專利名稱：：鐵濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用鐵螯合物顯色劑利用直接法測定樣品中鐵濃度的方法，所述方法中在鋰離子的共存下進(jìn)行測定。
背景技術(shù)：
：血清和血漿中的鐵濃度的測定被用于貧血、缺鐵性貧血、肝硬化等的診斷，其是臨床檢査領(lǐng)域中的重要的測定項(xiàng)目之一。作為鐵濃度的測定方法，通常為使用例如聯(lián)吡啶、鄰菲咯啉等各種金屬螯合物顯色劑的比色分析法?？紤]靈敏度、特異性、溶解性等時(shí)，經(jīng)常使用紅菲繞啉、2-亞硝基-5-(N-丙基-N-磺基丙基氨基)-苯酚(亞硝基PSAP)、3-(2-吡啶基)-5,6-雙[2-(5-呋喃基磺酸)]1,2,4-三嗪'二鈉鹽、三吡啶基三嗪、鐵鋅體等鐵螯合物顯色劑。這些顯色劑全部是二價(jià)鐵的顯色劑，所以使用時(shí)需要同時(shí)使用用于將三價(jià)鐵還原的還原劑。作為三價(jià)鐵的還原劑，已知有L-抗壞血酸、硫代乙醇酸、鹽酸羥基胺、氫醌、亞硫酸氫鹽、亞硫酸鈉、硫酸肼、偏亞硫酸氫鹽(焦亞硫酸鹽)等。血清中的鐵全部以與作為血清球蛋白之一的鐵傳遞蛋白結(jié)合的形式存在，所以測定血清鐵的總量時(shí)，需要將該鐵傳遞蛋白與鐵的鍵合解離，形成游離的鐵后進(jìn)行鐵濃度的測定。作為使與鐵傳遞蛋白結(jié)合的鐵游離的方法，已知有采用除蛋白法的例如國際標(biāo)準(zhǔn)法(臨床檢查法提要，修訂第32版第l次印刷，579頁，金井正光編著，平成17年2月20日發(fā)行，金原出版株式會社)以及在確立國際標(biāo)準(zhǔn)法的過程中作為其基礎(chǔ)數(shù)據(jù)而受到重視的松原變法(臨床檢査法提要，修訂第32版第1次印刷，580-581頁，金井正光編著，平成17年2月20日發(fā)行，金原出版株式會社)。根據(jù)這些方法，對要測定鐵濃度的樣品進(jìn)行除蛋白處理后，加入鐵螯合物顯色劑，測定吸光度，以此測定樣品中鐵的總量。但是，近年隨著自動(dòng)分析裝置的發(fā)展，臨床檢査通常也開始通過自動(dòng)分析裝置來進(jìn)行了。該自動(dòng)分析裝置要求檢體或測定用試液的取樣量少，所以是經(jīng)濟(jì)的，并且其還具有可以一次處理大量檢體的優(yōu)點(diǎn)。因此，期待血清鐵等的濃度的測定也使用自動(dòng)分析裝置來進(jìn)行，但是，國際標(biāo)準(zhǔn)法和松原變法要在測定前對樣品進(jìn)行除蛋白處理，所以其存在難以適于使用自動(dòng)分析裝置進(jìn)行測定的問題。與此相對，還存在在樣品中直接加入還原劑和顯色劑進(jìn)行比色測定的"直接比色銜以下記作"直接法")"的鐵濃度測定方法(例如非專利文獻(xiàn)l:臨床檢查法提要，修訂第32版第1次印刷，579頁，金井正光編著，平成17年2月20日發(fā)行，金原出版株式會社)。與上述的國際標(biāo)準(zhǔn)法等相比，這種方法是不進(jìn)行除蛋白操作的方法，能夠適用于自動(dòng)分析裝置。因此，臨床檢查領(lǐng)域中正在普及使用自動(dòng)分析裝置利用直接法測定鐵濃度的方法。但是上述方法存在的問題是，使用自動(dòng)分析裝置利用直接法測定得到的測定值與利用國際標(biāo)準(zhǔn)法測定得到的測定值相比，直接法的測定值比國際標(biāo)準(zhǔn)法的測定值低。由于國際標(biāo)準(zhǔn)法中對樣品進(jìn)行了除蛋白處理，所以能夠使樣品中的鐵完全(100°/。)與鐵傳遞蛋白發(fā)生解離，而對于使用自動(dòng)分析裝置的直接法來說，有報(bào)告指出，其不能將鐵從鐵傳遞蛋白還原解離出來，所解離出的鐵的比例(解離度)約為93%95%左右(第51屆日本臨床檢查醫(yī)學(xué)會總會，演題編號0-76，2004)，據(jù)認(rèn)為這是引起上述問題的原因之一。，因此，現(xiàn)狀是期待確立一種鐵濃度測定方法，其既能得到與國際標(biāo)準(zhǔn)法同程度的測定值，又能使用自動(dòng)分析裝置進(jìn)行測定。非專利文獻(xiàn)l:金井正光編著，臨床檢查法提要，修訂第32版第1次印刷，金原出版株式會社，平成17年2月20日發(fā)行，579頁
