一種芝麻抗菌肽制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于天然植物成分提取技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種芝麻抗菌肽制備方法，特別是 一種以芝麻柏為原料經(jīng)過科學(xué)工藝提取抗菌肽的技術(shù)方案。
【背景技術(shù)】：
[0002] 抗菌肽的別名為宿主防御肽，是由基因編碼的，存在于所有生物有機(jī)體中的一類 先天免疫分子，是廣泛存在于細(xì)菌、植物、軟體動物、兩棲動物、魚類、鳥類和哺乳動物體內(nèi) 的一類小分子多肽，由20~60個氨基酸殘基組成，具有廣譜殺菌作用。與傳統(tǒng)抗生素相 比，抗菌肽具有明顯的優(yōu)點：一是不僅能殺滅細(xì)菌、真菌和病毒，而且對癌細(xì)胞也有一定的 殺傷力；二是有很多的作用靶點，更有利于發(fā)揮效應(yīng)；三是半衰期很短，且耐藥性很強(qiáng)；四 是可獨立發(fā)揮作用，也可與其他因子一起協(xié)同作用。因此，抗菌肽作為一類抗菌能力強(qiáng)、抗 菌譜廣、種類多、可供選擇的范圍廣的活性肽，在食品添加劑、生物飼料添加劑、醫(yī)藥等領(lǐng)域 都有極其廣闊的發(fā)展前景。
[0003]目前抗菌肽的生產(chǎn)制備方法和途徑主要有三種：一是提取分離自然界生物體中 本身所固有的各種天然抗菌肽類；二是通過水解蛋白質(zhì)獲得具有抗菌功能的活性肽，主要 有酸水解法、堿水解法和酶水解法以及微生物發(fā)酵法；三是合成法制備生物活性肽，包括化 學(xué)合成法、酶合成法和重組DNA技術(shù)合成法。由于抗菌肽在生物體內(nèi)含量極微，從生物體內(nèi) 提取抗菌肽產(chǎn)量低、費時長、工藝復(fù)雜、費用昂貴，無法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；化學(xué)合成法是將帶 有氨基保護(hù)基的氨基酸的羧基端固定在水不溶性載體上，脫去該氨基酸上的氨基保護(hù)基， 同下一個氨基酸的活化羧基縮合形成酰胺鍵，從而延長肽鏈形成多肽，但這類方法耗時大、 副反應(yīng)多且合成試劑毒性大，制約了產(chǎn)品的進(jìn)一步應(yīng)用；隨著近幾年生物技術(shù)的發(fā)展，重組 DNA技術(shù)合成法取得了一定的成就，但通過基因工程的方法獲得抗菌肽目前處于瓶頸狀態(tài)， 而人工合成抗菌肽成本高，且效果不及天然的抗菌肽，在臨床上的應(yīng)用受到限制；酸堿法水 解蛋白存在產(chǎn)生有毒物質(zhì)、化學(xué)污染等缺點。在現(xiàn)有技術(shù)的提取方法中，酶水解法和微生物 發(fā)酵法由于水解溫和且沒有有機(jī)溶劑及有毒的化學(xué)品的殘留已成為制備抗菌肽的最有應(yīng) 用前景的方法，這兩種方法的原理均是采用蛋白酶將蛋白水解小分子的肽，酶水解法是在 蛋白中直接加入商業(yè)用酶進(jìn)行水解，微生物發(fā)酵法是利用微生物發(fā)酵生成的酶進(jìn)行蛋白質(zhì) 的水解；雖然較酶水解法而言，發(fā)酵法可利用微生物發(fā)酵直接生產(chǎn)抗菌肽，減少了蛋白酶的 純化和制備過程，具有生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低的優(yōu)勢，但由于安全性問題，被FDA批準(zhǔn)可 用于食品開發(fā)的蛋白酶生產(chǎn)菌種是有限的，主要有米曲霉、黑曲霉、枯草芽孢桿菌等，在一 定程度上限制了它的快速發(fā)展和應(yīng)用；因此，酶水解法是目前制備抗菌肽最受推崇的方法。
