油茶良種長林3號和21號的特異性標記引物及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及油茶良種長林3號和長林21號的分子特異性標記引物及其鑒定方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 油茶是我國栽植面積最大、分布范圍較廣的木本油料樹種。大力發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，對 保障糧油安全，促進農(nóng)民增收，推進山區(qū)綜合開發(fā)和建設(shè)社會主義新農(nóng)村，都具有十分重要 的意義。我國油茶產(chǎn)業(yè)方興未艾，發(fā)展?jié)摿薮蟆Ｄ壳?，我國油茶林總面積達4500多萬畝， 但產(chǎn)量很低，每畝產(chǎn)茶油僅4公斤左右。其根本原因是，絕大部分油茶林品種品質(zhì)差或嚴重 退化，而大量的國家和省級審（認）定的優(yōu)良品種又未推廣應(yīng)用。同時，一些地方種苗質(zhì)量 意識淡薄，經(jīng)營管理粗放。為保障油茶產(chǎn)業(yè)又好又快發(fā)展，要充分認識油茶良種對發(fā)展油茶 產(chǎn)業(yè)的重要性，必須加快油茶優(yōu)良種苗發(fā)展和強化質(zhì)量管理。
[0003] 我國目前對油茶種苗質(zhì)量的監(jiān)督管理，主要依靠在管理層面制定的各項制度，而 在技術(shù)層面尚未取得關(guān)鍵性突破，特別是缺乏油茶良種的早期快速鑒別技術(shù)體系。目前通 過國家林木良種審定的12個長林品種系列分別為長林3號、長林4號、長林18號、長林21 號、長林23號、長林26號、長林27號、長林40號、長林53號、長林55號、長林56號、長林 166號。這些油茶良種具有早實豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、出籽率高、含油量高、抗性強、適應(yīng)性廣等特點。 對油茶種苗質(zhì)量的監(jiān)督管理要著力解決目前生產(chǎn)上油茶種苗的混亂局面，并首先從技術(shù)層 面上對長林油茶良種進行鑒別保護。
[0004] 目前對油茶品種的鑒別主要依據(jù)表觀特征，但由于許多形態(tài)性狀鑒定的周期 長、受環(huán)境影響大，并且品種數(shù)量不斷增多，使得品種鑒定愈來愈困難。自本世紀以來， 一些基于PCR的分子標記技術(shù)如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增 多態(tài)性DNA)、ISSR(Inter_Simple Sequence Repea，簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性）和 SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴增多態(tài)性）相繼用于了油 茶的種質(zhì)資源遺傳多樣性、遺傳距離研宄，但對于分子標記與油茶性狀的連鎖、油茶品種間 的分子鑒別研宄很少。況且，這些分子標記技術(shù)所采用的均為通用引物，其PCR擴增圖譜不 僅復(fù)雜、重復(fù)性差，而且特異性不高，因此并不適合用于品種鑒別，只有開發(fā)出某個品種穩(wěn) 定、特異的DNA指紋標記才能真正用于該品種的準確快速鑒定。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的提供一對特異性高的油茶良種長林3號和長林21號的分子特異性標 記引物，以及一種能對油茶良種長林長林3號和長林21號進行快速鑒定的方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 油茶良種長林3號和長林21號的分子特異性標記引物，所述引物序列如下：
[0008] 上游引物：5' -AATGAATGGTGCTTTGGATT-3'，
[0009] 下游引物：5，-CAAAACCACACCTTGAGTCC-3 '。
[0010] 該引物對是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量篩選試驗獲得油茶良種長林3號和長林21號 的特異性DNA片段之后，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計特異性引物，以 該引物對油茶良種進行PCR擴增，僅長林3號和長林21號可穩(wěn)定獲得769bp大小的特異性 片段，而其他油茶品種均不能獲得該特異性片段。需要說明的是，本發(fā)明分子特異性標記引 物僅限于油茶良種的鑒別（鑒別其是否為長林3號或長林21號之一，后續(xù)可再進行進一步 鑒定），即待測樣品僅限于油茶。
[0011] 本發(fā)明還涉及一種利用所述的分子特異性標記引物對油茶良種長林3號和長林 21號進行快速鑒別的方法，所述方法為：提取待測油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以 所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳 結(jié)果出現(xiàn)769bp大小的DNA條帶，則待測油茶品種為油茶良種長林3號或長林21號，反之 則否；所述分子特異性標記引物序列為：
[0012] 上游引物：5' -AATGAATGGTGCTTTGGATT-3，，
[0013] 下游引物：5' -CAAAACCACACCTTGAGTCC-3 '。
[0014] 本發(fā)明方法關(guān)鍵在于擴增引物的選擇，DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件確定， 以及電泳檢測，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進行。
[0015] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述20 μ L PCR反應(yīng)體系組成如下：
[0016]
[0017] 所述PCR擴增條件如下：94°C預(yù)變性7min ;94°C變性45min、61°C退火45s、72°C延 伸2min，共30個循環(huán)；最后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
[0018] 具體的，所述方法如下：
[0019] (1)取待測油茶葉片，加液氮磨碎，提取待測油茶的基因組DNA ;所述基因組DNA提 取可利用新型快速植物基因組DNA提取盒（DP3111，BioTeke，北京百泰克生物技術(shù)有限公 司）進行；
[0020] (2)以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引 物，進行PCR擴增：
[0021] PCR反應(yīng)體系每20 μ L組成如下：
[0022] 2 X Power Taq PCR Master Mix IOyL
[0023] 10 μ M上、下游引物 各IyL
[0024] 20ng/ μ L 模板 DNA 3 μ L
[0025] ddH20 補足至 20 μ L ;
[0026] PCR反應(yīng)條件如下：
[0027] 94°C預(yù)變性 7min ;94°C變性 45min、61°C退火 45s、72°C延伸 2min，共 30 個循環(huán)；最 后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
[0028] (3)取步驟⑵擴增產(chǎn)物5 μ L，與1 μ L 0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勾，點樣于1. 5 % 的瓊脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動凝膠 圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)769bp的DNA條帶，則待測油茶品種為長林3號或長林 21號，反之則否。
[0029] 本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明分子特異性標記引物可對油茶良種長林3號 和長林21號進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別油茶良種所不能 替代的分子手段。 (四）
【附圖說明】
[0030] 圖1為對油茶良種進行