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是鑒于上述情況而提出的，其課題在于提供利用直接法測定鐵濃度的方法以及在該方法中使用的試劑和試劑盒，并且所述測定方法能得到與國際標(biāo)準(zhǔn)法同等的測定值。本發(fā)明的目的在于解決上述課題，其具有如下構(gòu)成。(1)樣品中鐵濃度的測定方法，該方法的特征在于，在鋰離子的共存下使樣品中的鐵與鐵螯合物顯色劑接觸，基于產(chǎn)生的顯色的程度進(jìn)行測定。(2)—種鐵測定用試劑，其含有鐵螯合物顯色劑和鋰離子。(3)—種鐵濃度測定用試劑盒，其含有包含鐵螯合物顯色劑和鋰離子的試劑作為構(gòu)成試劑。艮P，本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若在鋰離子的共存下利用直接法進(jìn)行鐵濃度的測定，則鐵與鐵傳遞蛋白的解離得到促進(jìn)并且與鐵螯合物顯色劑的反應(yīng)得以按化學(xué)理論量進(jìn)行，從而完成了本發(fā)明。以往多用紅菲繞啉磺酸鈉、3-(2-吡啶基)-5,6-雙[2-(5-呋喃基磺酸)]1,2，4-三嗪'二鈉鹽等鈉鹽作為鐵螯合物顯色劑，但是，利用這樣的鈉鹽不能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的效果。并且也并沒有發(fā)現(xiàn)實(shí)際上使用鋰鹽作為這些鐵螯合物顯色劑的鹽的例子。因此，通過共存有鋰離子(該鋰離子來自與鈉同屬于堿金屬的鋰)而得到上述效果完全是意料之外的。通過進(jìn)行本發(fā)明的鐵濃度測定方法，可以解決與國際標(biāo)準(zhǔn)法相比所得到的測定值低這一現(xiàn)有問題，并且無需除蛋白等的復(fù)雜操作，可以利用自動(dòng)分析裝置進(jìn)行鐵濃度測定，而且其測定值與利用國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法所得的測定值相近，所以能夠進(jìn)行更精確的測定。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及的鐵濃度測定方法為樣品中鐵濃度的測定方法，其中，在鋰離子的共存下使樣品中的鐵與鐵螯合物顯色劑接觸，基于產(chǎn)生的顯色的程度進(jìn)行測定。作為本發(fā)明的測定方法中使用的鐵螯合物顯色劑，只要是與鐵結(jié)合后具有特異吸收的二價(jià)鐵顯色劑即可，例如可以使用本身公知的基于直接法的鐵濃度測定中所使用的鐵螯合物顯色劑。作為鐵螯合物顯色劑的具體例子，可以舉出例如紅菲繞啉磺酸或其鹽、2-亞硝基-5-(N-丙基-N-磺基丙基氨基)-苯酚、3-(2-吡啶基)-5，6-雙[2-(5-呋喃基磺酸)]1,2,4-三嗪或其鹽等。作為紅菲繞啉磺酸或3-(2-吡啶基)-5,6-雙[2-(5-呋喃基磺酸)]1，2，4-三嗪的鹽，可以舉出例如鈉、鉀、鋰等堿金屬的鹽。本發(fā)明中涉及的鐵螯合物顯色劑的用量可以結(jié)合鐵螯合物顯色劑的特性進(jìn)行確定，對其沒有特別限制。例如，使用紅菲繞啉磺酸或其鹽的情況下，其在試液中的濃度為0.55mM左右、優(yōu)選為12mM左右，在最終反應(yīng)液中的濃度為0.1mMlmM左右、優(yōu)選為0.2mM0.5mM左右。使用2-亞硝基-5-(N-丙基-N-磺基丙基氨基)-苯酚的情況下，其在試液中的濃度為0.2mMlmM左右、優(yōu)選為0.3mM0.6mM左右，在最終反應(yīng)液中的濃度為0.06mM0.4mM左右，優(yōu)選為0.1mM0.2mM左右。使用3-(2-吡啶基)-5,6-雙[2-(5-呋喃基磺酸)]1,2,4-三嗪或其鹽的情況下，其在試液中的濃度為lmg/mL5mg/mL左右、優(yōu)選為lmg/mL3mg/mL左右，在最終反應(yīng)液中的濃度為0.2mg/mLlmg/mL左右，優(yōu)選為0,3mg/mL0.7mg/mL左右。本發(fā)明中的鋰離子在反應(yīng)液中的濃度沒有特別限制，其用量同樣可結(jié)合測定體系中使用的鐵螯合物顯色劑的種類進(jìn)行確定，其在試液中的濃度以鋰離子計(jì)為0.1mM100mM、優(yōu)選為lmM100mM左右，在最終反應(yīng)液中的濃度為0.05mM100mM、優(yōu)選為0.5mM100mM左右。本發(fā)明涉及的測定方法中使用二價(jià)鐵顯色劑，因而需要使樣品中結(jié)合在鐵傳遞蛋白上的三價(jià)鐵與鐵傳遞蛋白解離并還原成二價(jià)鐵。