用于表征ssdna序列的dsdna結(jié)合染料和探針的組合的制作方法
【專利說明】用于表征SSDNA序列的DSDNA結(jié)合染料和探針的組合
[0001] 相關(guān)申請的交叉參照 本申請要求2012年9月17日提交的美國臨時專利申請61/702, 019的優(yōu)先權(quán)，該申請 通過引用W其整體結(jié)合到本文中。
[0002] 本發(fā)明設(shè)及核酸序列的巧光檢測方法，并且設(shè)及用于進(jìn)行該樣的方法的試劑盒。 [000引發(fā)明背景 單鏈核酸祀序列的檢測和分析可包括使用巧光標(biāo)記的寡核巧酸雜交探針、引物或二 者。檢測可能是或可能不是"均相檢測"。均相檢測意思是不需要使結(jié)合的（雜交于祀的） 引物或探針與未結(jié)合的引物或探針分離的檢測。在適合于均相檢測的探針中有一端用巧光 團(tuán)標(biāo)記而另一端用巧滅劑（最常用的為非巧光巧滅劑）標(biāo)記的線性探針（例如，在Livak等 人（1995)PCRMethodsAppl. 4:357-362中描述的5'核酸外切酶探針）、一端用巧光部 分例如巧光團(tuán)標(biāo)記而另一端用巧滅劑標(biāo)記的發(fā)夾探針（例如，在Tyagi等人（1996)化化re Biotechnology14:303-308中描述的分子信標(biāo)探針）、在一條鏈上具有巧光團(tuán)而在另一條 鏈上具有巧滅劑的雙鏈探針（例如，在Li等人（2002)Nucl.AcidsRes. 30，No. 2e5 中描述的陰陽探針）、具有吸收來自巧光染料的發(fā)射和W較長的波長再發(fā)射的巧光團(tuán)的線 性探針（例如，在美國公布的專利申請US2002/0110450中描述的探針）和線性探針對，其 中一個探針用供體巧光團(tuán)標(biāo)記和一個探針用巧滅劑或受體巧光團(tuán)標(biāo)記，它們彼此在祀鏈上 接近地雜交，W致它們的標(biāo)記相互作用。標(biāo)記對例如巧光團(tuán)和巧滅劑可通過FRET相互作用 (例如，在美國專利6, 140, 054中描述的FRET探針對）。作為對FRET巧滅的替代，分子信標(biāo) 探針、5'核酸外切酶探針和陰陽探針可利用接觸巧滅，該不需要巧光部分的發(fā)射光譜和巧 滅劑的吸收光譜之間的大量的光譜重疊。Tyagi等人（1998)化化reBiotechnology16: 49-53;歐洲專利EP0 892 808。公布的國際專利申請WO2011/050173公開了單鏈核酸祀 序列的分析，該分析通過雜交于祀序列多個探針（包括一個或多個"化"探針（在雜交時發(fā) 信號的巧光團(tuán)/巧滅劑雙重標(biāo)記的探針）和一個或多個"Off"探針（在雜交時巧滅從"化" 探針發(fā)出的巧光的巧滅劑-標(biāo)記的探針））和分析作為溫度的函數(shù)的"化"探針的巧光團(tuán)的 巧光（一般借助于解鏈曲線或退火曲線）來進(jìn)行。
[0004]DNA結(jié)合染料（dsDNA-染料）是當(dāng)與雙鏈核酸相互作用時發(fā)巧光的染料，例如SYBR?綠。dsDNA-染料已W兩種方式用于核酸檢測。第一種方式是檢測雙鏈，不論在單獨 存在下還是在單鏈的存在下。該包括在雙鏈的存在下刺激染料并檢測從染料的發(fā)射。通 過dsDM-染料檢測雙鏈?zhǔn)欠翘禺愋缘?；即是說，它告知是否存在雙鏈，但沒有告知鏈的一 個或多個序列。第二種方式是將dsDNA-染料嵌入巧光標(biāo)記的探針和單鏈祀的雜合體中，W 其吸收波長刺激染料并W其發(fā)射波長檢測從探針的巧光標(biāo)記的發(fā)射，其中探針的標(biāo)記通過 FRET經(jīng)染料的發(fā)射激發(fā)。