通過發(fā)酵由可再生資源生產苯酚的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及在合適的重組宿主中由可再生資源（例如生物質）生產苯酪的領域。
[0002] 前言 苯酪目前主要通過枯締過程即化學過程，W每年幾百萬噸由化石原材料產生。與可再 生的原材料例如可再生資源"生物質"相反，此類化石原材料是不可再生的?；诳稍偕Y 源例如生物質的生產過程將實現與化石資源的獨立，并且具有免除大量C〇2排放的潛力。
[0003] 苯酪是酪醒樹脂、雙酪A己內酷胺及其他化學制品的工業(yè)生產中使用的化學中間 產物。在本發(fā)明的背景下，在此處稱為"生物苯酪"的基于可再生資源的苯酪是強烈需要的， W便降低生產成本且變得不依賴于化石資源。更重要的是，化學公司已經承諾對其自身過 程W及通過在其原材料中增加可再生資源的使用兩者而降低C〇2排放。據此，生物苯酪具 有避免化石資源W及節(jié)省C〇2排放的高潛力。
[0004] 分支酸在細菌中的生產描述于卻tx'nger(丄'.\, --Fr?mscratchvaliie: 抑呂in試ring 把攻Iliaculi化舶1>'|? 說11、Tu曲eI衝此iclk訊 ''I'll腳!ylafa麵^
[0005] 苯酪在細菌中的生產已由Wierckx NJP等人，"E咕iiweri化1;!- wlvcHi-u'也raiiiP誠'iidi'"扣piitUaSCt;>rh叫'證i?山ofpile化)'!livm?1化\釋4:'-,J/fj/ ￡機柄化.!&'化》站j/, 2說氏。:拉2!進行描述。
[0006] 然而，由Wierckx等人使用的生物合成途徑首先通過滲入來自谷氨酸鹽的氨基由 分支酸構建分子酪氨酸，并且隨后將其分解為苯酪，再釋放氨基。該途徑包括更多反應步 驟，并且由于導致谷氨酸鹽脫氨基的更長途徑，在能量上不如根據本發(fā)明的方法有利。使用 酪氨酸作為苯酪生物合成的中間產物也是缺點，因為酪氨酸是芳香族氨基酸途徑中的基因 活性的強抑制劑。所述抑制發(fā)生在基因組水平（基因阻遏）、轉錄組水平和代謝組水平（反 饋抑制）。相比之下，如下所述，根據本發(fā)明的方法將分支酸直接轉化為苯酪，其復雜性較 低，能量上更有效的且具有獲得苯酪的高生產率的更高潛力。
[0007] 除經過酪氨酸在細菌中生產苯酪的上述途徑之外，還已知苯酪可W通過莽草酸 的化學轉化進行生產，其中所述莽草酸通過發(fā)酵產生（GibsonJM等人，Benzene-Free SynthesisofPhenol,心洗ff.2001 113(10): 1999-2002)。
[0008] 還報道了經過酪氨酸的4-哲基苯甲酸的生物合成。Meinen等人使用經過酪氨酸 的生物合成途徑（Mei化enJP等人，！1叩rovedp-hydr"巧'bercjuaiciirutkicti加 byciiginecrcilPseiiikmumaspuikbSObyusingaIccdiitgsimicgy,AppI 寶如(HmdMlI, 90lV!:MK駕與3-)。
[0009]W02012063862描述了通過發(fā)酵生產苯酪的方法。通過將分支酸-丙酬酸裂解酶和 4-哲基苯甲酸脫駿酶的基因引入谷氨酸椿桿菌菌株中， 使用經過分支酸和4-哲基苯甲酸的途徑。然而，苯酪對于谷氨酸椿桿菌是有毒的，并且該 菌株在低苯酪濃度下停止生長。生長期和生產期因此被分離在兩步過程中，其中第二步在 與第一步不同的培養(yǎng)基中執(zhí)行，并且氧化還原電位降低至-450mV。根據W02012063862中 報道的發(fā)明，僅使用一個發(fā)酵容器的組合生長和生產是不可能的。出于相同原因，不能伴隨 原位產物取出運行連續(xù)發(fā)酵，其中生物質通過生長使其自身再生。
[0010] 定義 在本發(fā)明的含義內的術語"宿主"可W包含能夠天然地、僅在轉化后，或除天然存在的 分支酸之外在轉化后生產分支酸的任何宿主。根據本發(fā)明的"宿主"可W選自細菌、酵母和 真菌。
[0011] 在本發(fā)明的含義內的術語"遺傳修飾"可W包含缺失W及轉化。例如，遺傳修飾可 W是引起宿主過度生產分支酸的缺失或轉化。此類分支酸在宿主中的過度生產可W通過將 一種或多種遺傳修飾引入宿主來實現。相應地，宿主可W包含一種或多種遺傳修飾W過度 生產分支酸。該些遺傳修飾可W具有下述效應，即宿主W升高的、超過天然地在宿主中存在 的正常內源生理水平的水平生產分支酸。