作為為此使用的三價(jià)鐵的還原劑，抗壞血酸、谷胱甘肽、焦亞硫酸鈉、硫代乙醇酸、鹽酸羥基胺、硫醇化合物等通常在該領(lǐng)域中使用的還原劑全部可以使用。其中，通常使用的是抗壞血酸。至于還原劑的用量，根據(jù)所用的還原劑的種類、所使用的鐵螯合物顯色劑和使用時(shí)的pH的不同，該用量有所不同，并且隨著pH的上升，其必要量也會增加，因此不能一概而論，但可以從通常用于該領(lǐng)域中的范圍進(jìn)行適當(dāng)選擇。該還原劑在試液中的濃度為0.0006mM400mM、優(yōu)選為10mM150mM左右，在最終反應(yīng)液中的濃度為0.0005mM300mM、優(yōu)選為10mM100mM。為了實(shí)施本發(fā)明的鐵濃度測定方法，可以使用鐵螯合物顯色劑并在鋰離子的共存下利用本身公知的直接法進(jìn)行測定，此外只需基于通常的臨床檢査領(lǐng)域所進(jìn)行的本身公知的直接法的測定條件(例如反應(yīng)時(shí)間、測定波長等)、測定操作法進(jìn)行實(shí)施即可。實(shí)施基于直接法的鐵濃度測定方法時(shí)，作為使鋰離子共存的方法，只要是最終可以得到含有樣品、還原劑、鋰離子、鐵螯合物顯色劑的溶液的方法即可。但是，優(yōu)選在用還原劑對樣品進(jìn)行處理后加入鋰離子，或者將鋰離子與還原劑同時(shí)加入至樣品中。另外，優(yōu)選在加入鋰離子后或者與鋰離子同時(shí)將鐵螯合物顯色劑加入至樣品中，但并不限于此。但是，不希望在加入鋰離子前將鐵螯合物顯色劑加入至樣品中。另外，作為使鋰離子共存于直接測定的測定體系中的方法，通常使用其鹽的形式的方法是最簡便的，但并不特別地限于該方法。此時(shí)使用的鹽的種類只要不妨礙該溶液中共存的試劑等的穩(wěn)定性并且不妨礙鐵螯合物顯色劑的顯色即可，沒有特別的限制，可以舉出與例如硫酸、硝酸等無機(jī)酸的鹽；與例如氯、溴、碘等鹵原子的鹽(鹵化物)；與例如醋酸、檸檬酸、葡糖酸、丙酸、泛酸等有機(jī)酸的鹽；與上述的鐵螯合物顯色劑的鹽等。實(shí)施基于直接法的鐵濃度測定方法時(shí)，作為使鋰離子共存的具體方法，例如可以舉出如下方法。方法(l):制備還原劑溶液、含鋰離子的溶液、鐵螯合物顯色劑溶液，在樣品中依次加入還原劑溶液、含鋰離子的溶液、鐵螯合物顯色劑溶液;方法(2):制備含有還原劑和鋰離子的溶液、鐵螯合物顯色劑溶液，在樣品中依次加入含有還原劑和鋰離子的溶液、鐵螯合物顯色劑溶液；方法(3):制備還原劑溶液以及含有鋰離子和鐵螯合物顯色劑的溶液，在樣品中依次加入還原劑溶液、含有鋰離子和鐵螯合物顯色劑的溶液；方法(4):制備含有還原劑、鋰離子和鐵螯合物顯色劑的溶液，在樣品中加入該溶液，使這些成分一起發(fā)揮作用。上述方法中，從作業(yè)效率等考慮，通常的方法是方法(2)，該方法是優(yōu)選的。另外，還可以使用通常在臨床檢査領(lǐng)域中使用的鐵濃度測定用的、使用鐵螯合物顯色劑的市售品，并使鋰離子存在于構(gòu)成該市售品的某種試劑中，形成上述的狀態(tài)。作為溶解鐵螯合物顯色劑、鋰離子以及還原劑的溶液，因?yàn)橄Ｍ趯﹁F螯合物顯色劑合適的pH范圍內(nèi)進(jìn)行鐵濃度的測定，所以優(yōu)選緩沖液。本發(fā)明的測定方法中，測定時(shí)的優(yōu)選pH為pHl7，更優(yōu)選為pH26。作為構(gòu)成為了使pH處于上述范圍而使用的緩沖液的緩沖劑，通常在該領(lǐng)域使用的緩沖液全部可以使用。具體地說，可以舉出例如甘氨酸、醋酸、檸檬酸、酒石酸等。另外，除上述試劑外，當(dāng)然還可以共存有表面活性劑、各種防腐劑、穩(wěn)定劑、活化劑、共存物質(zhì)的影響回避劑以及通常臨床檢查試劑中所使用的物質(zhì)。對于這些試劑種類等的濃度范圍等，適當(dāng)選擇本身公知的該測定方法中通常使用的濃度范圍等就可以，但優(yōu)選所選擇的試劑在本發(fā)明的鐵濃度測定方法中使用的鐵螯合物顯色劑的合適pH范圍內(nèi)的穩(wěn)定性高，并且不妨礙鐵螯合物顯色劑的顯色。作為本發(fā)明涉及的測定方法中使用的表面活性劑，只要其不妨礙所使用的鐵螯合物顯色劑的顯色即可，可以使用非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、兩性表面活性劑中的任何類型，只需結(jié)合所使用的鐵螯合物顯色劑的特性適當(dāng)選擇使用。例如，至于上述的表面活性劑的使用濃度，從通常在該領(lǐng)域中使用的范圍中適當(dāng)選擇即可。