大黃魚(yú)C凝集素Nattectin基因及其重組蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物凝集素，尤其是涉及一種大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin基因及其重 組蛋白和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大黃魚(yú)是我國(guó)養(yǎng)殖量最大的海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，每年直接產(chǎn)值達(dá)數(shù)十億元。但近 年來(lái)由于養(yǎng)殖密度的增大和海水污染程度的加重，導(dǎo)致疫病頻發(fā)，嚴(yán)重阻礙了大黃魚(yú)養(yǎng)殖 業(yè)的健康發(fā)展，導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)于大黃魚(yú)疾病的防治主要采用化學(xué)藥物，如 抗生素類(lèi)。但由此造成病原菌抗藥性增強(qiáng)、水產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)和環(huán)境污染嚴(yán)重等一系列 問(wèn)題。因此，尋找一種環(huán)境友好、切實(shí)可行的免疫防治方法、促進(jìn)我國(guó)大黃魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的可持 續(xù)發(fā)展已成為當(dāng)前海水養(yǎng)殖業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。
[0003] C型凝集素是最早發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物凝集素之一。與其他凝集素所不同的是C型凝集 素含有一個(gè)保守的糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域（CRD)，可專(zhuān)一地與異物表面特定的糖基結(jié)合并吸附、 凝集異物，從而促進(jìn)機(jī)體清除異物。近年，C型凝集素作為模式識(shí)別受體受到國(guó)內(nèi)外學(xué) 者的廣泛關(guān)注，其在動(dòng)物的免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用，包括凝集、吞噬、抗病毒、誘 導(dǎo)酸氧化酶系統(tǒng)的激活和激發(fā)呼吸爆發(fā)等（Dambuza IM and Brown⑶.C-type lectins in immunity:recent developments. Curr Opin Immunol. 2015. 32:21-27) 〇 -般 C 型凝 集素分為兩類(lèi)：一類(lèi)是甘露糖特異性C型凝集素，能夠特異性結(jié)合甘露糖和/或海藻糖 終止的多糖；另一類(lèi)是半乳糖特異性C型凝集素，能夠特異性識(shí)別半乳糖和N-乙酰氨基 半乳糖終止的多糖（Weis WI, et al. The C-type lectin superfamily in the immune system. Immunol Rev. 1998, 163:19e34)。Nattectin屬于后者，其最早分離于有毒的納氏 海蟾魚(yú)（Thalassophryne nattereri)，具有凝集紅細(xì)胞的作用，并可以激活老鼠的嗜中性 粒細(xì)胞，說(shuō)明其具有免疫調(diào)節(jié)的功效（Saraiva TC et al. Structural and biological characterization of Nattectin, a new C-type lectin from the venomous fish Thalassophryne nattereri. Int Immunopharmacol. 2011，11:1546-1556) 〇 但是，迄今尚未 有Nattectin的細(xì)菌凝集作用的報(bào)道，本發(fā)明為首例發(fā)現(xiàn)Nattectin的細(xì)菌凝集作用。
[0004] C型凝集素重組蛋白，大多以包涵體的形式存在，包涵體存在復(fù)性困難且很難保持 生物學(xué)活性等問(wèn)題，因此，在實(shí)際應(yīng)用中受到很大程度的限制。本發(fā)明采用一步脫鹽法就可 以同時(shí)達(dá)到蛋白復(fù)性和脫鹽的目的。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，蛋白產(chǎn)量高，使低成本的規(guī)?；a(chǎn)成 為可能，為研制新型魚(yú)類(lèi)免疫添加劑和細(xì)菌防治藥物提供了一種新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的在于提供大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin的蛋白和核苷酸序列。
[0006] 本發(fā)明的第二目的在于提供大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin重組蛋白的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第三目的在于提供大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin重組蛋白在介導(dǎo)細(xì)菌凝集 中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第四目的在于提供大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin重組蛋白在介導(dǎo)紅細(xì)胞凝 集中的應(yīng)用。
