參與西瓜葫蘆素e合成的基因簇及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及參與西瓜萌蘆素E合成 的基因簇及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 西瓜的苦味是由一類稱為萌蘆素E的三萜化合物導(dǎo)致的。西瓜果實(shí)中積累萌蘆素 E會(huì)嚴(yán)重影響西瓜的口感及品質(zhì)。前期研究利用基因組學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等手段揭 示了由9個(gè)基因參與的黃瓜苦味物質(zhì)萌蘆素C的合成途徑，其中包括1個(gè)氧化角鯊烯環(huán)化 酶Bi，7個(gè)細(xì)胞色素P450基因和1個(gè)乙?；D(zhuǎn)移酶基因，并利用生物化學(xué)方法完全闡明了 四步反應(yīng)，其對(duì)于萌蘆科植物中其他類型的萌蘆素生物合成路徑的研究具有重要的指導(dǎo)意 義，也為植物中其他三萜化合物的通路解析提供了新思路。萌蘆素具有抗蟲作用，并且醫(yī)學(xué) 研究證明萌蘆素能夠抑制多種癌細(xì)胞生長(zhǎng)，目前萌蘆素主要從植物中提取獲得，不能通過 異源生物合成。而西瓜中參與萌蘆素E生物合成的基因還沒有被克隆，萌蘆素E生物合成 路徑的解析將為開發(fā)新型抗癌藥物提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇及其應(yīng)用。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供參與西瓜萌蘆素E合成的蛋白，包括 Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007080、Cla007081、Cla007082、Cla008354 和 Cla008355,它們的氨基酸序列分別如SEQIDNo. 1-8所示。
[0005] 本發(fā)明還提供參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇，所述基因簇由以下8個(gè)基因組 成，Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007080、Cla007081、Cla007082、Cla008354 和 Cla008355,它們的核苷酸序列分別如SEQIDNo. 10-17所示。
[0006] 本發(fā)明還提供含有所述參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇的載體、工程菌及宿主細(xì) 胞。
[0007] 本發(fā)明還提供所述參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇在調(diào)控西瓜苦味合成中的應(yīng) 用。
[0008] 本發(fā)明還提供所述參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇在調(diào)控萌蘆素體外合成中的 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明還提供所述參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇在無(wú)苦味西瓜分子育種中的 應(yīng)用。
[0010] 前期研究中利用基因組學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等手段揭示了由9個(gè)基因參與 的黃瓜苦味物質(zhì)萌蘆素C的合成途徑，以此為基礎(chǔ)，通過將西瓜中的環(huán)化酶基因與黃瓜中 的氧化角鯊烯環(huán)化酶基因Bi進(jìn)行進(jìn)化樹分析，找到了一個(gè)與黃瓜Bi基因同源性最高的基 因Cla007080(Bi)，利用酵母表達(dá)體系證明了該基因編碼萌蘆二烯醇合成酶，是萌蘆素合 成的關(guān)鍵酶。萌蘆二烯醇還需要進(jìn)一步被氧化和乙酰化才能生成萌蘆素。為了解析萌蘆 素E合成的其他步驟，利用比較基因組學(xué)方法在西瓜基因組中找到了一個(gè)類似于黃瓜萌 蘆素C合成的基因簇：由 6 個(gè)P450 基因（Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007082、 Cla008354 和Cla008355)、l個(gè)乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（Cla007081)和 1 個(gè)Bi基因（Cla007080) 組成。這8個(gè)基因在西瓜各個(gè)組織中的表達(dá)狀態(tài)非常相似，只在根中大量表達(dá)。此外，除了 基因Cla008354和Cla008355以外，其他基因與Bi基因均位于6號(hào)染色體57kb的范圍內(nèi)， 形成一個(gè)類似基因簇的結(jié)構(gòu)。目前，以基因簇的形式參與重要次生代謝產(chǎn)物合成在高等植 物中被廣泛發(fā)現(xiàn)，因此推測(cè)這8個(gè)候選基因很可能參與了萌蘆素E的合成。
