一種砷-IgG螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢測領(lǐng)域，更具體地說，設(shè)及一種神-IgG馨合物及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] IgG主要由脾、淋己結(jié)中的漿細胞合成和分泌，W單體形式存在。在個體發(fā)育過程 中機體合成IgG的年齡要晚于IgM，在出生后第3個月開始合成，3~5歲接近成年人水平。 IgG是血清中主要的抗體成分，約占血清總Ig的75 %。IgG是唯一能通過胎盤的Ig，在自 然被動免疫中起重要作用。此外IgG還具有調(diào)理吞瞻、ADCC和結(jié)合SPA等作用。由于IgG 上述特點，IgG在機體免疫防護中起著主要的作用，大多數(shù)抗菌、抗病毒、抗毒素抗體都屬于 IgG類抗體。應(yīng)用對麻疹、甲型肝炎等有免疫力的產(chǎn)婦或正常人丙種或胎盤球蛋白可進行人 工被動免疫，能有郊地預(yù)防相應(yīng)的傳染性疾病。
[0003] 神是常見的環(huán)境毒物之一，廣泛存在于水、±壤、空氣W及食物之中。由于其毒性 W及普遍存在性，美國毒物和疾病登記署（UAstedStatesAgencyforToxicSubstances andDiseaseRegistry,ATSDR) -直將其列為頭等有害物質(zhì)化ttp;//www.ats化.cdc.gov/ SPL/index.html)，同時神也被許多國際組織（包括國際癌癥研究機構(gòu)（International AgencyforResearchonCancer,IARC)W及美國環(huán)境保護署化S.Elnvironmental ProtectionAgency,EPA))劃定為人類致癌物質(zhì)之一。神能對人體產(chǎn)生急性或慢性毒性，急 性神中毒會導(dǎo)致嘔吐、口干、肌肉疫李、腹痛、手腳刺痛等劇烈癥狀，而慢性神中毒對人類健 康的影響也已成為人們關(guān)注的一個重大問題。通過飲用水和空氣是兩種與環(huán)境中神接觸最 直接的方式，它會誘發(fā)屯、血管疾病、引起神經(jīng)功能失調(diào)、并導(dǎo)致糖尿病W及肺癌、皮肺癌、膀 脫癌等。而目前流行病學(xué)顯示，在自然界存在的神引起的地下飲用水污染，已在臺灣、阿根 廷、智利、孟加拉邦、印度、孟加拉國、內(nèi)蒙古、中國等多個國家和地區(qū)造成高劑量的神暴露， 成為環(huán)境污染和危害健康的全球性問題。目前全球已有超過五千萬人處于神暴露和慢性神 中毒的威脅之中。
[0004] 目前可W運用多種方法檢測出血神含量，包括化ISA、原子吸收光譜（Atomic Abso;rptionSpectroscopy,AA巧定量檢測法、電感禪合等離子體質(zhì)譜儀（inductively coupledplasmamassspectrometiT，ICP-M巧定量檢測法等，但仍存在一定缺陷。
[0005] 關(guān)于神中毒，特別是慢性神中毒的評價，僅能通過檢測血神含量，間接反應(yīng)人體內(nèi) 的循環(huán)神含量，無法進一步評估神對于機體功能的損傷程度，而隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展， 神與人體的關(guān)系也日益緊密，因而尋找一種可W從機體功能角度評價神中毒，特別是慢性 神中毒對于機體的損害程度的評價方式日益重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對神污染嚴重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種神-IgG馨合物及其制備方 法，并建立神-IgG馨合物的定性、定量檢測方法，W便定量檢測神-IgG馨合物在評價一個 地區(qū)神污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中神-IgG馨合物可W間接反映 該個地區(qū)人群受神污染的情況，從而間接反映該個地區(qū)神污染程度。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是；提供一種神-IgG馨合物，神離子與 IgG通過琉基或/和半脫氨酸殘基馨合而成。
[0008] 本發(fā)明還提供一種上述的神-IgG馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[0009]A)神與IgG的馨合反應(yīng)；在人源的IgG中加入神離子進行馨合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶 液；
[0010] B)純化神-IgG馨合物的提??；采用免疫親和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的 IgGW及多余的神離子，即得神-IgG馨合物。
[0011] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下；
[0012] (1)溶解樣品；向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水，使神-IgG馨合物 復(fù)溶；
[001引似平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgG特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0014] 做上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgG與 填料特異性結(jié)合；
[0015] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸鹽溶液進行洗脫；
[001引 妨收集；收集經(jīng)過步驟（4)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0017] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0018](7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與神特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0019] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0020] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸鹽溶液進行洗脫；
