一種檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌的hda試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌的HDA試劑盒及檢測(cè)方法，屬于檢驗(yàn)檢 疫領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 水稻是世界最重要的糧食作物之一，全球約有一半人口以水稻為主食。水稻細(xì)菌 性條斑病，又稱細(xì)條病、條斑病，是水稻主要病害之一，對(duì)水稻產(chǎn)量造成了嚴(yán)重的影響。該病 由細(xì)菌引起，病原菌為水稻細(xì)菌性條斑病菌（XawiAomwas orjzae1 pv.oTTzicc^a)。2007 年，農(nóng)業(yè)部會(huì)同國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局共同制定了《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性 有害生物名錄》，該目錄將水稻細(xì)菌性條斑病明確列為水稻的檢疫性病害。重視并加強(qiáng)水稻 細(xì)菌性條斑病菌的檢驗(yàn)檢疫工作，對(duì)切實(shí)保障水稻的安全生產(chǎn)有著重要意義。
[0003] 根據(jù)《中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于水稻細(xì)菌性條斑病菌的 檢測(cè)方法規(guī)定，對(duì)于出入境種子首先需要進(jìn)行樣品的清洗、研磨并獲得提取液，然后進(jìn)行平 板培養(yǎng)，或利用ELISA試劑盒對(duì)提取液進(jìn)行快速篩選檢測(cè)。對(duì)于檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的還需進(jìn) 行進(jìn)一步的平板分離和生化鑒定。整個(gè)過(guò)程程序復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，且在操作過(guò)程中可能產(chǎn)生假 陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)為依托的檢驗(yàn) 方法已應(yīng)用于水稻細(xì)菌性條斑病菌的檢測(cè)，該方法雖然靈敏準(zhǔn)確，但需要高品質(zhì)熱循環(huán)儀， 成本較高，難以大范圍應(yīng)用在基層單位的日常檢驗(yàn)檢疫工作中，而且，PCR反應(yīng)溫度循環(huán)的 過(guò)程導(dǎo)致了反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，增加了檢驗(yàn)的時(shí)間成本。因此，有必要開(kāi)發(fā)一種更加準(zhǔn)確、快捷、 成本低、簡(jiǎn)單易操作的檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌的方法。
[0004] 依賴解旋酶 DNA 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Helicase-Dependent isothermal DNA Amplification，簡(jiǎn)稱HDA)是由美國(guó)NEB公司于2004年開(kāi)發(fā)的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該 技術(shù)只需在恒定溫度下進(jìn)行，不需要溫度變化的過(guò)程，因此，在實(shí)際操作和儀器要求方面， HDA技術(shù)都比PCR技術(shù)更為便捷和廉價(jià)，真正使樣品的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了快速、簡(jiǎn)便和低成本，從 而更容易被開(kāi)發(fā)出檢測(cè)的應(yīng)用產(chǎn)品。
[0005] HDA技術(shù)原理是利用解旋酶在恒溫條件下解開(kāi)DNA雙鏈，同時(shí)DNA單鏈結(jié)合蛋白 (SSB)穩(wěn)定解開(kāi)的單鏈為引物提供結(jié)合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互補(bǔ)鏈，新合成的 雙鏈在解旋酶的作用下又形成單鏈，并作為下一輪合成的模板進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，最終實(shí) 現(xiàn)靶序列的指數(shù)增長(zhǎng)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：等溫?cái)U(kuò)增，HDA技術(shù)在一個(gè)恒定溫度就能完成擴(kuò) 增反應(yīng)，不需要像普通PCR那樣循環(huán)的溫度變化，可以減少擴(kuò)增時(shí)間；設(shè)備簡(jiǎn)單，HDA反應(yīng)不 需要復(fù)雜和昂貴的熱循環(huán)儀設(shè)備，只需要一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫器就可進(jìn)行。因此，HDA技術(shù)有望 成為一種重要的檢驗(yàn)檢測(cè)工具。
[0006] 目前，國(guó)際上對(duì)于HDA技術(shù)的研究和應(yīng)用尚處于起步階段，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有關(guān)于HDA 法檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌的研究。我們將首次提供快速檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌的HDA 試劑盒，并建立起相應(yīng)檢測(cè)方法。該發(fā)明是水稻細(xì)菌性條斑病菌檢測(cè)技術(shù)體系的進(jìn)一步完 善和發(fā)展。該方法的建立，將使得水稻細(xì)菌性條斑病菌的檢測(cè)真正實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快捷、成本低 和簡(jiǎn)單易操作，特別適用于在基層單位的日常檢驗(yàn)檢疫工作中大范圍推廣，可為我國(guó)的水 稻細(xì)菌性條斑病的有效防治做出貢獻(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種更加準(zhǔn)確、快捷、成本低和簡(jiǎn) 單易操作的檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌的HDA試劑盒及檢測(cè)方法。
[0008] 本發(fā)明所述檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌的HDA試劑盒包括：一對(duì)特異性檢測(cè)水稻細(xì) 菌性條斑病菌的HDA引物對(duì)，以及IOX緩沖液、ATP、dNTPs、Bst polymerase、RecA蛋白、 UvrD heIicase、陽(yáng)性對(duì)照 DNA 和 ddH20 ; 所述HDA引物對(duì)序列為： SEQ ID No :1 :5' -GCACACCTGTATTGCATTGG-3' ； SEQ ID No :2 :5' -ATCTCATCGGTGCCTTTACG-3'。
