一種融合抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種融合抗菌膚，具體設(shè)及的是天蠶素抗菌膚B和整素抗菌膚TPI融 合；其制備方法采用食藥用菌菌絲體生物反應(yīng)器生產(chǎn)融合抗菌膚CB-TPI，尤其設(shè)及金針 茹、平茹、靈芝和蛹蟲草為制備真菌，屬于基因工程和生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌膚（AntimicrobialP巧tides)是生物體產(chǎn)生的一種具有強抗菌作用的陽離 子多膚，是生物先天免疫系統(tǒng)的重要組成，它具有廣譜性、高效性、穩(wěn)定性等特點，其本身不 易產(chǎn)生耐藥性。它不僅具有殺菌作用，還能抑殺真菌、寄生蟲、病毒W(wǎng)及腫瘤細胞，且對正常 細胞毒性較小，因此，抗菌膚極有可能成為一種新的抗生素替代品。
[0003] 天蠶素抗菌膚（cecropins)早在1980年就被發(fā)現(xiàn)，它是從蠶蛹中分離得到的第一 個抗菌膚。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過1700種抗菌膚，而天蠶素是研究最為清楚、效果最為明顯的 抗菌膚，是最具潛力的抗生素替代品之一。天蠶素利用N端所帶的正電荷與原核細胞的細 胞膜磯脂雙分子層密集的負電荷靜電相吸，C端柔性的插入疏水區(qū)，在兩親性a-螺旋的作 用下，在原核細胞膜上形成4皿的離子通道，離子通道的形成改變了細胞膜內(nèi)外的滲透壓， 細胞膜內(nèi)物質(zhì)大量外滲，致細菌細胞死亡，起到殺菌作用。有些天蠶素通過干擾信號傳導(dǎo)通 路而間接發(fā)生，影響病毒基因轉(zhuǎn)錄。天蠶素對大腸桿菌、沙口氏菌、金黃色葡萄球菌等主要 致病菌有很強的殺滅作用。
[0004] 整素是海洋節(jié)肢動物一整體內(nèi)產(chǎn)生的一類抗菌蛋白，抗菌譜廣，且具有很高的抑 菌活性，在較低濃度下即可抑制革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的生長，但TachyplesinI 對宿主的細胞無傷害作用?，F(xiàn)已知道，整素抗菌作用機制是通過形成通道，選擇性破壞細胞 膜來殺滅細菌的，因而不易產(chǎn)生耐藥性。實驗研究發(fā)現(xiàn)，它對多種飼料有害微生物包括致病 性和相對致病性飼料細菌、飼料霉菌等均有高效的殺菌作用，有望成為一種新型高效、環(huán)保 的綠色添加劑應(yīng)用于飼料的保鮮防腐。
[0005] 生物反應(yīng)器是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)或代謝調(diào)控技術(shù)在生物個體生產(chǎn)高附加值蛋白質(zhì) 和代謝產(chǎn)物，或者改造植物某種功能成分使之更適于人類利用的一種生物制藥和蛋白生產(chǎn) 技術(shù)。其中，被稱為"天然生物反應(yīng)器"的植物表達體系正在引起工業(yè)和醫(yī)學(xué)界越來越多的 關(guān)注，目前已成為生產(chǎn)高附加值的口服疫苗、醫(yī)用蛋白、單克隆抗體的重要途徑，是國外生 物產(chǎn)業(yè)的研發(fā)熱點之一。但目前動植物生物反應(yīng)器仍然存在轉(zhuǎn)基因困難、生長周期長、分離 純化困難、成本高及因擔(dān)屯、基因漂移而造成的環(huán)境釋放困難等問題。食藥用真菌生物反應(yīng) 器作為動植物生物反應(yīng)器的完美補充，具有基因轉(zhuǎn)化容易、生長周期短、無需在室外環(huán)境中 釋放等優(yōu)點，是具有重要開發(fā)價值的生物反應(yīng)器受體系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為提高抗菌膚的抗菌能力而提供一種融合抗菌膚。
[0007] -種融合抗菌膚基因，它的堿基序列如序列表SEQIDNO. 4所示。
[0008] -種融合抗菌膚，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO. 5所示。
[0009] 一種表達載體PCB130NG-C公-W/，它是； 1) 用Hindlll和EcoRI雙酶切PCAMBIA1300載體，去除MCS區(qū)，經(jīng)DNA聚合酶Klenow 酶補平后，用T4連接酶連接形成中間載體PCB130-1; 2) 在PCB130-1的SphI位點處引入SEQIDNO. 1所示的基因，包含左右邊界序列和多 克隆位點，構(gòu)建成中間載體PCB130-2; 3) PCB130-2分別在PstI酶切位點處引入真菌特異性啟動子GPD，在SacI與EcoRI酶 切位點之間引入Nos終止子，構(gòu)建成真菌特異性雙T-DNA表達載體，命名為PCB130NG; 4) 經(jīng)甜al和SacI，在PCB130NG中插入SEQIDNO. 4所示的基因。