由于該設(shè)及FRET,探針的巧光部分的吸收光譜必須顯著重疊染料 的發(fā)射光譜。當(dāng)染料通過檢測作為雙鏈的非特異性指示劑的染料發(fā)射和通過檢測作為特定 序列的指示劑的探針發(fā)射與一個或多個探針結(jié)合使用時，通常有一種限制，即探針信號必 須可檢測地不同于染料信號。由于最常用的dsDNA-染料SYBR感綠具有與最常用的探針巧 光部分（巧光團(tuán)FAM)基本相同的發(fā)射光譜（見Van化ucke等人（2012)BioTechniques 52: 81-85的圖1)，二者通常不能一起使用。另外見Lind等人（2006)BioTechniques40:315-318,該作者報告FAM具有在493皿的最大激發(fā)和在525皿的最大發(fā)射，而SYBR? 綠具有在497皿的最大激發(fā)和在516皿的最大發(fā)射。Lind等人通過使用FAM-標(biāo)記的探 針，不是與SYBR綠，而是與可與FAM區(qū)分的不同dsDNA-染料即BEB0 (其具有在515nm最 大激發(fā)和在552nm的最大發(fā)射）解決了該問題。Van化ucke等人報告化qMan@ (5'核酸 酶）測定，一種生成攜帶巧光團(tuán)標(biāo)記的探針片斷的對稱PCR測定，其中探針的標(biāo)記是FAM和 其中SYBR敬綠被用來檢測制備的擴增子，在該種情況下為雙鏈擴增子。解鏈峰在約82°C獲 得。由于SYBR信號占優(yōu)勢，該指示雙鏈的解鏈一一一種某些產(chǎn)物已制得的非特異性指示。 然后通過在較高的溫度（在此溫度雙鏈解鏈，85°C)檢測，作者斷定由無模板對照（NTC)生 成的W上巧光是來自探針片斷。支持該結(jié)論的是該樣一個事實，即沒有高溫解鏈峰，不變地 是發(fā)巧光探針片斷不產(chǎn)生解鏈峰。當(dāng)然，沒有檢測探針-祀雜合體，因為它們將在低于雙 鏈擴增子的解鏈溫度的溫度下烙解掉。NeitherLind等人和Van化ucke等人均沒有利用 SYBR感綠dsDNA-染料分析單鏈。Van化ucke等人未使用FAM用于對作為溫度的函數(shù)的探 針結(jié)合進(jìn)行任何分析。
[0005] 概述 本發(fā)明包括利用當(dāng)與雙鏈締合時發(fā)出巧光的染料（所謂的DNA結(jié)合染料或dsDNA-染 料）分析單鏈核酸序列（RNA序列或者DNA序列（ssDNA))的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法利用 dsDNA-染料與雜交于祀核酸序列并用非巧光巧滅劑部分例如黑洞炬lack化le)巧滅劑標(biāo) 記的一個或多個雜交探針的組合。該樣的探針一般在此稱為"巧滅劑標(biāo)記的探針"。根據(jù)本 發(fā)明的方法包括在包括一個或多個該樣的雜交探針的解鏈溫度的溫度范圍內(nèi)，分析作為溫 度的函數(shù)的來自dsDNA結(jié)合染料的巧光。祀序列可W是一個或多個探針與之完全互補或不 完全互補的序列。在某些實施方案中，巧滅劑標(biāo)記的探針可W是如在下文解釋的"原位探 針"。
[0006] 為了在本發(fā)明的方法中使用dsDNA-染料，含有至少一個非巧光-巧滅劑標(biāo)記的探 針的巧滅劑標(biāo)記的探針或探針組可用來檢測和分析它們所雜交的有關(guān)序列?？捎糜诒景l(fā)明 的方法中的探針組可另外包括一個或多個包含巧光巧滅劑標(biāo)記或不包含任何巧滅劑標(biāo)記 的探針。