[0021] (10)收集；收集經(jīng)過步驟（9)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[002引 （11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得神-IgG馨合物。
[0023] 其中，上述神-IgG馨合物的制備方法，還包括步驟C);對神-IgG馨合物的鑒定；
[0024] 其中，步驟C)中具體如下；
[0025] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[002引 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的神-IgG馨合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0027] 做電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0028] (4)檢測；在膠床上找出含神的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶復(fù)溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或化ISA法檢測是否含有神W及檢測神的含量。
[0029] 本發(fā)明還提供一種如上述的神-IgG馨合物在制備檢測人體內(nèi)神-IgG馨合物的試 劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的神-IgG馨合物作為對照品的試劑盒。
[0031] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有可捕獲IgG的蛋白或捕獲神的 物質(zhì)。
[0032] 本發(fā)明還提供一種定量檢測神-IgG馨合物的方法，W已知含量的上述的神-IgG 馨合物作為對照品，采用W下方法之一對樣品進行檢測；酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純神-IgG馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié) 合法、提純神-IgG馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純神-IgG馨合物與電感禪合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0033] 實施本發(fā)明的神-IgG馨合物及其制備方法和應(yīng)用，具有W下有益效果：
[0034] 1.本發(fā)明首次體外合成或從全血中提取神-IgG馨合物；
[00巧]2.本發(fā)明首次提出神-IgG馨合物可用于制備檢測血樣中神-IgG馨合物的試劑或 試劑盒中的應(yīng)用。
[0036] 3.本發(fā)明建立了神-IgG馨合物的定性定量檢測方法，W便定量檢測神-IgG馨合 物在評價一個地區(qū)神污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中神-IgG馨合物 可W間接反映該個地區(qū)人群受神污染的情況，從而間接反映該個地區(qū)神污染程度。本發(fā)明 建立的神-IgG馨合物定量檢測方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測的重復(fù)性得到大大提 局。
【附圖說明】
[0037]圖1為本發(fā)明所述的神-IgG馨合物的非變性電泳條帶圖；
[003引圖2為本發(fā)明所述的神-IgG馨合物的同步福射X線電泳條帶的巧光分析圖；
[0039] 其中，圖1中，M為Marker, 5為神-IgG馨合物；圖2中，橫坐標(biāo)為蛋白條帶位置， 縱坐標(biāo)為該蛋白條帶中神的能量。
【具體實施方式】
[0040] 下面，結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明做進一步描述：
[0041] 本發(fā)明除特別說明外，設(shè)及的實驗操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可W通過市購方式 獲得：
[0042] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0043] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種；
[0044] 本發(fā)明中的所述能與IgG特異性結(jié)合的填料，為表面附有能捕獲IgG的蛋白的娃 膠或樹脂；
[0045] 本發(fā)明中的能捕獲IgG的蛋白（抗IgG抗體），包括但不限于兔Anti-人類IgG H&L，其品牌為Abeam、型號為油6715;
[0046] 本發(fā)明中的能與神特異性結(jié)合的填料，為表面附有能捕獲神的物質(zhì)的硅膠或樹 脂；
[0047] 本發(fā)明中的能捕獲神的物質(zhì)，包括但不限于鼠抗AsmAb，購買自廣州然科公司、貨 號為服15728;
[0048] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0049] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0050]洗漆液為含有KH2PO40. 2mg/ml、化2冊〇4?12&0 2. 90mg/ml、化C18.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑為 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[0051] 封閉液為1% -5 %牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[0052]樣品稀釋液為含 1. 5mg/mL化2〇)3、2. 93mg/mlNaHC〇3的PH為 9.6的 0. 05M磯酸 鹽緩沖液；
[0053] 酶標(biāo)抗體為HRP酶標(biāo)抗體；
[0054] 終止液為：將21. 7ml的2M&8〇4定容至200ml的d地2〇中；
[005引洗脫液為含l-2mg/ml木瓜蛋白酶的PH為8.0的0.Imol/LTris-肥L緩沖液；[005引酸化劑為硝酸；
[0057]上樣緩沖液為含有 1MTris-HCl(pH6.8) 15. 5mL、1 %漠酪藍 2. 5mL、ddH2〇7mL、甘 氨酸 25血的Samplebuffer巧)〇 ;
[0058]電泳緩沖液為含Tris3mg/ml、甘氨酸14. 4mg/ml的PH為6.8的d地2〇溶液。
[0059] 本發(fā)明提供一種神-IgG馨合物，神離子與IgG通過琉基或/和半脫氨酸殘基馨合 而成