[0010] 一種食藥用真菌菌絲，它是將一種表達載體PCB130NG-CB-TPI，轉(zhuǎn)染至食藥用原 生質(zhì)中，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，離屯、收集菌絲，烘干或凍干粉碎。
[0011] 一種融合抗菌膚的生產(chǎn)方法，提取所述的一種食藥用真菌菌絲總蛋白，將蛋白上 清液直接加載化s-tag親和柱中，用50mM/L咪挫洗脫雜蛋白至1-2倍柱體積，再用lOOmM/ L咪挫洗脫表達的融合蛋白，收集并濃縮融合抗菌膚CB-TPI，在23°C條件下解育12小時進 行腸激酶的酶切反應(yīng)，利用截留分子量為lOKdW上的透析袋進行蛋白透析，將得到的透析 液中的抗菌膚進行濃縮，得到純化后的融合抗菌膚CB-TPI純品。
[0012] 一種食藥用真菌菌絲在生產(chǎn)動物飼料抗菌及蛋白質(zhì)添加劑中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明提供了一種融合抗菌膚及其制備方法和應(yīng)用，是將天蠶素抗菌膚B (cecropinB,CB)和整素抗菌膚tachyplesinI(TPI)串聯(lián)構(gòu)建了一種融合抗菌膚CB-TP I，通過優(yōu)化天蠶素抗菌膚a疆因與整素抗菌膚W7基因，主要是適宜真菌表達的密碼子 偏愛性，設(shè)計合成了所述融合抗菌膚的DNA序列，并將其構(gòu)建到真菌特異性雙T-DNA安全表 達載體中；利用陽G轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化食藥用菌原生質(zhì)體，該里設(shè)及的真菌主要是金針茹、平茹、 蛹蟲草和靈芝，再生后，獲得轉(zhuǎn)基因的食藥用真菌子實體；利用PCR篩選出只含目的基因而 不含選擇標記基因的子實體個體，培養(yǎng)至T2代，獲得穩(wěn)定表達融合抗菌膚7基因的 轉(zhuǎn)基因食藥用真菌。提取的融合抗菌膚抗菌能力有顯著提高，用量少，不存在耐藥性問題， 通過轉(zhuǎn)基因食藥用真菌菌絲的發(fā)酵培養(yǎng)，制備產(chǎn)融合抗菌膚的轉(zhuǎn)基因菌絲。利用本發(fā)明生 產(chǎn)的融合抗菌膚菌絲經(jīng)過低溫烘干，可直接制備成飼料添加劑，省略了蛋白質(zhì)分離純化過 程，各批次間質(zhì)量差異小、產(chǎn)量大、成本低。本開發(fā)產(chǎn)品的應(yīng)用，可W增加畜禽的抵抗力，減 少抗生素的使用，具有廣泛的社會效益和經(jīng)濟效益。
【附圖說明】
[0014] 圖1真菌特異性雙T-DNA安全表達載體PCB130NG示意圖； 圖2PUC57-CB-TPI載體和PCB130NG載體酶切結(jié)果； 圖3 PCB130NG-CB-TPI菌液PCR鑒定結(jié)果； 圖4轉(zhuǎn)基因蛹蟲草菌絲的PCR檢測； 圖5轉(zhuǎn)基因蛹蟲草的PCR檢測。
【具體實施方式】
[0015] 實施例1.真菌特異性雙T-DNA安全表達載體的構(gòu)建 利用PCAMBIA1300載體作為基礎(chǔ)載體，首先通過值?/?淚II和公CO況雙酶切，去除MCS區(qū)， 經(jīng)DNA聚合酶K1enow酶補平后，用T4連接酶連接形成中間載體pCB130-1。接下來，通過基 因合成技術(shù)在中間載體的成姑位點處引入一段序列（SEQIDNO. 1)，包含左右邊界序列和 多克隆位點，構(gòu)建成中間載體PCB130-2。在此載體基礎(chǔ)上，通過PCR技術(shù)及酶切與連接方 法，分別在A幻酶切位點處引入真菌特異性啟動子仿W(SEQIDNO. 2)，在&過與公CO況 酶切位點之間引入Afos終止子（SEQIDNO. 3)，構(gòu)建成真菌特異性雙T-DNA表達載體，命名 為PCB130NG，該載體示意圖見圖1。
[0016] 實施例2.融合抗菌膚CB-TPI的設(shè)計 為了提高抗菌膚的抑菌活性，將天蠶素抗菌膚B(cecropinB，CB)和整素抗菌膚tachyplesinI(TPI)串聯(lián)一起進行構(gòu)建，并且將整素抗菌膚的C末端進行酷胺化處理； 同時，為使兩個抗菌膚表達后在空間上隔開，在兩基因之間添加甘氨酸-脯氨酸Linker;為 便于表達后的檢測，在TPI基因的3'末端加上His標簽。得到的融合抗菌膚CB-TPI的 氨基酸序列為C序列。
[0017] 實施例3.融合抗菌膚CB-TPI真菌表達載體的構(gòu)建 根據(jù)真菌對密碼子的偏愛性，對融合抗菌膚的核巧酸序列進行密碼子優(yōu)化，利用人工 合成方法將該序列（SEQIDNO. 3)插入到載體PUC57上，并在序列兩端添加酶切位點思 和&過。
[0018] 將pU巧7-CB-TPI載體和本研究組改造后的真菌特異性表達雙T-DNA安全表達載 體PCB130NG(圖1)，分別用甜al和SacI酶切（圖2)，回收酶切產(chǎn)物后，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定 (圖3)，獲得融合抗菌膚CB-TPI真菌表達載體PCB130NG-CB-TPI。
[0019] 實施例4.轉(zhuǎn)CB-TPI基因蛹蟲草子實體