[0007]dsDNA-結(jié)合染料通?？捎糜诒景l(fā)明的方法中。最常用的dsDNA-結(jié)合染料 是SYBR③綠染料。其它dsDNA-染料包括漠化己錠、DAPI、B0和邸B0炬engtsson等人 (2003)NucleicAcidsResearch31:e45)。還有的另一種是B0XT0(Lind等人（2006) BioTechniques40:315-318)。據(jù)報道該些染料中的至少一些是小溝結(jié)合染料（minor groovebindingdyes)。在本發(fā)明的方法中dsDNA-染料可單獨或組合使用。
[0008] 可用于本發(fā)明的方法中的雜交探針包括線性的或無規(guī)卷曲探針和結(jié)構(gòu)化探針二 者。它們可W是RNA、DNA或RNA和DNA的組合。它們可包括非天然核巧酸、核巧酸類似 物和非天然核巧酸間鍵合。增加探針的結(jié)合親和力的非天然核巧酸和類似物包括，例如， 2'-0-甲基核糖核巧酸和PNA。結(jié)構(gòu)化探針可包含一條鏈（例如，分子信標(biāo)探針）或兩條鏈 (例如，陰陽探針）。本發(fā)明的某些實施方案利用最初包含引物延伸和作為擴增后檢測的部 分原位完成其構(gòu)建的探針。為了方便起見，我們稱該樣的探針為"原位探針"。
[0009] 可用于本發(fā)明的方法中的雜交探針包括未標(biāo)記的探針，或未標(biāo)記的寡核巧酸，和 標(biāo)記的探針。標(biāo)記根據(jù)探針與之一起應(yīng)用的dsDNA-染料進(jìn)行分類。為獲得染料發(fā)射，人 們用具有在或接近染料的最大吸收的波長的光激發(fā)樣品，并W染料的最大發(fā)射波長或接近 染料的最大發(fā)射波長檢測發(fā)射。該通常被稱為在儀器的染料通道中讀出，或者如果染料是 SYBR?綠，則在SYBR?綠通道中讀出。作為一個例子，對于SYBR#綠染料，典型的激發(fā)是 在470nm，例如通過藍(lán)色LED,而檢測使用510-nm發(fā)射濾波器進(jìn)行。第一類標(biāo)記是"染料巧 滅標(biāo)記"，即當(dāng)探針雜交于其祀，形成雙鏈區(qū)，而染料W其或接近其最大吸收波長激發(fā)時，巧 滅染料巧光的標(biāo)記。我們相信染料巧滅是通過巧光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)，為了方便起見，在 此將其稱為FRET巧滅。一般來說，或出現(xiàn)FRET,在染料的發(fā)射光譜和標(biāo)記的吸收光譜之間 應(yīng)該有顯著的重疊。染料巧滅標(biāo)記可W是非巧光巧滅劑，例如DABCYL、黑洞巧滅劑、QSY巧 滅劑、掩蔽巧滅劑巧clipsequencher)、深黑巧滅劑（DeepDarkquencher)、愛荷華黑巧滅 劑（IowaBlackquencher)或黑替巧滅劑炬laclcberryquencher)。如果非巧光巧滅劑是 高度有效的，例如，黑洞巧滅劑1或黑洞巧滅劑2,單一巧滅劑標(biāo)記就是足夠的。如果巧滅劑 的效率較低，例如DABCYL至少兩個巧滅劑標(biāo)記可能是需要的或甚至是必要的。合成具有單 一巧滅劑部分的探針比合成雙重標(biāo)記的探針要簡單且成本較低。最后構(gòu)建的原位探針可包 括單一的非巧光巧滅劑或沒有標(biāo)記。或者，染料巧滅標(biāo)記可W是巧光部分，例如巧光團(tuán)或量 子點，其不直接在用來激發(fā)染料的激發(fā)波長激發(fā)，而是經(jīng)FRET從染料接受能量，從而巧滅 染料發(fā)射，并W不同于（長于）檢測染料發(fā)射的波長的波長減弱巧光。例如，巧光團(tuán)Cal澄 從染料SYBR?綠接受能量。該樣的標(biāo)記通過激發(fā)ds-DNA染料而間接刺激，但不在或接近染 料的最大發(fā)射波長，而是在或接近巧光標(biāo)記的最大發(fā)射的較長波長獲得其巧光。