[0004] 芝麻（SesamumindicmL.)屬胡麻科胡麻屬，是一種重要的油料種子作物，芝麻 主要生長在熱帶地區(qū)，以及在北煒40°N和40°S之間的溫帶地區(qū)。在亞洲和非洲已種 植了幾個世紀(jì)。據(jù)統(tǒng)計，全世界芝麻產(chǎn)量是400萬噸，其中亞洲占250萬噸，非洲占13萬 噸，分別占全球總產(chǎn)量的60%和33%。芝麻在我國也被廣泛種植，是我國四大油料作物之 一，除直接食用外，芝麻大部分都用來榨油，榨油后副產(chǎn)物芝麻渣或餅柏中的蛋白質(zhì)含量 為38 %~50 %，是生物活性肽的良好來源；而芝麻餅柏主要當(dāng)做飼料和肥料使用，我國每 年約有50萬噸的芝麻柏沒有得到很好的利用，極大浪費了這一蛋白資源。因此，國內(nèi)外多 位學(xué)者對酶法制備芝麻活性肽進(jìn)行了研究，如董英、KAKALI等用堿性蛋白酶或木瓜蛋白酶 水解芝麻柏蛋白得到的芝麻肽具有抗氧化活性，日本科學(xué)家從芝麻蛋白的酶解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn) 了降血壓肽，并制成"芝麻多肽KM- 20"產(chǎn)品正式上市銷售，而關(guān)于芝麻抗菌肽的研究，國 內(nèi)外未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點，尋求設(shè)計一種芝麻抗菌肽制備方 法，以芝麻餅柏蛋白為原料，選取雙酶復(fù)合分步酶解技術(shù)水解芝麻餅柏蛋白，再經(jīng)膜分離 技術(shù)純化制備芝麻抗菌肽，為芝麻餅柏的深加工開辟新途徑，填補(bǔ)芝麻抑菌肽制備技術(shù)空 白，不但使芝麻這一植物資源得到充分的綜合利用，而且為人類提供更好的功能性食品和 藥品，創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本方法的具體工藝步驟包 括：
[0006] (1)脫余脂：將榨取油脂后的干品芝麻柏以固液比為1:3的重量比例加入乙酸乙 酯，在控溫30~40°C條件下加熱攪拌30~40mim后過濾，再在濾渣中以固液比1 :2的重量 比例加入重量百分比濃度為95%食用乙醇并在30~40°C控溫條件下，繼續(xù)加熱攪拌30~ 40mim后過濾，收集濾渣即為脫余脂的芝麻柏，晾干或30~40°C下烘干備用；
[0007] (2)提取芝麻蛋白：將步驟（1)的濾渣干品中以固液比1 :5的重量比例加入 10 5mol/L氫氧化鈉溶液，在30~40°C下加熱攪拌50~60mim進(jìn)行提取后過濾，將濾渣 重復(fù)上述步驟再進(jìn)行提取兩次，將三次提取液合并；用重量百分比濃度為〇. 01 %的鹽酸 水溶液將提取液的PH調(diào)整到4. 5,靜置10小時后過濾，收集固體物并控溫為40°C，壓力 為-0. 07~-0. 09Mpa真空度條件下干燥為固體，S卩為芝麻蛋白固體；
[0008] (3)分步復(fù)合酶解：將步驟（2)中的芝麻蛋白固體配成50g/L的水溶液，再加入 13000~14000U/g蛋白的中性蛋白酶，在溫度為60~70°C條件下酶解2h;隨后用重量百 分比濃度為0. 01 %的鹽酸水溶液調(diào)整溶液的pH為4,再加入6000~7000U/g蛋白的胃蛋 白酶，在55~60°C下酶解2h，然后將溶液的溫度升高到85~95°C保持5min得到酶解液， 離心取上清液；；
[0009] (4)膜分離：將步驟（3)的酶解上清液采用截留相對分子量1000 Da的聚醚砜分離 膜進(jìn)行過濾分離，溫度控制在30~40°C，壓力控制為0. 30~0. 35MPa，流速為150~300ml/ min，膜面積為50cm2,收集截留液；再將截留液采用截留相對分子量為2000Da的聚醚砜分 離膜進(jìn)行膜分離，控制壓力為〇. 20~0. 25MPa，流速控制在200~400ml/min，控制溫度在 30~40 °C，收集透過液；
