鑒別豬源附紅細(xì)胞體種類的試劑盒、方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物血液中支原體感染檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別豬源附紅細(xì) 胞體種類的試劑盒、方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 附紅細(xì)胞體?。╡perythrozoonosis)是由附紅細(xì)胞體（Mycoplasma spp.)寄生于 多種動(dòng)物和人的紅細(xì)胞表面、血漿和骨髓，引起的以溶血性貧血、黃疸等為主要特征的血液 感染性疾病。附紅細(xì)胞體是一種重要的人獸共患病原，在動(dòng)物中分布相當(dāng)廣泛，豬、牛、羊、 犬、兔、雞和人等都是附紅細(xì)胞體的易感動(dòng)物，其中豬的發(fā)病率較高。豬的附紅細(xì)胞體病不 僅導(dǎo)致畜產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量降低，而且導(dǎo)致豬的生育能力下降，在臨床上又常與其他疾病并 發(fā)感染，給診斷造成困難，導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重的臨床癥狀甚至死亡，阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展， 造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是急待控制的疫病之一。
[0003] 目前報(bào)道感染豬的附紅細(xì)胞體有2種，分別是豬附紅細(xì)胞體（Mycoplasma suis) 和小附紅細(xì)胞體（Mparvum)。在以往的研究中，人們主要是根據(jù)這2種附紅細(xì)胞體的形態(tài) 和致病性的不同將它們區(qū)別開來(lái)。
[0004] 近年來(lái)附紅細(xì)胞體病的各種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要包括鏡檢、血清學(xué)檢測(cè)和分子生 物學(xué)診斷。鏡檢可能由于鮮血壓片造成紅細(xì)胞變形，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。血清學(xué)方法 不僅可用于診斷，還可以進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，但由于附紅細(xì)胞體不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，沒(méi)有大 量的抗原作為實(shí)驗(yàn)材料，致使血清學(xué)檢測(cè)不能大規(guī)模推廣。
[0005] 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP)是1974年Grodjicker等提出的一種核酸分析技術(shù)，根據(jù)來(lái)源于細(xì) 菌的限制性內(nèi)切酶通?？梢宰R(shí)別并消化長(zhǎng)度為4-6bp的特異性DNA序列（即酶切位點(diǎn)） 的特點(diǎn)，利用這些酶將較大的DNA分子降解成許多長(zhǎng)短不等的較小片段，所產(chǎn)生的DNA片 段的數(shù)目和長(zhǎng)度反映了酶切位點(diǎn)在DNA分子上的分布，對(duì)于每一個(gè)DNA與限制性內(nèi)切酶 的組合來(lái)說(shuō)，所產(chǎn)生的片段是特異性的。當(dāng)酶切位點(diǎn)存在DNA多態(tài)性，或者在位點(diǎn)之間存 在改變酶切DNA片段長(zhǎng)度的更大突變時(shí)，就可采用該方法檢測(cè)不同物種間的差異，進(jìn)行 鑒別。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鏈接限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（polymerase chain reaction linked restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技術(shù)是對(duì) RFLP 的一種 改進(jìn)，它將PCR技術(shù)和RFLP技術(shù)進(jìn)行組合，可以分析PCR擴(kuò)增的特殊基因組DNA區(qū)域，將 擴(kuò)增片斷用一個(gè)或更多個(gè)限制性內(nèi)切酶消化并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，然后分析限制 性片斷的多態(tài)性，可以有效地確定種和株間特異性的遺傳標(biāo)記。相比PCR克隆測(cè)序進(jìn)行 物種鑒定，PCR-RFLP更快速、高效、直觀。例如Bowles和McManus建立了快速鑒別棘球蚴 (Echinococcus spp.)種和株的PCR-RFLP技術(shù)，這種方法提供了簡(jiǎn)單、高度敏感和快速鑒 別種和株的技術(shù)；1996年，Gasser等將其應(yīng)用于線蟲種類的鑒定；同年，Leng等研究建立了 一種PCR-RFLP方法，可以檢測(cè)、區(qū)分微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum)、鼠隱孢子 蟲（C.muris)和貝氏隱孢子蟲（C.baileyi)三種隱孢子蟲。PCR-RFLP技術(shù)在微生物物種鑒 定方面得到了廣泛應(yīng)用，但至今為止，國(guó)內(nèi)外尚無(wú) PCR-RFLP技術(shù)在附紅細(xì)胞體種類鑒定方 面的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于16S rRNA基因的鑒別豬源附紅細(xì)胞體 種類的試劑盒，該試劑盒能夠正確鑒別豬源附紅細(xì)胞體的兩個(gè)種類即豬附紅細(xì)胞體和小附 紅細(xì)胞體，且鑒定過(guò)程快速簡(jiǎn)便，結(jié)果易判斷。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種鑒別豬源附紅細(xì)胞體種類的試劑盒，該試劑盒 包含：用于擴(kuò)增SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示豬源附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列的引 物對(duì)，以及限制性內(nèi)切酶Sca I或Ssp I。
[0009] 優(yōu)選的，所述引物對(duì)的序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[0010] 所述試劑盒還包含：PCR反應(yīng)緩沖液及聚合酶。
[0011] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種鑒別豬源附紅細(xì)胞體種類的方法，包括以下 步驟：