當(dāng)發(fā)射在 或接近染料最大發(fā)射的波長檢測時，未檢測從標(biāo)記發(fā)射的巧光，且其影響僅僅是巧滅染料。 已知該一類巧光標(biāo)記用于ResonSense?探針。ResonSense?探針為用接受來自dsDNA-染料 的巧光的巧光團(tuán)標(biāo)記的單鏈寡核巧酸。當(dāng)含有雜交的ResonSense?探針的樣品WdsDNA-染 料吸收波長發(fā)光時，標(biāo)記經(jīng)FRET從染料吸收能量并W相當(dāng)于巧光團(tuán)的發(fā)射光譜的較長波 長再發(fā)射光。巧光團(tuán)是光譜上不同于染料的巧光團(tuán)。當(dāng)如此標(biāo)記的探針未雜交時，染料的 激發(fā)并不間接地激發(fā)巧光團(tuán)，如此巧光團(tuán)不需要巧滅。然而，如果需要直接刺激巧光團(tuán)，具 有染料巧滅巧光標(biāo)記的探針被雙重標(biāo)記并且具有使得其在未雜交時巧滅，但在雜交時為未 巧滅的并發(fā)射可檢測的信號的構(gòu)造，例如，巧滅的ResonSense?探針、分子信標(biāo)探針或陰陽 探針。第二類標(biāo)記是通過用來激發(fā)染料的光的波長激發(fā)的標(biāo)記。一個實例是當(dāng)與SYBR感綠 染料使用時的巧光團(tuán)FAM。FAM具有493nm的最大激發(fā)波長和525nm的最大發(fā)射波長，而 SYBR贊綠具有497nm的最大激發(fā)波長和521nm的最大發(fā)射波長。激發(fā)染料也激發(fā)標(biāo)記， 而在適合于染料的發(fā)射波長的檢測檢測來自染料和標(biāo)記二者的發(fā)射。該一類標(biāo)記導(dǎo)致該樣 的發(fā)射光譜，其不同于會在標(biāo)記不存在下僅從染料獲得的發(fā)射光譜（兩者作為解鏈曲線和 一階導(dǎo)數(shù)曲線）。我們稱該類標(biāo)記為"染料重合標(biāo)記"。具有染料重合標(biāo)記的探針是雙重標(biāo) 記的并具有使得其在未雜交時巧滅，但在雜交時為未巧滅的并發(fā)射可檢測的信號的構(gòu)造， 例如，分子信標(biāo)探針或陰陽探針。第=類標(biāo)記為既不能通過用來激發(fā)染料的光激發(fā)，也不能 通過FRET從染料接受能量的標(biāo)記，因為它們的吸收光譜既不與染料的吸收光譜，也不與染 料的發(fā)射光譜重疊。一個實例是當(dāng)與染料DAPI使用時的巧光團(tuán)AlexaFluor790。Alexa Fluor790在長于DAPI發(fā)射的波長吸收，因此染料的激發(fā)不直接或間接地激發(fā)標(biāo)記。在該 種類別中的標(biāo)記就設(shè)及在適合于染料的波長下激發(fā)和檢測而言是無關(guān)的，但它們可用來通 過獨立激發(fā)和檢測而獲得信息。我們稱該類標(biāo)記為"非重疊標(biāo)記"。具有非重疊標(biāo)記的探針 是雙重標(biāo)記的并具有使得其在未雜交時巧滅，但在雜交時為未巧滅的并發(fā)射可檢測的信號 的構(gòu)造，例如，分子信標(biāo)探針或陰陽探針。
[0010] 在本說明書中，我們提及引物和探針的解鏈溫度（"Tm")。"解鏈溫度"是核酸雜 合體（例如，探針-祀雜合體或引物-祀雜合體）為50%雙鏈和50%單鏈時的溫度。應(yīng)該 意識到，探針相對于更多互補的祀序列的Tm高于該探針相對于含有缺失、添加或一個或多 個錯配核巧酸的較少互補祀序列的Tm。對于具體的測定，可測定相關(guān)的Tm。Tm也可采用 已知的技術(shù)通過計算來估計。為此目的，我們采用Tmw，一種利用"最近鄰"方法計算的Tm (SantaLucia,J. (1998)，PMS化SA) 95: 1460-1465;和Allawi,H.T.