其在試液中的濃度通常為0.0001%10%(W/V)左右、優(yōu)選為0.001。/。5。/。(W/V)左右，在最終反應(yīng)液中的濃度通常為0.001。/010。/0(W/V)左右、優(yōu)選為0.015。/0(W/V)左右。使鐵螯合物顯色劑以及鋰離子作用于樣品后，利用本身公知的直接法測定由于鐵螯合物顯色劑的作用而產(chǎn)生的顯色即可，至于測定時(shí)使用的其他試劑、自動(dòng)分析裝置、分光光度計(jì)等，通常用于該領(lǐng)域中試劑、裝置、分光光度計(jì)等均無例外地可以使用。另外，吸光度變化當(dāng)然還可通過使用主波長和副波長的雙波長測光來計(jì)算。此外，用于吸光度測定的測定波長根據(jù)所使用的鐵螯合物顯色劑的種類適當(dāng)選擇即可，使用紅菲繞啉磺酸或其鹽作為鐵螯合物顯色劑、以雙波長進(jìn)行測定的情況下，優(yōu)選在主波長546nm附近、副波長600nm附近進(jìn)行測定。作為用于本發(fā)明的方法中的樣品，可以舉出例如血清、血漿等血液成分。以上述方法(2)(制備含有還原劑和鋰離子的溶液、鐵螯合物顯色劑溶液，在樣品中依次加入含有還原劑和鋰離子的溶液、鐵螯合物顯色劑溶液)為例，如下具體說明本發(fā)明的鐵濃度測定方法。首先，將例如血液、血清、血漿等要測定鐵濃度的樣品與含有還原劑、鋰離子、緩沖劑以及必要時(shí)的表面活性劑等的第一試液(pH26)混合，并在通常10。C50。C、優(yōu)選20。C4(TC反應(yīng)通常2分鐘10分鐘、優(yōu)選5分鐘左右。接著，將該反應(yīng)液與含有鐵螯合物顯色劑、緩沖劑以及必要時(shí)的緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等的第二試液(pH210)混合，并在通常10°C50°C、優(yōu)選20。C4(TC反應(yīng)通常2分鐘15分鐘、優(yōu)選10分鐘左右。以吸光度的形式測定由于鐵螯合物顯色劑的作用而產(chǎn)生的顯色。將得到的測定值用于標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此求出樣品中的鐵濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是預(yù)先使用例如濃度已知的鐵標(biāo)準(zhǔn)液作為樣品并與上述同樣地進(jìn)行測定而制成的曲線，其顯示鐵濃度和吸光度的關(guān)系。上述鐵濃度的測定當(dāng)然可以通過手動(dòng)方法進(jìn)行，本發(fā)明的方法由于可以用于使用自動(dòng)分析裝置的測定系統(tǒng)，因而當(dāng)然可以使用自動(dòng)分析裝置進(jìn)行測定。此外，使用手動(dòng)方法或自動(dòng)分析裝置進(jìn)行測定的情況下，對于試劑種類的組合沒有特別限定，結(jié)合應(yīng)用的自動(dòng)分析裝置的環(huán)境、其他要因等適當(dāng)進(jìn)行組合即可。本發(fā)明涉及的鐵濃度測定用試劑含有鐵螯合物顯色劑和鋰離子，其優(yōu)選方式、具體例以及濃度等如上所述。本發(fā)明的鐵濃度測定用試劑盒只要含有包含鐵螯合物顯色劑以及鋰離子的試劑作為構(gòu)成試劑即可。各構(gòu)成要件的優(yōu)選方式、具體例以及使用濃度等如上所述。另外，該試劑盒的各試劑中還可以在通常該領(lǐng)域使用的范圍內(nèi)具有該領(lǐng)域通常使用的例如緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑等。另外，該試劑盒中根據(jù)需要還可以組合有鐵標(biāo)準(zhǔn)品。另外，該試劑盒由2個(gè)以上的試液構(gòu)成的情況下，各試液中還可含有對測定對象成分進(jìn)行測定所必須的試劑種類，對于這些試劑種類，可以將其適當(dāng)分散到各試液中的任一試液中以含有該試劑，并在混合各試液時(shí)引發(fā)目的成分測定的反應(yīng)。構(gòu)成這些試液的試劑種類的使用濃度可從通常在該領(lǐng)域中使用的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)選擇。作為本發(fā)明的試劑盒的具體實(shí)施方式，例如可以舉出如下構(gòu)成。(1)由含有還原劑的第一試液、含有鐵螯合物顯色劑的第二試液構(gòu)成，并且在上述第一試液和第二試液的至少一方中含有鋰離子。