[0012] 在本發(fā)明的含義內的術語"轉化"包含質粒轉化W及染色體轉化。在質粒轉化中， 所轉化的DNA是未切割和環(huán)狀的，并且因此在宿主中保持在染色體外。在染色體轉化中， 所轉化的DNA是切割的和因此是線性的，并且因此可W整合到待轉化宿主的染色體基因組 中?；旧希瑢τ谌旧w轉化，宿主可W用線性DNA的短鏈片段進行轉化，所述線性DNA的 短鏈片段可W整合到待轉化宿主的染色體基因組中。
[0013] 在本發(fā)明的含義內的術語"原位產物回收"指在發(fā)酵液繼續(xù)用于發(fā)酵的同時，通過 使用合適技術直接從發(fā)酵液中取出苯酪。該可W包括在發(fā)酵液部分再循環(huán)回發(fā)酵罐之前， 使發(fā)酵液循環(huán)通過外部儀器，在所述外部儀器中將苯酪從發(fā)酵液中取出。在該種情況下，細 胞可W保留或不保留在發(fā)酵罐中。另一個選擇是在發(fā)酵液保留在發(fā)酵罐中的同時，從發(fā)酵 液中取出苯酪。
[0014] 描述 本發(fā)明設及用于從作為原材料的生物質，全細胞生物合成苯酪的方法。通常，含有顯著 比例的可發(fā)酵糖的資源可W用于根據本發(fā)明的方法中。該些糖可W包括多糖例如二糖，例 如庶糖，或=糖例如庶果=糖，W及C-6單糖例如葡萄糖、果糖或甘露糖，W及C-5單糖例如 木糖和阿拉伯糖。能夠將糖轉化為苯酪的微生物菌株，優(yōu)選細菌菌株或酵母菌株，將允許由 廣泛范圍的可再生資源生產苯酪，所述可再生資源包括甜菜和甘庶，含淀粉植物例如玉米、 小麥和黑麥，W及木質纖維素例如稻草、木材或甘庶渣。
[0015] 考慮到本領域已知的上述方法通常在能量方面效率較低并且就苯酪合成而言也 更復雜的主要缺點，本領域存在用于生產苯酪的改良方法的需要。因此本發(fā)明的問題是提 供用于由可再生資源生產苯酪的方法，其避免本領域已知的方法在能量方面效率較低并且 就苯酪合成而言更復雜的缺點。
[0016] 本發(fā)明已通過提供生成如本文所述用于生產苯酪的重組宿主菌株的方法來解決 所述問題。本發(fā)明已通過提供如本文所述能夠生產苯酪的重組宿主菌株來進一步解決所述 問題。本發(fā)明已通過提供在重組宿主菌株中生產苯酪的方法來進一步解決所述問題。本發(fā) 明已通過提供方法和相關重組菌株來進一步解決所述問題，所述重組菌株包含氧耐受性哲 基苯甲酸脫駿酶，其對氧不敏感且在正常氧化還原條件下是完全活性的，因此允許在好氧 條件下的苯酪生產。本發(fā)明已通過提供對苯酪抗性的宿主菌株來進一步解決所述問題，因 此允許將生長和苯酪生產在足夠高的苯酪濃度下組合，其足W允許通過連續(xù)發(fā)酵進行生產 W及原位產物回收的選擇。
[0017] 特別地，本發(fā)明已通過提供生成用于生產苯酪的重組宿主菌株的方法來解決所述 問題，所述方法包括下述步驟： a) 提供包含分支酸（CH0)的宿主， b) 用包含編碼分支酸裂解酶的U如'C(SEQIDNO: 1)的第一核酸序列轉化所述宿 主，和 C)用編碼氧耐受性4-哲基苯甲酸脫駿酶的第二核酸序列轉化所述第一轉化體，從 而生成能夠在好氧條件下生產苯酪的重組宿主， 其中步驟b)和步驟C)同時或順次進行。
[0018] 該方法的步驟a)可W利用宿主中存在的分支酸（CH0)。分支酸是所實現途徑中的 關鍵中間產物（參見圖巧日圖2)。它是所有=種芳香族氨基酸的共享前體，并且因此天然 存在于能夠產生芳香族氨基酸的所有生物中，所述生物包括所有常見微生物。因此，可W由 所有可發(fā)酵糖產生細胞內分支酸。
[0019] 該方法的步驟b)提供了具有第一核酸序列（優(yōu)選為基因）的宿主，所述第一核酸 序列的產物將分支酸（CH0)轉化為4-哲基苯甲酸（4-皿）。U如'C(SEQIDNO: 1)編碼分 支酸裂解酶，其將分支酸轉化為4-哲基苯甲酸（4-皿)，從而生成過表達分支酸裂解酶的重 組宿主（參見圖2和圖3)。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述第一核酸序列是 沈QIDNO: 1。
[0020] 通過將編碼氧耐受性4-哲基苯甲酸脫駿酶的核酸引入宿主內，根據本發(fā)明的方 法的步驟C)向宿主另外提供了第二核酸序列，優(yōu)選基因簇，所述第二核酸序列的產物將 4-哲基苯甲酸（4-皿）轉化為苯酪（參見例如圖2和圖3)。步驟b)中的所述核酸可W包 括表達4-哲基苯甲酸脫駿酶的基因簇A如巧餓（SEQIDNO2)。步驟C)的基因簇A如/公餓 可W衍生自大腸桿菌化co7i)菌株大腸桿菌0111:B4。