[0010] (5)噴霧干燥：將步驟（4)中膜分離的透過液，設(shè)定進(jìn)口溫度為130~150°C，出風(fēng) 溫度為80~90°C，空壓機(jī)壓力為0. 2~0. 3Mpa，在常規(guī)設(shè)計中進(jìn)行噴霧干燥，得到芝麻抗 菌肽。
[0011] 本發(fā)明制備的芝麻抗菌肽產(chǎn)品的抗菌肽含量大于98% ;應(yīng)用于食品和動物飼料的 產(chǎn)品加工之添加原料；在肉制品加工過程中添加總重量為0. 1~0. 5%的劑量的抗菌肽， 不僅能夠控制細(xì)菌的生長，保持良好的風(fēng)味和色澤，還能夠降低其中亞硝酸鹽的含量，減 少產(chǎn)生危害人們健康的亞硝胺。
[0012] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其工藝路線設(shè)計合理，工藝條件簡單易控，制備操作安全 可靠，產(chǎn)品出率高，質(zhì)量好，應(yīng)用范圍廣，使用環(huán)境友好。
【附圖說明】：
[0013] 圖1為本發(fā)明的具體實施工藝流程示意框圖。
[0014] 圖2為本發(fā)明產(chǎn)品抑制金黃色葡萄球菌實驗結(jié)果示意圖，其中，1為pH7緩沖溶 液；2為5g/L芝麻蛋白對照溶液；3為復(fù)合酶對照溶液；4、5為10g/L芝麻肽測試溶液；6、7 為25g/L芝麻肽測試溶液。
【具體實施方式】：
[0015] 下面通過實施例并結(jié)合附圖作進(jìn)一步說明。
[0016] 實施例1 :芝麻抑菌肽制備
[0017] (1)脫余脂：將榨取油脂后的干品芝麻柏1000 g加入3000g乙酸乙酯，在控溫30~ 40°C條件下加熱攪拌30~40mim后過濾，再在濾渣中加入重量百分比濃度為95%食用乙 醇2000g，并在30~40°C控溫條件下，繼續(xù)加熱攪拌30~40mim后過濾，收集濾渣即為脫 余脂的芝麻柏，晾干或30~40 °C下烘干備用，稱取其重量為978. 5g;
[0018] (2)提取芝麻蛋白：將步驟⑴的濾渣干品中以固液比I:5的重量比例加入 10 5mol/L氫氧化鈉溶液，在30~40°C下加熱攪拌50~60mim進(jìn)行提取后過濾，將濾 渣重復(fù)上述步驟再進(jìn)行提取兩次，將三次提取液合并；用重量百分比濃度為0. 01 %的鹽 酸溶液將提取液的PH調(diào)整到4. 5,靜置10小時后過濾，收集固體物并控溫為40°C，壓力 為-0. 07~-0. 09Mpa真空度條件下干燥為固體，S卩為芝麻蛋白固體，稱重為359. 0g，測定其 蛋白含量為85. 18% ;
[0019] (3)分步復(fù)合酶解：將步驟（2)中的芝麻蛋白固體配成50g/L的水溶液共7. 18L， 按照13500U/g蛋白的比例加入中性蛋白酶（酶活為4.9X104U/g)99g，在溫度為60~ 70°C條件下酶解2h;隨后用重量百分比濃度為0. 01 %的鹽酸溶液調(diào)整溶液的pH為4,按照 6500U/g蛋白的比例再加入胃蛋白酶（酶活為I. 3X104U/g) 179. 5g，在55~60°C下酶解 2h，然后將溶液的溫度升高到85~95°C保持5min得到酶解液，離心取上清液；
[0020] (4)膜分離：將步驟（3)的酶解上清液采用截留相對分子量1000 Da的聚醚砜分離 膜進(jìn)行過濾分離，溫度控制在30~40°C，壓力控制為0. 30~0. 35MPa，流速為150~300ml/ min，膜面積為50cm2,收集截留液；再將截留液采用截留相對分子量為2000Da的聚醚砜分 離膜進(jìn)行膜分離，控制壓力為〇. 20~0. 25MPa，流速控制在200~400ml/min，控制溫度在 30~40 °C，收集透過液；
[0021] (5)噴霧干燥：將步驟（4)中膜分離的透過液