(2)以含有還原劑、鋰離子、鐵螯合物顯色劑的試液作為構(gòu)成試劑。下面舉出實(shí)施例和參考例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但這些不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。實(shí)施輛根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)法、國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法(國際標(biāo)準(zhǔn)法中因除蛋白而導(dǎo)致液量減少，所以為了對其進(jìn)行修正，向樣品中添加3當(dāng)量(濃度)的鐵進(jìn)行測定，根據(jù)與其回歸式的x軸的交點(diǎn)求出樣品中的鐵濃度)以及使用自動(dòng)分析裝置的現(xiàn)有的直接法，測定同樣的血清樣品15的血清中的鐵濃度，比較各自的測定值。(i)國際標(biāo)準(zhǔn)法根據(jù)臨床檢查法提要(修訂第32版第1次印刷，580頁，金井正光編著，平成17年2月20日發(fā)行，金原出版株式會社)記載的方法如下進(jìn)行。-除蛋白試劑將98g三氯醋酸(特級)溶解在約600mL水中，加入30mL硫代乙醇酸和83mL鹽酸(特級)，混合后用水定容到1000mL。用褐色瓶保存。-顯色試劑在1000mL1.5M乙酸鈉(特級)中加入并溶解250mg紅菲繞啉磺酸(道蒂特試劑)。.鐵標(biāo)準(zhǔn)液(200(ig/dL):將lmL鐵標(biāo)準(zhǔn)液(FelOOO)(和光純藥工業(yè)(株)制造)用水稀釋至100mL(lmg/dL)，并將其進(jìn)一步用水稀釋5倍，使用該稀釋液。1)取血清樣品15各2.0mL放入容器，分別加入2.0mL除蛋白試劑，用混合器充分混合后，在56。C加熱15分鐘，然后再次混合，隨后進(jìn)行離心處理。2)取2.0mL上清液，加入2.0mL顯色試劑，充分混合后，放置10分鐘。3)與使用血清樣品時(shí)同樣地對水(盲檢用)和鐵標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行上述l)和2)的操作(但是不進(jìn)行離心處理)。4)以水為對照，在535nm測定檢體、標(biāo)準(zhǔn)液、盲檢的各顯色液的吸光度，分別記作EA、Es、EB，應(yīng)用下式計(jì)算各樣品中的血清鐵濃度。血清鐵濃度=200x(EA-EB)/(Es-EB)(ig/dL結(jié)果示于表l。P)國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法國際標(biāo)準(zhǔn)法中因除蛋白而導(dǎo)致液量減少，所以為了對其進(jìn)行修正，向樣品中添加3當(dāng)量的鐵，然后進(jìn)行測定，根據(jù)與其回歸式的X軸的交點(diǎn)求出樣品中的鐵濃度。取與國際標(biāo)準(zhǔn)法中所用相同的血清樣品15，每個(gè)樣品分別放入4個(gè)容器，每個(gè)容器放入2.0mL，在對應(yīng)每個(gè)樣品的四個(gè)容器中的三個(gè)中加入鐵標(biāo)準(zhǔn)液，使其分別為50嗎/dL、100昭/dL、150嗎/dL，將這三種溶液和沒有加入鐵標(biāo)準(zhǔn)液的溶液作為試驗(yàn)溶液使用。試劑使用與上述(l)國際標(biāo)準(zhǔn)法相同的試劑。[血清鐵濃度的測定]對上述制備的試驗(yàn)溶液按與上述(l)國際標(biāo)準(zhǔn)法相同的步驟進(jìn)行吸光度的測定。制作顯示得到的吸光度與濃度的關(guān)系的曲線圖，根據(jù)其回歸式的X軸與原點(diǎn)的距離求出樣品中的鐵濃度。結(jié)果一并示于表l。(3)使用自動(dòng)分析裝置利用現(xiàn)有的直接法的測定方法使用市售的基于直接法的鐵濃度測定用試劑盒(A社制造、B社制造、C社制造；分別記作試劑盒A、試劑盒B、試劑盒C)，試劑盒的組成分別如下所示，根據(jù)各試劑盒的現(xiàn)貨說明書記載的標(biāo)準(zhǔn)操作法，分別如下設(shè)定測定參數(shù)，測定血清樣品15的鐵濃度。結(jié)果一并示于表l。