[0021] 因此，在根據本發(fā)明的方法的進一步實施方案中，所述第二核酸序列包含基因簇 A如/公C漢如SEQIDNO2中定義的。由SEQIDNO: 2編碼的酶是氧耐受性的4-哲基苯甲 酸脫駿酶。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述第二核酸序列是SEQIDNO: 2。
[0022] 因此，本發(fā)明已通過提供生成用于生產苯酪的重組宿主菌株的方法來解決上述問 題，所述方法包括下述步驟： a) 提供包含分支酸（CH0)的宿主， b) 用包含編碼分支酸裂解酶的U如'C(SEQIDNO: 1)的第一核酸序列轉化所述宿主， 所述分支酸裂解酶將分支酸（CH0)轉化為4-哲基苯甲酸（4-皿)，和 C)用編碼氧耐受性4-哲基苯甲酸脫駿酶的第二核酸序列轉化所述第一轉化體，所述 4-哲基苯甲酸脫駿酶將4-哲基苯甲酸（4-皿）轉化為苯酪，從而生成能夠在好氧條件下生 產苯酪的重組宿主， 其中步驟b)和步驟C)同時或順次進行。
[0023] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述第一核酸序列是SEQIDNO: 1。
[0024] 在根據本發(fā)明的方法的進一步實施方案中，所述第二核酸序列包含基因簇 A如/公C漢如SEQIDNO2中定義的。由SEQIDNO: 2編碼的酶是氧耐受性的4-哲基苯甲 酸脫駿酶。目P，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述第二核酸序列是SEQIDNO: 2。
[0025] 因此，根據本發(fā)明在重組宿主中生產苯酪的最低限度需求是宿主中的分支酸W及 包含U如'C(SEQIDNO: 1)的第一核酸序列，和第二核酸序列的存在，所述第二核酸序列編 碼氧耐受性4-哲基苯甲酸脫駿酶，其優(yōu)選是A如恐C漢如SEQIDNO: 2中定義的。宿主中存 在的分支酸可W是由宿主天然產生的內源分支酸，或者，如果所述宿主包含一種或多種遺 傳修飾W過度生產分支酸，它可W是由宿主過度生產的分支酸。
[0026] 在步驟b)和C)中轉化到宿主內的第一和第二核酸序列可W在相同質粒，不同質 ?；蛉旧w上（染色體整合，例如實施例5)。如果轉化到宿主內的第一和第二核酸序列在 相同質粒上，則該方法的步驟b)和C)可W同時進行（例如參見實施例1)。如果轉化到宿 主內的第一和第二核酸序列在不同質粒上，則該方法的步驟b)和C)可W順次進行。例如， 基因U如r(SEQIDNO: 1)可W在第一質粒上轉化到宿主內，并且基因簇AM公餓（SEQID NO: 2)可W在第二質粒上轉化到宿主內（參見例如實施例3)。在一個實施方案中，用存在 于相同質粒上的U如'巧日A如巧C巧?；拗骶辏ɡ鐓⒁妼嵤├齦，pJF119U如'。如0餓)。在 另一個實施方案中，用在第一質粒PJF119上的U如'C(SEQIDNO: 1)和在第二質粒pACYC 上的A如巧餓（SEQIDNO:。轉化宿主菌株（例如參見實施例扣。
[0027] 本發(fā)明的方法超過上文描述的現有技術方法的技術優(yōu)點在于在大規(guī)模生產設施 中的苯酪生產的經濟可行性得到改善。本發(fā)明允許使用在好氧條件下的連續(xù)發(fā)酵伴隨原位 產物去除，在單個容器中糖至苯酪的一步轉化。該顯著改善糖產率和時空產率。與補料分 批發(fā)酵相比較，連續(xù)發(fā)酵具有好得多的總體糖產率，因為需要更少的糖W生成生物質，在補 料分批發(fā)酵的情況下，需要對于每一個新批次生成生物質?？傮w時空產率是改善的，因為在 生產期之間沒有如補料分批發(fā)酵的情況下的時間損失（例如用于收獲產物、清潔且滅菌發(fā) 酵罐、生成生物質）。此外，一步轉化允許僅使用一個發(fā)酵容器的生產。該降低過程的復雜 性和生產設施的資本支出。
[002引與由Wierckx等人報道的經過酪氨酸的合成途徑相比較，所實現的合成途徑復雜 性較低，更能量有效的且避免酪氨酸的大細胞內濃度，該將抑制對苯酪的生物合成途徑。因 此，根據本發(fā)明的方法有效得多，因為與本領域已知的方法相比較，它能夠實現更佳的糖產 率（由于能量效率）和更佳的時空產率（由于更短的途徑和避免酪氨酸作為中間產物）。
[0029] 在根據本發(fā)明的方法的進一步實施方案中，步驟a)的宿主可W過度生產分支酸 (010)。此類分支酸在宿主中的過度生