一種基于酶切法檢測β-酪蛋白基因型的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種基于酶切法檢測β -酪蛋白基因型的方法。
【背景技術】
[0002]牛奶中的蛋白質主要分為酪蛋白和乳清蛋白兩種，酪蛋白在牛奶蛋白中的含量約占80%左右，乳清蛋白約占14%。牛奶蛋白中一般含有四種酪蛋白，α S1-酪蛋白、a S2_酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白，其中β-酪蛋白約占酪蛋白總量的25-35%。
[0003]酪蛋白中含有209個氨基酸，而它至少含有13種不同的氨基酸組成，因此分為A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、1、G。目前大多數(shù)養(yǎng)殖奶牛生產的β _酪蛋白，主要為Al β -酪蛋白和Α2β-酪蛋白兩種類型。在生物體內，β-酪蛋白會水解產生一類由4-11個氨基酸組成，起始氨基酸為酪氨酸的多肽——β -酪啡肽，BCM7 (Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-1le)就是從這類多肽中分離出來的一種類似嗎啡的活性肽，它能夠刺激淋巴T細胞的增殖。研究表明，BCM7主要是由Al-酪蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶水解下產生，這是由于Α2-酪蛋白67位脯氨酸與其相鄰的66位和68位的氨基酸有比較穩(wěn)定的二級結構，而Al-酪蛋白67位組氨酸與鄰近氨基酸的二級結構不穩(wěn)定，因而容易被水解。很多研究表明，BCM7能夠導致缺血性心臟病、動脈粥樣硬化、I型糖尿病、新生兒猝死癥以及一些精神方面的疾病。
[0004]Al β -酪蛋白的攝入與人類疾病之間的關系主要基于流行病學研究，Al β -酪蛋白與相關疾病的危險因素數(shù)據(jù)和死亡數(shù)據(jù)主要來源于世界衛(wèi)生組織。新西蘭流行病學證據(jù)表明Α2牛奶比Al牛奶更有益于人類健康。McLachlan對16個國家30-69歲的男性中Al牛奶與心臟病發(fā)病率進行了調查，統(tǒng)計結果表明，缺血性心臟病與Al牛奶的消耗有很強的關聯(lián)性(s = 0.86)。Ell1tt比較了 10個國家0-14歲兒童I型糖尿病的發(fā)病率，Al β -酪蛋白與其有較大的關聯(lián)性(s = 0.726)，在冰島，由于當?shù)氐哪膛Ｖ饕獮棣?奶牛，所以該地糖尿病和心臟病的發(fā)病率很低。動物學實驗也表明表明，喂養(yǎng)Al牛奶的兔子與喂養(yǎng)Α2牛奶的兔子相比，膽固醇和血脂水平更高。
[0005]因此，我們需要找到一種能夠有效區(qū)分Al奶牛和Α2奶牛的方法，從而使得養(yǎng)殖場只繁育Α2奶牛，但目前的檢測方法無法檢測出β-酪蛋白不同的基因型，不能保證人們喝的牛奶為Α2牛奶。

【發(fā)明內容】

[0006]鑒于目前檢測β_酪蛋白基因型的方法存在的上述不足，本發(fā)明提供一種檢測出β-酪蛋白不同的基因型的基于酶切法檢測β-酪蛋白基因型的方法。
[0007]為達到上述目的，本發(fā)明的實施例采用如下技術方案:
[0008]一種基于酶切法檢測β -酪蛋白基因型的方法，該方法包括以下步驟:
[0009]根據(jù)β -酪蛋白的堿基序列，設計出含有Dde I酶切位點的引物，所述引物的序列為:
[0010]上游引物:5，ACCCCA ATT TCT TAA CCA AAC C3，
[0011]下游引物:5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3，；
[0012]利用引物擴增出片段，所述片段可使Α2β-酪蛋白中產生一個Dde I酶切位點；
[0013]用引物對待檢測的奶?；蚪MDNA進行PCR擴增；
[0014]利用限制性內切酶Dde I進行酶切，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結果進行判斷。
[0015]依照本發(fā)明的一個方面，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結果進行判斷，具體為:
[0016]如果PCR擴增后的產物無法被Dde I切開或存在一個253bp的條帶，則β -酪蛋白為Al β-酪蛋白；
[0017]如果PCR擴增后的產物進行酶切后同時存在一個218bp的條帶和一個35bp的條帶，則3-酪蛋白為八2 3-酪蛋白；
