǎn)生了各種代謝產(chǎn)物，這都影響了 麥曲中DNA的提取。麥曲中起重要作用的霉菌，如米曲霉、米根霉等在制曲完成后大多以孢 子形式存在，孢子易于懸浮不易進(jìn)入提取液，同時(shí)孢子不容易破壞孢子壁，這也將會(huì)阻礙提 取過程。
[0005] 麥曲總DNA的提取有著重重阻礙，而麥曲總DNA的提取是以分子手段研究麥曲的 基礎(chǔ)，因此亟需一種高質(zhì)量提取麥曲總DNA的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)麥曲這種含有真菌、細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體、孢子和芽孢的 復(fù)雜微生物體系，提供了一種高質(zhì)量從黃酒麥曲中提取微生物總DNA的方法。
[0007] 所述方法，包括：
[0008] (1)在麥曲中加入ddH20和吐溫80,并加入玻璃珠，振蕩搖勾，然后在超聲波清洗 器中振蕩5~lOmin，使麥曲中的菌體盡量進(jìn)入懸液中，低速離心后取上清；
[0009] (2)將步驟⑴得到的懸液高速離心的菌體沉淀；
[0010] (3)向步驟（2)得到的菌體中加入DNA抽提液，混懸后液氮條件下充分研磨；
[0011] ⑷向步驟⑶得到的溶液中加入溶菌酶，于37°c條件下放置30~40min;
[0012] (5)向步驟（4)得到的溶液中加入加入SDS溶液并立即蛋白酶K，65°C水浴45~ 65min；
[0013] (6)向步驟（5)得到的溶液中加入CTAB抽提液，65°C水浴45~65min;
[0014] (7)將步驟（6)得到DNA粗提液進(jìn)行純化得到麥曲總DNA。
[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述用于提取的麥曲的質(zhì)量為4~6g;ddH20的加量 為12~18mL，吐溫80的終質(zhì)量濃度為0. 04~0. 06% ;
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述低速離心是指離心力為200~500g，高速離心 是指離心力為10000~12000g。
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述DNA抽提液配方為100mmol/LTris-HCl，pH 8.0,100mmol/LEDTA,pH8.0,100mmol/LNa3P04,1. 5mol/LNaCl；
[0018] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述DNA抽提液添加量為500~600yL。
[0019] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述溶菌酶的質(zhì)量濃度為50mg/mL，加入量為8~ 12yL;
[0020] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述SDS的終質(zhì)量濃度為1. 8~2. 2% ;蛋白酶K的 質(zhì)量濃度為20mg/mL，加入量為4~6yL。
[0021] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述0^抽提液的配方為2%0^，1.4111〇1/1^(：1， lmol/LTris-HCL，0? 5mol/LEDTA;CTAB抽提液的加量為 700 ~1200yL。
[0022] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述DNA粗提液的純化，是將樣品用等體積的氯仿 與異戊醇體積比為24:1的氯仿-異戊醇抽提2~3次，然后用0. 6~0. 7倍體積的異丙醇 沉淀，離心取沉淀，用lml70 %的乙醇洗滌沉淀2~3次，去除水分，干燥得DNA，然后加入 ddH20溶解DNA，并加入10~20yL/mL的RNA酶處理，以去除DNA。
[0023] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述DNA粗提液的純化，具體是將所得樣品用等體 積的氯仿-異戊醇（體積比24:1)混均后于4°C條件下，12000g，離心10~15min，抽提2~ 3次；加入0. 6~0. 7倍體積的異丙醇于-20°C沉淀lh;4°C，12000g離心10min，收集核酸沉 淀；加入lml70%的乙醇于4°C條件下，12000g，離心10min，洗滌沉淀2~3次，倒扣去除過 量水分，于37°C干燥DNA;加100yLddH20溶解沉淀，加入終濃度為10~20yL/mL的RNA 酶，并在37°C下消化30~45min，以去除RNA。
[0024] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體是：
[0025] (1)取5g麥曲樣品加15mlddH20置于50ml離心管中并添加終質(zhì)量濃度為0.04% 的吐溫80,加入適量玻璃珠，充分振蕩5min;4°C條件于KQ700E超聲波清洗器中超聲振蕩 5min;200g離心力離心5min，取上清，10000g離心10min;收集沉淀，加2mlddH20混懸均勾 轉(zhuǎn)移至2mlEP管；10000g離心10min，得菌沉淀；
[0026] (2)菌沉淀加入 0? 5mLDNA抽提液（100mmol/LTris-HCLpH8. 0,100mmol/L EDTA，pH8. 0,100mmol/LNa3P04,1. 5mol/LNaCl)混懸，液氮條件下充分研磨菌體；
[0027](3)向⑵得到的溶液中加入10yL溶菌酶（50mg/mL)，37°C條件下放置30min;;
[0028] (4)向（3)得到的溶液中加入125yL10%SDS，立即加入5yL蛋白酶K(20mg/ mL)，混均后65°C水浴lh;
[0029] (5)向⑷得到的溶液中加入700yLCTAB緩沖液，混均后65°C水浴lh;
[0030] (6)步驟（5)所得樣品用等體積的氯仿-異戊醇（體積比24:1)混均后于4°C條 件下，12000g，離心lOmin，；
[0031] (7)重復(fù)步驟（6)2次；
[0032] (8)向步驟（7)得到的溶液中加入0? 6倍體積的異丙醇于-20°C沉淀lh;
[0033] (9)將步驟⑶得到溶液于4°C，12000g條件下離心lOmin，收集核酸沉淀；
[0034] (10)向步驟（9)得到的沉淀中加入lml70%的乙醇于4°C條件下，12000g，離心 lOmin；
[0035] (11)重復(fù)步驟（10)2 次；
[0036] (12)吸去步驟（11)得到樣品的清液，收集沉淀，倒扣去除過量液體，于37°C干燥 DNA；
[0037] (13)向步驟（12)得到的樣品中加入lOOyLddH20溶解沉淀，加入終濃度為 10yL/mL的RNA酶，并在37°C下水浴消化45min，以去除RNA。
[0038] 本發(fā)明的有益效果：
[0039] (1)本發(fā)明方法提取得到的麥曲總DNA樣品中，DNA質(zhì)量濃度達(dá)到149. 6ng/yL，對(duì) 其中的真菌及細(xì)菌PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳得到的條帶單一明亮，A260/A280達(dá)到1. 93,A260/ A230達(dá)到1. 84,說(shuō)明本發(fā)明方法能夠?qū)Ⅺ溓幸枣咦有问酱嬖诘恼婢?、以芽孢形式存在?細(xì)菌等菌體DNA得到有效提取，同時(shí)能夠除去麥曲體系中存在的大量多糖污染。本發(fā)明方 法得到的總DNA能夠直接用于PCR，無(wú)需再使用試劑盒對(duì)提取的樣品進(jìn)行純化，從而建立了 一種可以用于分子生物