一種達巴萬星的分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物純化領(lǐng)域，特別是一種高效分離純化達巴萬星的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 達巴萬星（Dalbavancin)是新型半合成糖肽類抗生素，其作用機制與萬古霉素和 替考拉寧相同，通過抑制G+菌細胞壁的生物合成，可被廣泛用作治療皮膚和軟組織感染的 藥物。達巴萬星具有獨特的藥動學(xué)性質(zhì)，半衰期長，可每周間隔用藥，且能代謝完全。目前， 達巴萬星在治療導(dǎo)管相關(guān)的血源性感染以及皮膚和軟組織感染已取得了良好的效果，其具 有優(yōu)良的體內(nèi)抗菌活性和安全性，是理想的第二代糖肽抗生素。
[0003] 達巴萬星由結(jié)構(gòu)相近的B2五種成分組成，其中B。是其主要成分，這 五種成分具有相同的母核結(jié)構(gòu)。根據(jù)美國發(fā)明專利US20120184497Al的報道，達巴萬星作 為抗菌藥使用時，其主要成分B。要求應(yīng)不低于75%。達巴萬星是由放線菌代謝產(chǎn)物A40926 經(jīng)過氨基葡萄糖醛酸上的羧基酯化、38位羧基酰胺化、酯水解得到。達巴萬星的結(jié)構(gòu)式如 下：
[0006] 目前國內(nèi)外專利、文獻等對達巴萬星的分離純化方法鮮有報道。在國內(nèi)，目前 達巴萬星不存在化合物制備、分離相關(guān)的專利，僅存在三篇制劑或組合物相關(guān)的專利 CN200380103406. 2、CN200710140471. 2 和CN200380103406. 2。因此有必要對達巴萬星的分 離、純化和制備做更進一步的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種高效分離純化達巴萬星的方法，僅需一步層析純化即 可滿足達巴萬星主要組份B。含量高于75%的要求，純化收率高而穩(wěn)定，同時本發(fā)明分離方 法簡單方便，可用于規(guī)模化生產(chǎn)，大大降低生產(chǎn)成本。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種達巴萬星的分離純化方法，其特征 在于，將達巴萬星粗提取物進行溶解、過濾；將上述過濾后的達巴萬星溶液上樣到裝有聚苯 乙烯高分子聚合物微球的層析柱中進行層析；采用磷酸水溶液和有機溶劑作為流動相對達 巴萬星溶液進行梯度洗脫；分段收集目的峰值的達巴萬星溶液，對符合要求的組份液進行 匯總。
[0009] 優(yōu)選的，所述聚苯乙烯高分子聚合物微球為單分散的、具有孔道結(jié)構(gòu)的微球。
[0010]優(yōu)選的，所述微球的型號可以足PSk 30-300或
[0011] 優(yōu)選的，達巴萬星粗提取物溶解于10 % -20 %的酸性甲醇溶液中，其溶液pH值控 制在2_5。
[0012] 優(yōu)選的，磷酸水溶液中含有0. 1 %的磷酸。
[0013] 優(yōu)選的，有機溶劑可以為甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、異丙醇。
[0014] 優(yōu)選的，上樣前，對層析柱進行柱前預(yù)處理，先高濃度有機相進行除雜，后用濃度 低于20 %的有機相進行平衡。
[0015] 優(yōu)選的，所述梯度洗脫過程為，先用甲醇含量為40-50%的流動相沖洗5-10個柱 體積脫前雜，再用甲醇含量為45-55 %的流動相沖洗6-10個柱體積洗脫主峰，最后用甲醇 含量為65-75 %的流動相沖洗2-4個柱體積洗脫后雜。
[0016] PS"30-300和:PSk 40-300是苯乙烯單體通過聚合形成的粒徑分別為30ym和 40ym，孔徑3〇0A的高分子微球，該微球嚴格控制的粒徑大小和孔徑結(jié)構(gòu)（如圖1)，使其 作為色譜填料時具有很好的針對性，較好的契合了達巴萬星的分子大小與結(jié)構(gòu)，因此特別 適合用于純化達巴萬星。同時，聚苯乙烯基質(zhì)的該微球可耐受全pH范圍，并可在后期對層 析柱進行高PH下的徹底清洗，便于工業(yè)上反復(fù)利用，填料壽命長，降低成本。
