一種汞-血紅蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢測領(lǐng)域，更具體地說，設(shè)及一種隸-血紅蛋白馨合物及其制備方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血紅蛋白化emoglobin ;皿；HGB)是高等生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)載氧的一種蛋白質(zhì)。是使 血液呈紅色的蛋白。人類紅細(xì)胞內(nèi)有S種正常血紅蛋白即化-A、A2及F。化-A是正常成人 紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白之主要成分，化-A2是次要成分約占2%，而化-F在正常成人或兒童之 紅細(xì)胞中占2-3% W下，化-F在胚胎十月開始產(chǎn)生為胎兒紅細(xì)胞之主要成分，足月新生兒 的紅細(xì)胞中化-F占70-80%，其余為化-A，二個(gè)月后占50%，四個(gè)月后少于10%，六個(gè)月 后大部消失。血紅蛋白除運(yùn)輸氧氣二氧化碳，還可W導(dǎo)致血管疫李和血管收縮。在體內(nèi)存 在的=種形式的血紅蛋白，氧合血紅蛋白、還原型血紅蛋白及高鐵血紅蛋白，其中氧合血紅 蛋白縮血管能力最強(qiáng)，而高鐵血紅蛋白幾乎沒有收縮血管活性。
[0003] 隸化gckel，Hg)與人體的健康息息相關(guān)，首先其是人體維持健康所必需的微量元 素，其存在于多種氨化酶中，催化氨的氧化還原反應(yīng)，參與多種酶蛋白的合成和細(xì)胞激素及 色素的代謝，具有促進(jìn)鐵的吸收和紅細(xì)胞的增長、激活酶形成輔酶、增強(qiáng)膜島素、降血糖、保 護(hù)屯、血管等作用，因此如果人體缺乏隸，會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。但是，事實(shí)在生活中，由于環(huán)境 污染，人體內(nèi)很少缺乏隸，相反隸的含量常常過量，常常導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至危及生命。
[0004] 隸作為一種常見的有毒金屬，廣泛應(yīng)用于生活、生產(chǎn)之中，包括生產(chǎn)硬幣、珠寶、隸 合金不誘鋼、制造化-Cd電池等，與人們的生活息息相關(guān)。隨著科技的進(jìn)步，人們將隸作為 催化劑用于生產(chǎn)碳納米顆粒的生產(chǎn)之中，又進(jìn)一步加深了隸對于人類的影響。對于普通人 群，隸主要是通過食入、飲入、接觸等方式攝入隸，當(dāng)然吸煙也是一重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，過 量的隸會(huì)導(dǎo)致機(jī)體多處組織及器官損傷，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，包括呼吸系統(tǒng)疾病（肺炎、 支氣管炎、肺纖維化、哮喘、肺水腫等）、屯、血管疾病、腎臟疾病、皮膚疾病等，甚至還會(huì)導(dǎo)致 腫瘤的發(fā)生。
[0005] 流行病學(xué)資料顯示，長期接觸隸的工人，其患呼吸系統(tǒng)腫瘤的幾率大大增加，并且 其因呼吸系統(tǒng)腫瘤致死的幾率也大大增加。動(dòng)物模型、體外模型試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，隸可W誘導(dǎo)腫 瘤的發(fā)生。1990年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（InternationalAgencyforResearchonCancer, lARC)已將隸化合物作為第一類致癌物質(zhì)（Group1)，將金屬隸作為2B類致癌物質(zhì)（Group 2B)?？梢?，隸嚴(yán)重威脅人體的健康。
[0006] 隸與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密化可W與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對隸毒性研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到隸與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重 要的角色，被認(rèn)為是了解隸的毒性機(jī)理的關(guān)鍵所在，因此，對隸和蛋白質(zhì)相互作用的研究就 顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于隸與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理僅是冰山一角，還有很多蛋白質(zhì)與隸之 間的關(guān)系還不清楚，因而加強(qiáng)對于隸與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對隸污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種隸-血紅蛋白馨合物及其制 備方法，并建立隸-血紅蛋白馨合物的定性、定量檢測方法，W便定量檢測隸-血紅蛋白馨 合物在評價(jià)一個(gè)地區(qū)隸污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個(gè)地區(qū)人群血清中隸-血紅蛋白 馨合物可W間接反映該個(gè)地區(qū)人群受隸污染的情況，從而間接反映該個(gè)地區(qū)隸污染程度。 [000引本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種隸-血紅蛋白馨合物，隸 離子與血紅蛋白通過琉基或/和半脫氨酸殘基馨合而成。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述的隸-血紅蛋白馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[0010] A)隸與血紅蛋白的馨合反應(yīng)；在提純源于人體的血紅蛋白或按照生物學(xué)方法重 組的血紅蛋白中加入隸離子進(jìn)行馨合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0011] B)純化隸-血紅蛋白馨合物的提??；采用免疫親和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反 應(yīng)的血紅蛋白W及多余的隸離子，即得隸-血紅蛋白馨合物。
[0012] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0013] (1)溶解樣品；向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使隸-血紅蛋白馨 合物復(fù)溶；
[0014] (2)平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與血紅 蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[00巧]做上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，血紅蛋 白與填料特異性結(jié)合；