[0012] 針對(duì)豬源附紅細(xì)胞體16S rRNA基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該對(duì)引物用于擴(kuò)增豬源附紅細(xì) 胞體16S rRNA基因 SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列；
[0013] 用所述引物對(duì)待測(cè)豬源附紅細(xì)胞體樣品DNA的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0014] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Sca I或Ssp I酶切，根據(jù)酶切片段的大小和位 置鑒別豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體。
[0015] 優(yōu)選的，所述引物的序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[0016] 所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Sca I酶切后，如果產(chǎn)生3個(gè)酶切片斷，且該3個(gè)酶切片段 大小為16-6%?、592-612&?、78%?，則判定為豬附紅細(xì)胞體；如果產(chǎn)生2個(gè)酶切片斷，且該2 個(gè)酶切片段大小為16_80bp、1398-1410bp，則判定為小附紅細(xì)胞體。
[0017] 所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Ssp I酶切后，如果產(chǎn)生2個(gè)酶切片斷，且該2個(gè)酶切片段大 小為609-621bp、805-870bp，則判定為小附紅細(xì)胞體；如果沒(méi)有酶切片斷產(chǎn)生，仍為擴(kuò)增片 段全長(zhǎng)，則判定為豬附紅細(xì)胞體。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述鑒別豬源附紅細(xì)胞體種類的試劑盒在制備診 斷豬的附紅細(xì)胞體病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明基于16S rRNA基因的鑒別豬源附紅細(xì)胞體種類的試劑盒，能夠正確快速地 鑒定豬源附紅細(xì)胞體的種類，有利于附紅細(xì)胞體病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及生物學(xué)特性研 究，為豬源附紅細(xì)胞體病的防控打下基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0021] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的豬源附紅細(xì)胞體16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0022] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的重組質(zhì)粒pMD-16S rRNA的雙酶切鑒定圖；
[0023] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例2的豬源附紅細(xì)胞體16S rRNA基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Sca I、 Ssp I酶切結(jié)果圖；
[0024] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例3豬源附紅細(xì)胞體16S rRNA基因 PCR產(chǎn)物的Sca I酶切結(jié) 果圖；
[0025] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例3豬源附紅細(xì)胞體16S rRNA基因 PCR產(chǎn)物的Ssp I酶切結(jié) 果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（薩姆布魯克J，拉塞爾D W，著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南， 第3版，北京：科學(xué)出版社，2002)中所述的方法進(jìn)行。
[0027] 本發(fā)明以豬源附紅細(xì)胞體16S rRNA基因作為靶基因，對(duì)感染豬的兩種附紅細(xì)胞體 基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用Sca I酶和Ssp I 2種限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化， 分析酶切產(chǎn)物的多態(tài)性，據(jù)此來(lái)對(duì)感染豬的2種附紅細(xì)胞體即豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞 體進(jìn)行鑒定，建立了基于16S rRNA基因的鑒別豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體的RFLP技術(shù)。
[0028] 實(shí)驗(yàn)材料
[0029] 1.豬源附紅細(xì)胞體陽(yáng)性DNA
[0030] I. 1豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性DNA編號(hào)SJ-5,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所隱孢子 蟲病防治課題組保存提供，分離自上海松江區(qū)某屠宰場(chǎng)成年育成豬新鮮血液，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光 定量PCR技術(shù)鑒定為豬源附紅細(xì)胞體陽(yáng)性，16S rRNA和rnpB基因序列分析鑒定為豬附紅細(xì) 胞體陽(yáng)性。
[0031] 1. 2小附紅細(xì)胞體陽(yáng)性DNA編號(hào)JD-71，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所隱孢子 蟲病防治課題組保存提供，分離自上海嘉定區(qū)某屠宰場(chǎng)成年育成豬新鮮血液，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光 定量PCR技術(shù)鑒定為豬源附紅細(xì)胞體陽(yáng)性，16S rRNA和rnpB基因序列分析鑒定為小附紅細(xì) 胞體陽(yáng)性。
[0032] 1. 3豬源附紅細(xì)胞體田間陽(yáng)性DNA共40份DNA樣品，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī) 研究所隱孢子蟲病防治課題組保存提供，這些樣品分離自上海某3個(gè)屠宰場(chǎng)的成年育成豬 新鮮血液，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)鑒定為豬源附紅細(xì)胞體陽(yáng)性，rnpB基因序列分析初步 鑒定種類。
[0033] 2.菌株、試劑
[0034] 限制性內(nèi)切酶 Fast Digest Sca I、Fast D