和San化Lucia, J. (1997)，Biochem. 36: 10581-10594)。對于標(biāo)記的探針（線性的和結(jié)構(gòu)化二者），應(yīng) 該理解，計算的Tmw為近似值。例如，在實施例1中獲得的數(shù)據(jù)表明，用黑洞巧滅劑1標(biāo)記 探針減少探針的實際Tm約5°C。W下更全面地描述的"原位探針"具有初始Tm和最終Tm。 初始Tm是在引物延伸中初始探針序列的50% 3'末端接觸相同鏈內(nèi)的祀序列時的溫度。原 位延伸W建立最終探針后，雜合體的初始Tm被較高的最終Tm替代。
[0011] 本發(fā)明的方法利用探針組，所謂探針組我們指指雜交于祀序列的一個探針或多個 探針。單一探針，包括單一原位探針，可用來檢測單核巧酸多態(tài)性（"SNP")。在該樣一個 實施方案中，探針為其在祀中的互補序列包括SNP的染料巧滅探針。當(dāng)用于特定祀序列的 探針組包含單一探針時，所述探針包括非巧光巧滅劑標(biāo)記。該樣的實施方案的一個實例由 實施例1舉例說明，其中單一探針用或者一個或者兩個黑洞巧滅劑標(biāo)記。單一染料巧滅探 針也可用非巧光染料巧滅標(biāo)記和巧光染料巧滅標(biāo)記、染料重合標(biāo)記或非重疊標(biāo)記進(jìn)行多重 標(biāo)記。我們通常設(shè)計與祀序列的野生型或藥物敏感性變體更多互補和與突變體或耐藥變體 較少互補的單一探針。在包括一些利用原位探針的實施方案在內(nèi)的某些實施方案中，我們 作了相反的工作。在自報道原位探針的情況下，通常需要設(shè)計單鏈3'末端W與一個序列變 體例如序列的野生型版本更完全互補，而與3'末端最初與其雜交的序列中的其它版本、SNP 較不完全互補。
[0012] 當(dāng)探針組含有多個探針時，探針組包括如在前面的段落中描述的至少用非巧光巧 滅劑標(biāo)記的至少一個染料巧滅探針。染料巧滅探針可W是原位探針。優(yōu)選的多探針組包括 兩個或更多個該樣的染料巧滅探針。該樣一個實施方案的實例由實施例2舉例說明，其中 探針組包括6個探針，各自單獨地用黑洞巧滅劑標(biāo)記。再次回到該里，多探針組中的該樣的 探針可W用染料巧滅巧光標(biāo)記（見實施例5)、染料重合標(biāo)記（見實施例3)或非重疊標(biāo)記 進(jìn)行多重標(biāo)記。在一些實施方案中，多探針組可包括一個或多個未標(biāo)記的探針或一個或多 個僅用巧光染料巧滅標(biāo)記標(biāo)記的探針。在某些實施方案中，原位探針例如可W是未標(biāo)記的。 在多探針組的情況下，需要有足夠的染料巧滅W提供有意義的區(qū)分信息，所述信息設(shè)及當(dāng) 樣品W或接近dsDNA-染料的最大吸收波長激發(fā)和檢測W或接近染料的最大發(fā)射波長進(jìn)行 時獲得的祀序列，如在下文結(jié)合實施例5所闡述的。
[0013] 用來設(shè)計多探針組的主要標(biāo)準(zhǔn)是用來檢測的溫度范圍和探針組所雜交的祀序列 的長度。溫度范圍低于雙鏈擴增子的Tm，該確定了上限。下限為在檢測儀器的能力范圍內(nèi) 選擇的溫度，通常至少與室溫一樣高。在選擇了溫度范圍的情況下，探針Tm被設(shè)計在該范 圍內(nèi)。為使給定類型的探針，比如說DNA探針適合于該范圍，人們可調(diào)整探針的長度或其與 祀序列變體互補的程度，或二者。當(dāng)多探針組的探針雜交于它們的單鏈核酸祀序列時，探針 沿著祀序列展開W便選出序列變體。它們可彼此直接鄰接雜交，可有鄰近的探針的中度重 疊，或者可在鄰近雜交的探針之間存在一個、幾個或甚至許多個核巧酸的缺口。我們優(yōu)選缺 口最小。