[0011] 進(jìn)一步利用酵母表達(dá)體系，在酵母中表達(dá)這些候選基因，用UPLC-Q-T0F儀分析 產(chǎn)物的精確分子量，推測(cè)可能發(fā)生的氧化反應(yīng)產(chǎn)物，解析萌蘆素E合成中間步驟。首 先，在表達(dá)Bi、還原酶CPR和Cla008354的酵母中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)特異產(chǎn)物，一個(gè)分子量為 441. 3727[M+H]，另一個(gè)為 457. 3676[M+H]，經(jīng)過MS、MS/MS結(jié)果分析推測(cè)Cla008354 為多 功能P450,在萌蘆二烯醇合成中先羰基化，再羥基化。進(jìn)一步將該產(chǎn)物從酵母中純化分 離出來(lái)，利用核磁共振（NMR)解析其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)萌蘆二烯醇的11號(hào)碳原子先發(fā)生羰基化 (C3QH4S02)，然后在20號(hào)碳原子上發(fā)生羥基化（C3(]H4S03)，進(jìn)而證Cla008354可連續(xù)氧化萌蘆 二烯醇，催化萌蘆素E合成的第二步和第三步。由于基因Cla008354與Cla008355高度同 源，經(jīng)過相同的方法驗(yàn)證基因Cla008355也具有相同的功能，即也能夠催化萌蘆二烯醇的 11號(hào)碳原子先發(fā)生羰基化（C3(]H4S02)，然后在20號(hào)碳原子上發(fā)生羥基化（C3(]H4S03)。繼續(xù)利 用酵母表達(dá)體系，表達(dá)更多的候選基因，利用類似的方法，僅在表達(dá)Bi、CPR、Cla008354 (或 Cla008355)和Cla007079的酵母提取物中發(fā)現(xiàn)分子量為473. 3625[M+H]的特異產(chǎn)物，推 測(cè)上一步催化產(chǎn)物被Cla007079羥基化，進(jìn)一步將該產(chǎn)物從酵母中純化分離出來(lái)，利用 核磁共振（NMR)解析其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在2號(hào)碳原子上發(fā)生了羥基化（C3(]H4S04)，進(jìn)而證明了 Cla007079催化萌蘆素E合成的第四步。
[0012] 本發(fā)明首次在西瓜基因組中發(fā)現(xiàn)參與萌蘆素E合成的基因簇，共由8個(gè)基因組成， 其中6個(gè)基因均位于6號(hào)染色體57kb的范圍內(nèi)。利用酵母體系成功解析了萌蘆素E合成 的第1至第4步反應(yīng)。本發(fā)明進(jìn)一步揭示了西瓜苦味形成的分子機(jī)制，為無(wú)苦味西瓜育種 提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標(biāo)，可用于大規(guī)模篩選育種材料，大大加快高品質(zhì)西瓜 的育種進(jìn)程；同時(shí)還為萌蘆素的體外人工合成提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)，本發(fā)明可替代傳統(tǒng)的從植 物材料中提取苦味素（萌蘆素）的方法，利用合成生物學(xué)從而實(shí)現(xiàn)體外合成苦味素。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為本發(fā)明通過比較基因組學(xué)以及RNA-Seq數(shù)據(jù)分析，從西瓜基因組中發(fā)現(xiàn)與 苦味素（萌蘆素E)合成相關(guān)的基因簇。
[0014] 圖2為本發(fā)明利用UPLC-Q-T0F檢測(cè)參與苦味素合成第二步和第三步反應(yīng)的結(jié)果； 其中，A為UPLC-Q-T0F檢測(cè)到的Cla008354和Cla008355的特異產(chǎn)物，B為該特異產(chǎn)物的 MS/MS檢測(cè)結(jié)果，C為核磁共振NMR結(jié)構(gòu)解析結(jié)果。
[0015] 圖3為本發(fā)明利用UPLC-Q-T0F檢測(cè)參與苦味素合成第四步反應(yīng)的結(jié)果；其中，A 為UPLC-Q-T0F檢測(cè)到的Cla007079的特異產(chǎn)物，B為該特異產(chǎn)物的MS/MS檢測(cè)結(jié)果，C為核 磁共振NMR結(jié)構(gòu)解析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。
[0017] 實(shí)施例1參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇的挖掘與獲得
[0018] 1、基因簇的挖掘
[0019] 以黃瓜苦味物質(zhì)萌蘆素C合成基因簇研究為基礎(chǔ)，利用比較基因組學(xué)方法，在西 瓜基因組中找到了一個(gè)類似于黃瓜萌蘆素C合成的基因簇，共找到8