[0017] 本發(fā)明采用有機溶劑和含0. 1 %磷酸的水溶液作為流動相，僅用6-10個柱體積就 可完成達巴萬星主峰的洗脫，因此本過程所用流動相安全、無污染且成本較低，并且使用的 流動相量較少，純化周期比較短。
[0018] 本發(fā)明采用單分散的PS#30-300和PS_K40-300作為固定相，僅需一步層析即 可使達巴萬星主要組份B。含量高于85%，收率可達88%。
[0019] 因此，本發(fā)明方法分離純化達巴萬星B。組分，不僅純度高、收率高且穩(wěn)定，而且操 作簡單方便，所用固定相可重復(fù)利用，所用流動相量少節(jié)約，大大降低成本。
【附圖說明】
[0020] 圖1為實施例1使用的PS30-300聚合物微球的的掃描電鏡照片。
[0021] 圖2為實施例1提純前的粗品的高效液相色譜分析。
[0022] 圖3為實施例1達巴萬星純化后的高效液相色譜分析。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的描述，但本發(fā)明并不限于這 些實施例。
[0024] 實施例1
[0025] 量取40mg/ml的達巴萬星粗品（58%純度）溶于20%乙醇溶液中，加一定量HCl 溶解，溶液PH值控制在2-5,超聲處理。待溶液澄清后，用孔徑為0. 45ym濾膜過濾，收集濾 液待用。采用4. 6X250mm的色譜柱，PSxUGO聚合物微球（蘇州納微科技有限公司生 產(chǎn)）作為層析柱填料，裝柱體積為4. 2ml。上樣前，對層析柱進行柱前預(yù)處理，先高濃度有 機相進行除雜，后用濃度低于20%的有機相進行平衡。然后采用0. 1 %的磷酸水溶液和甲 醇溶液作為流動相進行梯度洗脫，流速控制在lml/min。梯度洗脫過程為，先用甲醇含量為 45%的流動相沖洗8個柱體積脫前雜，后用甲醇含量為50%的流動相沖洗7個柱體積洗脫 主峰，再用甲醇含量為70 %的流動相沖洗3個柱體積洗脫后雜。分段收集目的峰值的溶液， 對符合要求的組份液進行匯總，經(jīng)高效液相色譜分析，洗脫液中達巴萬星B。的純度90 %，收 率 88%。
[0026] 圖2是提純前的達巴萬星粗品的高效液相色譜分析，可見雜質(zhì)非常多且雜。圖3 是提純后的達巴萬星高效液相色譜分析，可見雜質(zhì)少且濃度低。
[0027] 實施例2
[0028] 量取40mg/ml的達巴萬星粗品（58%純度）溶于20%乙醇溶液中，加一定量HCl 溶解，溶液PH值控制在2-5,超聲處理，待溶液澄清后，用孔徑為0. 45ym濾膜過濾，收集濾 液待用。采用4.6X250mm的色譜柱，PS"40..300:聚合物微球（蘇州納微科技有限公司生 產(chǎn)）作為層析柱填料，裝柱體積為4. 2ml。上樣前，對層析柱進行柱前預(yù)處理，先高濃度有 機相進行除雜，后用濃度低于20%的有機相進行平衡。然后采用0. 1 %的磷酸水溶液和甲 醇溶液作為流動相進行梯度洗脫，流速控制在lml/min。梯度洗脫過程為，先用甲醇含量為 45%的流動相沖洗8個柱體積脫前雜，后用甲醇含量為50%的流動相沖洗7個柱體積洗脫 主峰，再用甲醇含量為70 %的流動相沖洗3個柱體積洗脫后雜。分段收集目的峰值的溶液， 對符合要求的組份液進行匯總，經(jīng)高效液相色譜分析，洗脫液中達巴萬星B。的純度為87 %， 收率89 %。
[0029] 實施例3
[0030] 量取40mg/ml的達巴萬星粗品（58%純度）溶于20%乙醇溶液中，加一定量HCl 溶解，溶液PH值控制在2-5,超聲處理，待溶液澄清后，用孔徑為0. 45ym濾膜過濾，收集濾 液待用。采用4. 6X250mm的色譜柱，UnDOBPC聚合物微球（蘇州納微科技有限公司 生產(chǎn)）作為層析柱填料，裝柱體積為4. 2ml。上樣前，對層析柱進行柱前預(yù)處理，先高濃度有 機相進行除雜，后用濃度低于20%的有機相進行平衡。然后采用0.I%的磷酸水溶液和甲 醇溶液作為流動相進行梯度洗脫，流速控制在lml/min。梯度洗脫過程為，先用甲醇含量為 45%的流動相沖洗8個柱體積脫前雜，后用甲醇含量為50%的流動相沖洗9個柱體積洗脫 主峰，再用甲醇含量為70 %的流動相沖洗4個柱體積洗脫后雜。分段收集目的峰值的溶液， 對符合要求的組份液進行匯總，經(jīng)高效液相色譜分析，洗脫液中達巴萬星B。的純度74%，收 率 89%。