[0009] 所述大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。
[0010] 所述大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin基因的核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。
[0011] 所述大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)構(gòu)建pET_32a_Nattectin重組表達(dá)載體，其具體方法如下：
[0013]用2條特異性引物擴(kuò)增Nattectin基因開(kāi)放閱讀框，并將其插入表達(dá)載體的 pET-32aBamH I和EcoR I多克隆位點(diǎn)間，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序證明構(gòu)建表達(dá)載體成功；
[0014] 所述2條特異性引物為：
[0015] 正向引物 PF: CCGGAATTCATGGCATCAGCTCTTCATTTCA ；
[0016] 反向引物 PR: CCGCTCGAGTTGTAAGGCGTCCTTGGCAC ；
[0017] 劃線(xiàn)部分為BamH I和EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn)；
[0018] (2)獲得轉(zhuǎn)化子高拷貝的大腸桿菌表達(dá)菌株pET-32a-Nattectin-BL21，其具體方 法可為：
[0019] 經(jīng)熱轉(zhuǎn)化，氨芐青霉素篩選，獲得陽(yáng)性克隆菌株pET-32a-Nattectin-BL21。
[0020] (3)轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)；
[0021] 誘導(dǎo)表達(dá)條件為：菌液0D600值0· 6~0· 8,0· ImM的IPTG，18°C，90rpm過(guò)夜誘導(dǎo) 12h〇
[0022] (4)重組蛋白Nattectin的純化和復(fù)性，具體方法如下：
[0023] 用鎳離子柱純化包涵體重組蛋白，再?gòu)?fù)性得到可溶性蛋白。
[0024] 在步驟⑷中，所述用鎳離子柱純化包涵體重組蛋白的洗脫液配方可為： 160mMimidazole，8M Urea，IOOmM NaH2PO4, IOmM Trisbase，pH 8. 0 ;所述復(fù)性可米用一步脫 鹽法復(fù)性，即脫鹽柱直接對(duì)純化的包涵體脫鹽，可同時(shí)達(dá)到復(fù)性和脫鹽的目的，最終得到溶 于PBS的重組蛋白。
[0025] 所述大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin重組蛋白可在介導(dǎo)細(xì)菌凝集中應(yīng)用。
[0026] 所述大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin重組蛋白可在介導(dǎo)紅細(xì)胞凝集中應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0028] 本發(fā)明提供的Nattectin基因和蛋白序列為新型C凝集素，僅在有毒的納氏海瞻 魚(yú)（T.nattereri)報(bào)道過(guò)，本發(fā)明為首次發(fā)現(xiàn)Nattectin凝集素具有細(xì)菌凝集活性。
[0029] 本發(fā)明表達(dá)的重組蛋白Nattectin具有廣譜凝集水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的作用，從而一 方面把病原菌局限在一定范圍內(nèi)，限制病原菌繼續(xù)侵染機(jī)體其他部位；另一方面可以促進(jìn) 機(jī)體快速清除病原菌。此外，表達(dá)的重組蛋白Nattectin對(duì)人類(lèi)、家兔和大黃魚(yú)血細(xì)胞具有 凝集作用。
[0030] 與以往天然獲得凝集素或者體外表達(dá)凝集素技術(shù)相比，本發(fā)明的制備方法具有以 下優(yōu)點(diǎn)：①操作簡(jiǎn)單：規(guī)模化生產(chǎn)時(shí)只需培養(yǎng)已誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白的細(xì)菌即可。②蛋白產(chǎn) 量高：因?yàn)榈鞍滓园w形式存在，產(chǎn)量非常高。③純化操作簡(jiǎn)單且蛋白穩(wěn)定：由于包涵體 外有一層膜包裹，故純化的時(shí)候蛋白不易散落，且容易與鎳離子柱結(jié)合，故純化操作簡(jiǎn)單、 蛋白穩(wěn)定。④復(fù)性簡(jiǎn)單：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)一步脫鹽法即可獲得可溶性的生物活性蛋白，這 在包涵體蛋白復(fù)性中是非常簡(jiǎn)單易行的，因?yàn)橥ǔ０w復(fù)性都是梯度尿素復(fù)性（即6、4、 2、1、0M尿素復(fù)性，此操作工序繁瑣，很難獲得具有生物活性的蛋白）。綜上所述優(yōu)勢(shì)，使得 C凝集素 Nattectin重組蛋白大批量，低成本的規(guī)?；a(chǎn)成為可能，為研制新型魚(yú)類(lèi)免疫 添加劑和細(xì)菌防治藥物提供了一種新的途徑。