此外，測定使用日立7170S型自動(dòng)分析裝置，將得到的吸光度值用于標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此確定鐵濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是預(yù)先使用例如鐵濃度已知的樣品代替血清樣品并同樣地進(jìn)行測定而制成的曲線，其顯示鐵濃度和吸光度的關(guān)系。[試劑盒A](R-l)緩沖液含有40mM抗壞血酸并含有表面活性劑的400mM甘氨酸緩沖液(pH3.5)(R-2)顯色試液含有1.86mM紅菲繞啉磺酸鈉并含有表面活性劑的40mM甘氨酸緩沖液(pH3.0)測定方法2點(diǎn)終點(diǎn)法[16]-[34]樣品量12|aLR-l:160&LR-2:40pL測定波長600/546nm測定溫度37°C標(biāo)準(zhǔn)品濃度200(ig/dL(R-l)還原劑溶液含有L-抗壞血酸的溶液。(R-2)顯色液含有0.45rnM2-亞硝基-5-(N-丙基-N-磺基丙基氨基)-苯酚的溶液測定方法2點(diǎn)終點(diǎn)法[16]-[34]樣品量15pLR-l:150jxLR-2:60|iL測定波長750/600nm測定溫度37°C標(biāo)準(zhǔn)品濃度200pg/dL[試劑盒C](R-l)緩沖液組成不明(R-2)顯色液含有2.47mg/mL3-(2-吡啶基)-5，6-雙[2-(5-呋喃基磺酸)]1,2,4-三嗪二鈉鹽等的溶液測定方法2點(diǎn)終點(diǎn)法[16]-[34]樣品量12jiLR-l:180|iLR-2:45(iL測定波長700/600nm測定溫度37。C標(biāo)準(zhǔn)品濃度200昭/dL(4)結(jié)果結(jié)果示于下述表l。表1中，將測定值的比例分別示于各平均值下面的()內(nèi)，該測定值的比例中，以基于國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測定所得到的測定值為100，計(jì)算基于國際標(biāo)準(zhǔn)法、或者使用試劑盒A、B或C的直接法進(jìn)行測定所得到的測定值的比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表1可知，與國際標(biāo)準(zhǔn)法和標(biāo)準(zhǔn)添加法所得到的測定值相比，基于現(xiàn)有的直接法測定所得到的測定值較低。實(shí)施例1(R-l)緩沖液含有10mM的氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀或氯化銫(堿金屬離子為10mM)、40mM抗壞血酸、以及表面活性劑的400mM甘氨酸緩沖液(pH3.5)(R-2)顯色試液含有1.86mM紅菲繞啉磺酸鈉以及表面活性劑的40mM甘氨酸緩沖液(pH3.0)使用上述的試液，利用日立7170S型自動(dòng)分析裝置對血清樣品6IO進(jìn)行測定?！矞y定條件)如下設(shè)定測定參數(shù)，測定各樣品中的血清鐵濃度。測定方法2點(diǎn)終點(diǎn)法[16]-[34]樣品量12jiLR-l:160|iLR-2:40|iL測定波長600/546nm測定溫度37°C標(biāo)準(zhǔn)品濃度200(Ig/dL將所得到的吸光度值用于標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此確定鐵濃度。所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是預(yù)先使用例如鐵濃度己知的樣品代替血清樣品并同樣地進(jìn)行測定而制成的曲線，其顯示鐵濃度和吸光度的關(guān)系。此外，測定時(shí)的堿金屬離子濃度為約7.5mM。結(jié)果示于表2。作為對照，使用同樣的血清樣品，根據(jù)參考例1的國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測定。結(jié)果一并示于表2。表2中，將測定值的比例分別示于各平均值下面的()內(nèi)，該測定值的比例中，以基于國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測定所得到的測定值為100，計(jì)算在各堿金屬離子的共存下以直接法進(jìn)行測定所得到的測定值所占的比例。