[0031] 實施例4
[0032] 量取40mg/ml的達巴萬星粗品（58%純度）溶于20%乙醇溶液中，加一定量HCl溶 解，超聲處理，待溶液澄清后，用孔徑為〇. 45ym濾膜過濾，收集濾液待用。采用4. 6X250mm 的色譜柱，UnfPMM40-500聚合物微球（蘇州納微科技有限公司生產(chǎn)）作為層析柱填 料，裝柱體積為4. 2ml。上樣前，對層析柱進行柱前預(yù)處理，先高濃度有機相進行除雜，后用 濃度低于20%的有機相進行平衡。采用0. 1%的磷酸水溶液和甲醇溶液作為流動相進行梯 度洗脫，流速控制在lml/min。梯度洗脫過程為，先用甲醇含量為45%的流動相沖洗10個 柱體積脫前雜，后用甲醇含量為50%的流動相沖洗12個柱體積洗脫主峰，再用甲醇含量為 70%的流動相沖洗4個柱體積洗脫后雜。分段收集目的峰值的溶液，對符合要求的組份液 進行匯總，經(jīng)高效液相色譜分析，洗脫液中達巴萬星B。的純度85%，收率60%。
[0033] 以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明 的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種達己萬星的分離純化方法，其特征在于，包括w下步驟：將達己萬星粗提取物 進行溶解、過濾；將上述過濾后的達己萬星溶液上樣到裝有聚苯乙締高分子聚合物微球的 層析柱中進行層析；采用憐酸水溶液和有機溶劑作為流動相對達己萬星溶液進行梯度洗 脫；分段收集目的峰值的達己萬星溶液，對符合要求的組份液進行匯總。2. 如權(quán)利要求1所述的達己萬星的分離純化方法，其特征在于，所述聚苯乙締高分子 聚合物微球為單分散的、具有孔道結(jié)構(gòu)的微球。3. 如權(quán)利要求2所述的達己萬星的分離純化方法，其特征在于，所述微球的型號是 PS'擇 30-300 或PS'早.40-300。4. 如權(quán)利要求1所述的達己萬星的分離純化方法，其特征在于，將達己萬星粗提取物 溶解于10% -20%的酸性甲醇溶液中，其溶液抑值控制在2-5。5. 如權(quán)利要求1所述的達己萬星的分離純化方法，其特征在于，所述憐酸水溶液中含 有0. 1 %的憐酸。6. 如權(quán)利要求1所述的達己萬星的分離純化方法，其特征在于，所述有機溶劑為甲醇、 乙醇、乙臘、丙酬、異丙醇。7. 如權(quán)利要求1所述的達己萬星的分離純化方法，其特征在于，上樣前，對層析柱進行 柱前預(yù)處理，先用高濃度有機相進行除雜，后用濃度低于20%的有機相進行平衡。8. 如權(quán)利要求1所述的達己萬星的分離純化方法，其特征在于，所述梯度洗脫過程為， 先用甲醇含量為40-50 %的流動相沖洗5-10個柱體積脫前雜，再用甲醇含量為45-55 %的 流動相沖洗6-10個柱體積洗脫主峰，最后用甲醇含量為65-75%的流動相沖洗2-4個柱體 積洗脫后雜。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高效分離純化達巴萬星的方法，包括以下步驟，將達巴萬星粗提取物進行溶解、過濾；將上述過濾后的粗溶液上樣到裝有聚苯乙烯高分子聚合物微球的層析柱中進行層析；采用磷酸水溶液和有機溶劑作為流動相對目標產(chǎn)物進行梯度洗脫；分段收集目的峰值的溶液，對符合要求的組份液進行匯總。本發(fā)明分離方法簡單，可規(guī)?；a(chǎn)，回收率高且穩(wěn)定。
【IPC分類】C07K9/00, C07K1/16
【公開號】CN105001309
【申請?zhí)枴緾N201510350279
【發(fā)明人】江必旺, 吳俊成, 陳榮姬, 潘毅
【申請人】蘇州納微科技有限公司
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年6月23日