[0016] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液I;
[0017] 妨收集：收集洗脫液I;
[001引 （6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地20透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0019] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與隸特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0020] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0021] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液II;
[00。] (10)收集；收集洗脫液II;
[002引 （11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立 次后，4 °C透析過夜，收集樣本，即得隸-血紅蛋白馨合物。
[0024] 其中，上述隸-血紅蛋白馨合物的制備方法，還包括步驟C);對隸-血紅蛋白馨合 物的鑒定；
[0025] 其中，步驟C)中具體如下；
[0026] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0027](2)加樣；取步驟B)中提取純化得到的隸-血紅蛋白馨合物，加入稀釋緩沖液，并 混勻，然后加樣于樣品槽中；
[00測 做電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0029] (4)檢測；在膠床上找出含隸的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有隸W及檢測隸的含量。
[0030] 本發(fā)明還提供一種如上述的隸-血紅蛋白馨合物在制備檢測人體內(nèi)隸-血紅蛋白 馨合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的隸-血紅蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。
[0032] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲血紅蛋白的物質(zhì)或捕獲隸 的物質(zhì)。
[0033] 本發(fā)明還提供一種定量檢測隸-血紅蛋白馨合物的方法，W已知含量的上述的 隸-血紅蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用W下方法之一對樣品進(jìn)行檢測；酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免 疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純隸-血紅蛋白 馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純隸-血紅蛋白馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純隸-血紅 蛋白馨合物與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感禪合 等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0034] 實(shí)施本發(fā)明的隸-血紅蛋白馨合物及其制備方法和應(yīng)用，具有W下有益效果：
[0035] 1.本發(fā)明首次體外合成隸-血紅蛋白馨合物；
[0036] 2.本發(fā)明首次提出隸-血紅蛋白馨合物可用于制備檢測血樣中隸-血紅蛋白馨合 物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0037] 3.本發(fā)明建立了隸-血紅蛋白馨合物的定性定量檢測方法，W便定量檢測隸-血 紅蛋白馨合物在評價(jià)一個(gè)地區(qū)隸污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個(gè)地區(qū)人群血清中 隸-血紅蛋白馨合物可W間接反映該個(gè)地區(qū)人群受隸污染的情況，從而間接反映該個(gè)地區(qū) 隸污染程度。本發(fā)明建立的隸-血紅蛋白馨合物定量檢測方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使 檢測的重復(fù)性得到大大提高。
【附圖說明】
[003引圖1為本發(fā)明所述的隸-血紅蛋白馨合物的非變性電泳條帶圖；
[0039] 圖2為本發(fā)明所述的隸-血紅蛋白馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光分析 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0041] 本發(fā)明除特別說明外，設(shè)及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可W通過市購方式 獲得：
[0042] 磯酸鹽溶液為0. 05-0.Imol/L化2冊〇4溶液或0. 5-lmol/L化2冊〇4溶液；
[0043] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0044] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種；
[0045] 捕獲血紅蛋白的物質(zhì)為上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)的型號為KAY0043的抗 血紅蛋白抗體；其中，本發(fā)明所述與血紅蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗皿抗體、抗血紅蛋白抗 體均為捕獲血紅蛋白的物質(zhì)；
[0046] 捕獲隸的物質(zhì)為己傲得生物科技有限公司生產(chǎn)的型號為AP7014的鼠抗化mAb; 其中，本發(fā)明所述與隸特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗化抗體、抗隸抗體、隸抗均為捕獲隸的物質(zhì)；
[0047] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0048] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0049] 紅細(xì)胞裂解液的配方如下；139.6mmol/L畑典1，16. 96mmol/LTris，用Imol/L肥1 調(diào)抑至7. 2;
[0化0]洗漆液為含有KH2PO4O. 2mg/ml、化2冊〇4? 12&0 2. 90mg/ml、化C18.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑為 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[0化1] 封閉液為1% -5 %牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[005引 稀釋緩沖液為含1. 5mg/mL化20)3、2. 93mg/mlNaHC03的PH為9.6的0. 05M碳酸 鹽緩沖液