在探針組中的探針可具有，且通常確實具有不同的探針-祀Tm，其允許巧光輪廓 和巧光特征（fluorescentsignature)的變化發(fā)生在檢測范圍內(nèi)的多個溫度下。相差至少 2°C的探針Tm將通過改變谷（或峰）的形狀改變巧光特征。其Tm相差5°C或更大的探針有 利地導(dǎo)致分開解鏈或退火峰。然而，某些實施方案可包括具有相同或幾乎相同的Tm的兩個 探針，我們稱之為"Tm疊加"，在該種情況下，兩個探針將促成單一解鏈或退火峰，例如參見 圖5, 507行。在設(shè)計用于LATE-PCR擴增反應(yīng)的探針組中，我們優(yōu)選針對所有祀序列變體的 最大探針Tm低于用于擴增反應(yīng)的退火溫度，其通常不高于約80°C。
[0014] 本發(fā)明的方法包括多個探針組在相同檢測混合物中的應(yīng)用，即是說，探針組用于 至少兩個祀序列的每一個。探針組可通過Tm區(qū)分。例如，用于第一個祀序列的探針組 可包括具有在55-70°C范圍內(nèi)的Tm的探針，和用于第二個祀序列的探針組可包括具有在 40-54°C范圍的Tm的探針?；蛘?，兩個探針組可具有重疊的Tm。見實施例3,其中16s-基 因祀序列的探針組與促旋酶B-基因祀序列的探針組用于單一檢測混合物中，且各探針組， 當(dāng)單獨使用時，產(chǎn)生接近50°C的（負(fù)）解鏈峰。盡管如此，當(dāng)各探針組一起使用時，已表明 合并的檢測能夠獲得可區(qū)分菌株的信息。
[0015] 原位探針可與另外的僅有巧滅劑的探針或雙重標(biāo)記的探針組合使用。序列特異性 探針在該樣的組中是特別有用的，因為它們選擇性地與特定的SNP雜交，或選擇性地不與 特定的SNP雜交。該樣的探針-祀雜合體的形成顯著地減少所述單鏈的柔性并因此抑制自 報道原位探針的形成。序列特異性探針的Tm(例如60°C)被設(shè)計得高于其祀的3'末端的 初始Tm(如45°C)。在3'末端延伸時，3'末端的最終Tm將增加并可變得等于或高于序列 特異性探針的Tm。
[0016] 本發(fā)明的方法包括在雜交條件下，使包含至少一個單鏈寡核巧酸（為含有至少一 個祀序列的核酸鏈）的拷貝的樣品與dsDNA-染料和用于至少一個祀序列的探針組接觸，W 便使探針組中的探針與一個或多個祀序列雜交。該樣的核酸鏈可W是DNA或RNA。它可含 有單一祀序列，在該種情況下，祀序列可基本上包含整條鏈，或它可含有至少兩個祀序列， 在該種情況下，鏈足夠長W包含所有祀序列。單鏈核酸祀序列的拷貝可由任何方式提供。用 于分析的單鏈核酸祀序列在一些情況下可通過分離和純化樣品中的核酸祀鏈而直接獲得。 例如，含有祀序列的dm正鏈可通過分開正和負(fù)的DNA鏈和分離含有祀序列鏈的（例如正 鏈），通過除去互補鏈（例如負(fù)鏈），從含有雙鏈DNA的樣品獲得。根據(jù)本發(fā)明的方法的一 些實施方案包括核酸擴增。如果擴增是對稱的，一種或多種擴增產(chǎn)物是雙鏈的，至少一條祀 鏈的拷貝可W如上所述通過分開正和負(fù)鏈而獲得。可使用許多已知的擴增方法，包括使用 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)、NASBA、SDA和滾環(huán)擴增的方法。例如對稱的PCR方法可包括用生物素 標(biāo)記一個引物并通過捕獲到含抗生物素蛋白的表面，然后對其洗漆，使含生物素的產(chǎn)物鏈 與其它鏈分開。擴增可用含有祀序列的雙鏈核酸鏈開始，或擴增可用含有祀序列或與祀序 列互補的序列的單鏈開始。擴增可包括反轉(zhuǎn)錄，接著擴增cDNA，其中起始樣品是RNA。W上 方法可W在微流體裝置中執(zhí)行，該可允許，例如，包括洗漆步驟。為使dsDNA-染料用于微流 體裝置中，本發(fā)明的方法包括加入雙鏈載體至染料源中，W克服染料粘附到裝置壁的問題。