[0018]如果PCR擴增后的產物進行酶切后同時存在一個218bp的條帶和一個253bp的條帶，則3-酪蛋白為八認2 3-酪蛋白。
[0019]依照本發(fā)明的一個方面，所述酶切的體系包括PCR產物9ul、限制性內切酶0.2ul和緩沖液Iul ;所述酶切的條件為37°C孵育l_8h，65°C熱失活20min。
[0020]依照本發(fā)明的一個方面，在β -酪蛋白的67位氨基酸附近設計出含有Dde I酶切位點的引物，所述酶切的條件為37°C孵育2h，65°C熱失活20min。
[0021]依照本發(fā)明的一個方面，所述PCR擴增的體系為DNA模板50ng、熱啟動Taq DNA聚合酶 0.lU/ul、2.5uM dNTPlul、1uM 上下游引物各 lul、2XLengend PCR BufferlOul、加ddH20 至 20ul。
[0022]依照本發(fā)明的一個方面，所述PCR擴增的條件:在溫度為92_95°C時預變性5min，然后在溫度為92-95°C時變性15s、在溫度為52-65°C時退火30s、在溫度為68_72°C時延伸30s，進行多個循環(huán)，最后在溫度為68-72°C時延伸7min。
[0023]依照本發(fā)明的一個方面，所述PCR擴增進行35個循環(huán)。
[0024]依照本發(fā)明的一個方面，所述PCR擴增的條件:在溫度為95°C時預變性5min，然后在溫度為95°C時變性15s、在溫度為61°C時退火30s、在溫度為72°C時延伸30s，進行35個循環(huán)，最后在溫度為72°C時延伸7min。
[0025]本發(fā)明實施的優(yōu)點:本發(fā)明的檢測方法首先根據(jù)β -酪蛋白的堿基序列，在β -酪蛋白的67位氨基酸附近設計出含有Dde I酶切位點的引物，所述引物的序列為:
[0026]上游引物:5，ACCCCA ATT TCT TAA CCA AAC C3，
[0027]下游引物:5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3，；
[0028]然后利用引物擴增出片段，所述片段可使Α2β-酪蛋白中產生一個Dde I酶切位點；再用引物對待檢測的奶?；蚪MDNA進行PCR擴增；最后利用限制性內切酶Dde I進行酶切，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結果進行判斷，本發(fā)明的檢測方法利用Al β -酪蛋白與Α2β-酪蛋白67位氨基酸的第二個堿基不同，設計出特異性的引物，使Α2β-酪蛋白產生一個Dde I酶切位點，而Al β -酪蛋白沒有酶切位點，然后利用酶切技術，從而有效區(qū)分出Al β -酪蛋白與Α2 β -酪蛋白，因此，本發(fā)明人提供的基于酶切法檢測β -酪蛋白基因型的方法能檢測出β -酪蛋白不同的基因型，從而保證人們喝的牛奶為Α2牛奶。
【附圖說明】
[0029]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0030]圖1為本發(fā)明所述的一種基于酶切法檢測β -酪蛋白基因型的方法的示意圖；
[0031]圖2為本發(fā)明所述酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0032]下面將結合附圖對本發(fā)明作進一步說明。
[0033]如圖1、圖2所示，一種基于酶切法檢測β -酪蛋白基因型的方法，該方法包括以下步驟:
[0034]根據(jù)β -酪蛋白的堿基序列，設計出含有Dde I酶切位點的引物，所述引物的序列為:
[0035]上游引物:5，ACCCCA ATT TCT TAA CCAAAC C3，
[0036]下游引物:5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3，；
[0037]利用引物擴增出片段，所述片段可使Α2β-酪蛋白中產生一個Dde I酶切位點；
[0038]用引物對待檢測的奶?；蚪MDNA進行PCR擴增；
[0039]利用限制性內切酶Dde I進行酶切，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結果進行判斷。
[0040]由于牛奶中蛋白質主要有乳清蛋白和酪蛋白兩大類，牛奶蛋白中一般含有四種酪蛋白:aSl-酪蛋白、aS2_酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白，其中β-酪蛋白約占酪蛋白總量的25-35%，是氨基酸的重要來源，同時在體內傳遞重要的礦物質(如鈣和磷等)，促進