[0031] 重組蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌（包括多種水產(chǎn)動(dòng)物致病菌）具有廣泛的凝集 作用。對(duì)大腸桿菌（Escherichia. Coli)、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)、溶 藻弧菌（V.alginolyticus)、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)和溶壁微球菌（Micrococcus Iysoleikticus)的最小凝集濃度 分別為 2· 12、2· 12、0· 266、1· 06、2· 66、0· 0664μg/ml。
[0032] 重組蛋白對(duì)人、家兔和大黃魚(yú)紅細(xì)胞具有明顯的凝集作用。最小凝集紅細(xì)胞的濃 度為 18. 75、37· 5 μ g/ml，18. 75 μ g/ml。
[0033] 本發(fā)明采用一步脫鹽法就可以同時(shí)達(dá)到蛋白復(fù)性和脫鹽的目的。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單， 蛋白產(chǎn)量高，使低成本的規(guī)?；a(chǎn)成為可能，為研制新型魚(yú)類(lèi)免疫添加劑和細(xì)菌防治藥 物提供了一種新的途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1為本發(fā)明的C凝集素 Nattectin在大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白及純化電泳 圖。在圖1中，Lane M :蛋白Marker ;Lane 1 :重組菌株未誘導(dǎo)；Lane 2 :誘導(dǎo)的總蛋白；Lane 3:誘導(dǎo)蛋白的上清液；Lane 4:誘導(dǎo)蛋白的沉淀；Lane 5:純化的重包涵體蛋白；Lane 6: 脫鹽后溶于PBS的重組蛋白。
[0035] 圖2為本發(fā)明的C凝集素 Nattectin對(duì)大腸桿菌（E. Coli)、副溶血弧菌 (V. parahaemolyticus)、溶藻弧菌（V. alginolyticus)、嗜水氣單胞菌（A. hydrophila)、金 黃色葡萄球菌（S. aureus)和溶壁微球菌（M. Iysoleikticus)的凝集作用。在圖2中，左圖 為BSA陰性對(duì)照組，右圖為Nattectin凝集組。
[0036] 圖3為C凝集素 Nattectin對(duì)人、家兔和大黃魚(yú)紅細(xì)胞的凝集作用。在圖3中，左 圖為BSA陰性對(duì)照組，右圖為Nattectin凝集組。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin cDNA序列的獲得
[0040] 1.大黃魚(yú)脾臟總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成
[0041 ] 用Trizol試劑抽提大黃魚(yú)脾臟總RNA，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性， 用紫外分光光度法檢測(cè)RNA的濃度和純度。用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)RNA，得到cDNA 第一條鏈。
[0042] 2.獲得大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin cDNA序列
[0043] 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室大黃魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)拼接Nattectin基因序列，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性 引物擴(kuò)增獲得大黃魚(yú)C凝集素 Nattectin。引物序列為：
[0044] 正向引物 NF: ATGGCATCAGCTCTTCATTTCA ;
[0045] 反向引物 NR: TTGTAAGGCGTCCTTGGCAC。
[0046] PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min，然后30個(gè)循環(huán)：94°C變性45s，70°C退火45s， 72°C延伸45s ;最后72°C延伸lOmin。純化的PCR產(chǎn)物與載體pMD-19T相連，篩選陽(yáng)性克隆 子并測(cè)序。
[0047] 應(yīng)用BLAST工具將大黃魚(yú)Nattectin的核苷酸和氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已 有的Nattectin基因/蛋白比對(duì)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述的大黃魚(yú)Nattectin與已有大黃魚(yú) Nattectin的核苷酸序列相差4個(gè)堿基SEQ ID N0:2,并且相差一個(gè)氨基酸序列SEQ ID NO: 1〇
[0048] SEQ ID NO: 1的信息（參見(jiàn)序列表，下劃線(xiàn)為相差的氨基酸序列）
[0049] MASALHFIVLLCGLWIGANVISAHHLGGCPHRWTKHGCRCFRFFNTPKPWAEAERFCTLHGGNLAS VLTREEGNLISSMMTTTAWVGGYDKVQDGVWLWSDGRKFDFHLWRK