并且，將與國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法的差一并示于表2，其中，以基于國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測定得到的測定值為100，計(jì)算在各堿金屬離子的共存下以直接法進(jìn)行測定所得到的測定值的比例(％)，將該測定值的比例(％)與以國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測定得到的測定值(100%)的差作為"與國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法的差"。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表2可知，在鈉、鉀、銫等堿金屬離子的共存下以直接法進(jìn)行測定的情況下，所得到的測定值比以國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法所得到的測定值低。與此相對，只有在共存有鋰離子的條件下同樣以直接法進(jìn)行測定時(shí)所得到的測定值與以國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法所得到的測定值近似，能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的。據(jù)推測，這是因?yàn)橹挥性诠泊嬗袖囯x子的條件下鐵與鐵傳遞蛋白進(jìn)行解離時(shí)解離出的全部鐵才能與螯合物顯色劑進(jìn)行結(jié)合并顯色。實(shí)施例2除了在"(R-l)緩沖液"中添加氯化鋰使之達(dá)到0.1mM、lmM、10mM或100mM的濃度(測定時(shí)的鋰離子濃度分別為0.075mM、0.75mM、7.5mM、75mM)以外，使用與實(shí)施例1同樣制備的試劑，以與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行血清樣品1115的鐵濃度的測定。結(jié)果示于表3。作為對照，使用同樣的血清樣品，以參考例1的國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測定。結(jié)果一并示于表3。表3中，將測定值的比例分別示于各平均值下方的()內(nèi)，該測定值的比例中，以基于國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測定所得到的測定值為100，計(jì)算在各濃度的氯化鋰存在下以直接法進(jìn)行測定所得到的測定值所占的比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>由表3可知，通過共存有鋰離子能夠更高精度地進(jìn)行鐵濃度的測定，特別是測定時(shí)的鋰離子共存量為0.075mM以上、更優(yōu)選為0.075mM75mM的范圍時(shí)，測定值沒有差別，并且與國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法的測定值一致。實(shí)施例3在參考例1的"(3)使用自動(dòng)分析裝置利用現(xiàn)有的直接法的測定方法"中，在各試劑盒的緩沖液或還原劑溶液中加入氯化鋰，使其濃度為lOmM(使用試劑盒A和試劑盒C的情況下，測定時(shí)的鋰離子濃度為7.5mM，使用試劑盒B的情況下，測定時(shí)的鋰離子濃度為6.7mM)，以此作為(R-1)緩沖液，除此以外以與參考例1同樣的方法進(jìn)行血清樣品1620中血清鐵濃度的測定，將其結(jié)果作為"添加"的情況示于表4。另外，以參考例1的"(3)使用自動(dòng)分析裝置利用現(xiàn)有的直接法的測定方法"測定同樣的血清樣品中的血清鐵濃度。將其結(jié)果以"無添加"的情況一并示于表4。另外，作為對照，使用同樣的血清樣品，以參考例1的國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測定。結(jié)果一并示于表4。此外，表4中，將測定值的比例分別示于各平均值的下方的()內(nèi)，該測定值的比例中，以國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測定所得到的測定值為100，計(jì)算存在或不存在氯化鋰(鋰離子)的條件下以直接法進(jìn)行測定所得到的測定值的比例。