[0009] 本發(fā)明所述檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌的HDA試劑盒檢測(cè)方法為： 1、 從待測(cè)樣本中提取DNA作為檢測(cè)模板：采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取待測(cè)樣本DNA， 保存?zhèn)溆茫?2、 利用上述HDA試劑盒，進(jìn)行HDA反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 所述檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌的HDA試劑盒包括：一對(duì)特異性檢測(cè)水稻細(xì)菌性條 斑病菌的HDA引物對(duì)，以及IOX緩沖液、ATP、dNTPs、Bst polymerase、RecA蛋白、UvrD heIicase、陽(yáng)性對(duì)照 DNA 和 CldH2O ; 所述HDA引物對(duì)序列為： SEQ ID No :1 :5' -GCACACCTGTATTGCATTGG-3' ； SEQ ID No :2 :5' -ATCTCATCGGTGCCTTTACG-3' ； 所述的HDA反應(yīng)體系為：5 μ L的10 X緩沖液，0. 2 μ mol的ATP，0. 1 μ mol的dNTPs，10U Bst polymerase，2_5yg RecA 蛋白，0.2_0.4yg UvrD helicase，2yL 的 lOymol/L 的上 游引物，2yL的lOymol/L的下游引物，2yL的樣品基因組DNA，用CldH2O補(bǔ)至50yL ; 所述的HDA反應(yīng)方法為：將反應(yīng)體系放入60-70°C恒溫水浴鍋中恒溫?cái)U(kuò)增90-120min ; 3、 檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并作出判斷； 所述的檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物并作出判斷是采用瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行，出現(xiàn)330bp的特 異性擴(kuò)增條帶即判斷為檢測(cè)出水稻細(xì)菌性條斑病菌。
[0010] 作為上述HDA試劑盒的一種優(yōu)選技術(shù)方案，10X緩沖液包括IOOmM二硫蘇糖醇、 350mM Tris-HAcUOOmM MgS04、lmg/mL BSA和25 μ M海藻糖，因此不必另外設(shè)置上述的二硫 蘇糖醇、Tris-HAc、MgS04、BSA和海藻糖，不僅大大簡(jiǎn)化了 HDA反應(yīng)過(guò)程，同時(shí)也節(jié)省了試劑 盒空間。
[0011] 作為上述HDA反應(yīng)體系的一種優(yōu)選技術(shù)方案，反應(yīng)體系中RecA蛋白的含量為 3 μ g〇
[0012] 作為上述HDA反應(yīng)體系的一種優(yōu)選技術(shù)方案，反應(yīng)體系中UvrD helicase的含量 為 0· 3 μ g。
[0013] 作為上述HDA反應(yīng)方法的一種優(yōu)選技術(shù)方案，將反應(yīng)體系放入65°C恒溫水浴鍋中 恒溫?cái)U(kuò)增IOOmin。
[0014] 本發(fā)明的有益效果為：所開(kāi)發(fā)的HDA檢測(cè)法具有極高的特異性，僅能從水稻細(xì)菌 性條斑病菌DNA中擴(kuò)增出特異性條帶，較生理生化檢測(cè)法具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性；所 提供的HDA檢測(cè)法在恒溫下就能進(jìn)行，反應(yīng)溫度不需要循環(huán)變化，較常規(guī)PCR檢測(cè)法速度更 快；擴(kuò)增反應(yīng)只需要普通水浴鍋就可以進(jìn)行，不需要復(fù)雜和昂貴的熱循環(huán)儀設(shè)備。因此，該 發(fā)明是水稻細(xì)菌性條斑病菌檢測(cè)技術(shù)體系的進(jìn)一步完善和發(fā)展，使得水稻細(xì)菌性條斑病菌 的檢測(cè)真正實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快捷、成本低和簡(jiǎn)單易操作，特別適用于在基層單位的日常檢驗(yàn)檢疫 工作中大范圍推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為本發(fā)明HDA法檢測(cè)不同小種的水稻細(xì)菌性條斑病原菌試驗(yàn)結(jié)果圖，其中， M ：DNA marker ；1~12 ： JantJiomonas oryzae pv. oryzicola RH3> RS85> RS105> HNB8-47> PX071、PX086、PX099、AHB4-75、JSB2-24、JSB3-22、YNB10-32、SCB4-1 ;13 :陽(yáng)性對(duì)照；14 :陰 性對(duì)照。
[0016] 圖2為本發(fā)明HDA法檢測(cè)水稻其他病原菌和其他植物病原菌的試驗(yàn)結(jié)果圖。其 中，M :DNA marker，1-11 pv. YN1、YN11、YN18、YN24、PX0347、 PX0349,PX0364,0S86,0S198,0S225,ZHE173 ；12 iXanthomonas axonopodis pv. citri YC ； 13 Xanthomonas campestris pv. campestris X8-1 ； 14-15 -.Ustilaginoidea oryzae LN> SX0201 ；16 -.Xanthomonas maltophilia\\l ： Burkholderia gladioli pv. alliicola ；18 ： Burkholder!a cepacia'll ·· Burkholderia glumae\2Q ： Pellicularia 曰f生 對(duì)照；22 :陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn) 方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)方法。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以 通過(guò)商業(yè)途徑獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0018] I. HDA引物對(duì)的設(shè)計(jì)： 在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索水稻細(xì)菌性條斑病菌（yTawiAomwas. OTTzae pv. 基因序列并利用NCBI中的BLAST工具進(jìn)行nucleotide blast比對(duì)，獲得水稻細(xì)菌性條斑 病原菌特異性基因 (GenBank號(hào)為：AY395713. 1)。引物的設(shè)計(jì)經(jīng)過(guò)同源性 對(duì)比，選取特異性較高的區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增