[0017] 在某些優(yōu)選的方法中，單鏈祀序列的拷貝由非對稱的核酸擴增提供。用于分析的 單鏈脫氧核糖核巧酸值NA)祀序列（保守的序列或者可變序列），可通過非對稱擴增方法 而獲得，所述方法利用限制量的一個引物，W使它在擴增反應(yīng)期間被用完（限制引物），此 后單鏈擴增產(chǎn)物繼續(xù)利用其它引物（過量的引物）生成。最常用的非對稱擴增方法是PCR 方法，包括不對稱的PCR和LATE-PCR，其中的任何一種可與用RNA序列開始的反轉(zhuǎn)錄結(jié)合。 我們的優(yōu)選的擴增方法是LATE-PCR。非對稱擴增方法生成雙鏈的擴增產(chǎn)物，或"擴增子"， 和含有待分析的祀序列的單鏈擴增產(chǎn)物（擴增子）兩者。
[0018] 在巧光采集期間，樣品中雙鏈的存在對檢測方法的設(shè)計有影響。當(dāng)雙鏈與單鏈存 在于待分析的樣品中時，dsDNA-染料W足W不僅結(jié)合雙鏈，而且也結(jié)合相對短的探針-祀 雜合體的量加入。如果樣品只含有單鏈核酸，探針Tm不受限制。它們可從非常低的溫度 (通常為室溫）變化至非常高的溫度（例如90°C)。然而，如果在巧光采集期間也存在產(chǎn)生 信號的雙鏈，例如，雙鏈擴增產(chǎn)物（或雙鏈"擴增子"），探針Tm保持低于產(chǎn)生信號的雙鏈的 Tm。
[0019] 本發(fā)明的方法包括用在或接近染料的最大吸收處的波長的光刺激含有至少一個 祀的樣品、染料和用于所述至少一個祀的探針組并在包括探針的Tm的溫度范圍內(nèi)檢測在 或接近染料的最大發(fā)射處的發(fā)射?？紤]到含單一祀序列的鏈（其在某些實施方案中為單鏈 擴增子），如果雜交于其互補序列或互補體，最高的Tm將是鏈本身的解鏈溫度。探針組中 的探針（短于整條鏈）會具有較低的Tm，所W探針解鏈的檢測在低于鏈Tm的溫度下進(jìn)行。 檢測的溫度范圍優(yōu)選地包括雙鏈祀（如果存在的話）的Tm。檢測步驟可W解鏈的方式進(jìn) 行，其中溫度下降至范圍的底部，然后隨著時間的過去逐漸增加至范圍的頂部，伴隨發(fā)射的 頻繁采集W生成巧光輪廓，即解鏈曲線。該步驟可W相反的方式進(jìn)行，其中溫度上升至該范 圍的頂部，然后隨著時間的過去逐漸降低至范圍的底部，伴隨發(fā)射的頻繁采集W生成退火 曲線。在一些情況下，可能需要進(jìn)行兩個循環(huán)的解鏈或退火。例如，當(dāng)原位探針與序列特異 性探針一起使用時，解鏈的第一循環(huán)可導(dǎo)致3'末端延伸，從而增加初始Tm至最終Tm。該種 變化反過來可改變序列特異性探針雜交的水平。Tm的該種變化可通過使用探針-祀雜合體 的兩輪退火或解鏈而觀察到。
[0020] 在一些實施方案中，完整的解鏈曲線或退火曲線可通過在僅僅幾個選擇的溫度， 在一些情況下僅在單一選擇的溫度下的巧光采集替代。如果一個或多個探針含有非重疊標(biāo) 記，該方法可包括分別地用適當(dāng)?shù)牟ㄩL的光直接刺激該標(biāo)記，并檢測在或接近標(biāo)記的最大 發(fā)射處的發(fā)射（作為溫度的函數(shù)或作為實時檢測的循環(huán)數(shù)的函數(shù)，或二者）。如果一個或多 個探針含有巧光染料巧滅標(biāo)記，該方法可包括直接地或者間接地（通過激發(fā)染料）刺激該 標(biāo)記并檢測作為溫度的函數(shù)或作為實時檢測的循環(huán)數(shù)的函數(shù)或二者的來自標(biāo)記的發(fā)射。檢 測通常地在相對狹窄的波長范圍進(jìn)行，該范圍例如獲取僅來自dsDNA-染料和染料重合標(biāo) 記的巧光并排除來自其它巧光團(tuán)的巧光。然而，不排除在寬的波長范圍下檢測，該范圍獲取 來自染料、染料重合