并且，以不存在氯化鋰下進(jìn)行測定所得到的測定值為100，將氯化鋰存在的條件下使用相同的試劑盒進(jìn)行測定所得到的測定值的比例也以"相對無添加"一并示于表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由表4可知，雖然對于不同種類的鐵螯合物顯色劑有不同程度的效果，但是使用任一種試劑盒的情況下，在氯化鋰(鋰離子)的共存下，根據(jù)直接法使用鐵濃度測定用試劑盒進(jìn)行測定時(shí)，所得到的測定值高于不存在氯化鋰下進(jìn)行測定時(shí)所得到的測定值，并且接近于國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法的測定值。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明提供能得到與國際標(biāo)準(zhǔn)法同等的測定值的以直接法測定鐵濃度的方法以及該方法中使用的試劑和試劑盒。通過進(jìn)行本發(fā)明的鐵濃度測定方法，可以解決以往的問題(即所得到的測定值低于以國際標(biāo)準(zhǔn)法得到的測定值的問題)，并且不需要除蛋白等復(fù)雜的操作，能夠利用自動(dòng)分析裝置測定鐵濃度，并且其測定值與以國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法的測定值近似，所以能夠更精確地測定。權(quán)利要求1、樣品中鐵濃度的測定方法，該測定方法的特征在于，在鋰離子的共存下使樣品中的鐵與鐵螯合物顯色劑接觸，基于產(chǎn)生的顯色的程度進(jìn)行測定。2、如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中，所述鐵螯合物顯色劑為紅菲繞啉磺酸或其鹽、2-亞硝基-5-(N-丙基-N-磺基丙基氨基)-苯酚、3-(2-吡啶基)-5,6-雙[2-(5-呋喃基磺酸)]1，2，4-三嗪或其鹽。3、如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中，所述鋰離子來自鋰鹽。4、如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中，所述鐵螯合物顯色劑是紅菲繞啉磺酸或其鹽。5、如權(quán)利要求14任一項(xiàng)所述的測定方法，其中，共存有還原劑，從而將樣品中的鐵還原成二價(jià)。6、一種鐵測定用試劑，其含有鐵螯合物顯色劑和鋰離子。7、如權(quán)利要求6所述的試劑，其中，所述鐵螯合物顯色劑是紅菲繞啉磺酸或其鹽。8、一種鐵濃度測定用試劑盒，其含有包含鐵螯合物顯色劑和鋰離子的試劑作為構(gòu)成試劑。9、如權(quán)利要求8所述的試劑盒，所述試劑盒由含有還原劑的第一試液和含有鐵螯合物顯色劑的第二試液構(gòu)成，其中上述第一試液和第二試液中的至少一方含有鋰離子。10、如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中，所述試劑盒通過含有包含還原劑和鋰離子的第一試液以及包含鐵螯合物顯色劑的第二試液來構(gòu)成。11、如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中，所述鐵螯合物顯色劑是紅菲繞啉磺酸或其鹽。全文摘要本發(fā)明涉及鐵濃度測定方法，所述方法用于樣品中鐵濃度的測定。本發(fā)明還涉及在該測定方法中使用的鐵測定用試劑和試劑盒。本發(fā)明所涉及的測定方法的特征在于，在鋰離子的共存下使樣品中的鐵與鐵螯合物顯色劑接觸，基于產(chǎn)生的顯色的程度進(jìn)行測定。根據(jù)本發(fā)明可以解決以往的問題即所得到的測定值比以國際標(biāo)準(zhǔn)法得到的測定值低的問題，并且不需要除蛋白等復(fù)雜的操作，能夠利用自動(dòng)分析裝置測定鐵濃度，并且其測定值與以國際標(biāo)準(zhǔn)法的標(biāo)準(zhǔn)添加法得到的測定值近似，所以能夠更精確地測定。文檔編號G01N33/84GK101171518SQ20068001587公開日2008年4月30日申請日期2006年5月9日優(yōu)先權(quán)日2005年5月12日發(fā)明者井尻晴久,花田壽郎,赤羽和申請人:和光純藥工業(yè)株式會社