cccDNA標準品及其制備方法、定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種cccDNA標準品以及制備方法，cccDNA標準品包括一個單位的HBV基因組DNA和一個重組位點attR。本發(fā)明還公開了一種使用上述cccDNA標準品的定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法和試劑盒。這種定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法以綠豆核酸酶清除rcDNA干擾的同時，制備HBV微環(huán)DNA作為cccDNA標準品，以PCR技術結合熒光標記探針雜交法對乙型肝炎病毒cccDNA進行定量檢測，相對于傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR檢測cccDNA，定量精確。
【專利說明】cccDNA標準品及其制備方法、定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種cccDNA標準品及其制備方法、定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]乙肝病毒(HBV病毒)感染宿主后，HBV病毒松弛環(huán)狀DNA (rcDNA)進入宿主細胞細胞核形成的共價閉合環(huán)狀的超螺旋雙鏈DNA分子基因組，該共價閉合環(huán)狀的超螺旋雙鏈DNA分子能形成環(huán)狀的DNA結構，稱為共價鍵密閉環(huán)狀DNA (cccDNA)。cccDNA是乙肝病毒的復制“池”，對cccDNA的準確定量能輔助對乙肝病毒的診斷。
[0003]cccDNA和rcDNA在結構上有很大不同:rcDNA在正鏈與負鏈上均有缺口或缺亥IJ，只是部分區(qū)域互補故能形成環(huán)狀結構，但非超螺旋結構；而cccDNA兩條鏈均是完整的，二者共價互補，形成超螺旋結構(Nassal, M.(2008)." HepatitisB viruses: Reversetranscription a different way."Virus Research 134(1-2):235-249)。由于缺口或缺刻的存在，rcDNA可以被一些核酸酶如外切核酸酶II1、綠豆核酸酶等降解成寡核苷酸或單核苷酸，而cccDNA則由于是超螺旋且雙鏈結構均是完整的，一般不會被上述酶降解。上述差異是設計和建立cccDNA檢測技術的基礎。
[0004]cccDNA的定性檢測:既往絕大多數(shù)文獻報道的是用Southern blot對cccDNA進行定性檢測，但技術要求較高，敏感度低。近年來,PCR技術對cccDNA進行檢測的技術得到發(fā)展。由于PCR技術靈敏度極高，rcDNA和cccDNA的序列又具有高度的同源性，因此在用PCR技術檢測cccDNA時，必須確保只能擴增cccDNA而rcDNA不被擴增。目前利用rcDNA和cccDNA結構上的差異可以解決這一問題。由于rcDNA的正鏈和負鏈上均存在缺口，故可以設計跨越兩個缺口的引物，使rcDNA不會被擴增，而cccDNA由于是完整的雙鏈結構則可以被選擇性擴增。
[0005]cccDNA的定量檢測:在定性檢測的基礎上，可以進一步對cccDNA進行定量檢測。He等建立了實時熒光定量PCR檢測cccDNA的方法(Mark A Kay，Cheng-YiHe&Zh1-YingChen.(2010)." A robust system for production of minicircleDNAvectors."Nature Biotechnology 28(12): 1287-1289),他們將TaqmanMGB探針設計在負鏈缺刻的下游，與負鏈互補結合。對cccDNA，在上游引物的引導下，Taq酶到達TaqmanMGB探針所結合的位點，利用其5’ 一 3’外切活性將探針切斷，3’端的淬滅基團失去對5’端的發(fā)光基團的抑制作用，從而產生熒光信號。每擴增一個cccDNA分子，就會產生一個熒光信號，PCR儀可對產生的信號進行實時監(jiān)測，根據熒光信號的強弱對cccDNA進行定量。
[0006]目前最常用的定量檢測cccDNA的方法是實時熒光定量PCR檢測cccDNA。如圖1所示，該方法由一對跨rcDNA雙 缺口的特殊引物和一個熒光探針實現(xiàn)。正義引物Pl與負鏈互補結合，位于正鏈缺口上游，反義引物P2與正鏈互補結合，位于負鏈缺口下游，rcDNA因為存在缺口而不被擴增，cccDNA則能被選擇性的擴增。在cccDNA負鏈缺口下游加入一個與負鏈互補的熒光探針，可實現(xiàn)熒光定量PCR對cccDNA的定量分析。但是，由于cccDNA陽性標準品獲得困難，多為PCR擴增得到的cccDNA線性雙鏈片段，其構象、鏈間作用力等理化特征與天然的cccDNA相差甚遠，從而對熒光定量PCR過程和結果造成影響，使得cccDNA的定量不能精確。

【發(fā)明內容】

[0007]基于此，有必要提供一種cccDNA標準品及其制備方法、一種使用該cccDNA標準品的定量精確的定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法及試劑盒。
[0008]一種cccDNA標準品，所述cccNDA標準品包括一個單位的HBV基因組DNA和一個重組位點attR。
[0009]一種cccDNA標準品的制備方法，包括如下步驟:
[0010]首先將一個單位的HBV基因組DNA連接到含有重組位點attB和attP的微環(huán)制備載體上，接著采用微環(huán)DNA制備技術，attB和attP重新組合后形成attR，從而制備出HBV微環(huán)DNA，該HBV微環(huán)DNA即為所述cccDNA標準品。
[0011]在一個實施方式中，所述微環(huán)制備載體為微環(huán)制備載體ZY781。
[0012]一種定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法，包括如下步驟:
[0013]從待測物中提取DNA，并采用綠豆核酸酶去除得到的DNA中的rcDNA，得到待測DNA樣品；
[0014]制備cccDNA標準品，所述cccNDA標準品包括一個單位的HBV基因組DNA和一個重組位點attR ；
[0015]采用實時熒光定量PCR檢測cccDNA的方法，設計跨越rcDNA兩個缺刻的一對引物和一個熒光探針引物，以所述cccDNA標準品制備標準曲線，對所述待測DNA樣品進行cccDNA的定量檢測。
[0016]在一個實施方式中，還包括從待測物中提取DNA后測定環(huán)狀DNA的濃度的步驟。
[0017]在一個實施方式中，所述制備cccDNA標準品的步驟具體為:首先將一個單位的HBV基因組DNA連接到含有重組位點attB和attP的微環(huán)制備載體上，接著采用微環(huán)DNA制備技術，attB和attP重新組合后形成attR，從而制備出HBV微環(huán)DNA，該HBV微環(huán)DNA即為所述cccDNA標準品。
[0018]在一個實施方式中，所述跨越rcDNA兩個缺刻的一對引物和一個熒光探針引物具體為:
[0019]上游引物:如SEQ ID N0.1所示的DNA序列，
[0020]下游引物:如SEQ ID N0.2所示的DNA序列，
[0021]熒光探針引物:FAM-如SEQ ID N0.3所示的DNA序列-TAMRA。
[0022]一種定量檢測乙肝病毒cccDNA的試劑盒，包括:
[0023]質粒提取試劑盒，用于從待測物中提取DNA ；
[0024]綠豆核酸酶，用于降解rcDNA ；
[0025]cccDNA標準品,所述cccNDA標準品包括一個單位的HBV基因組DNA和一個重組位點attR ；以及
[0026]跨越rcDNA兩個缺刻的一對引物和一個熒光探針引物。[0027]在一個實施方式中，所述備cccDNA標準品通過如下步驟制備:首先將一個單位的HBV基因組DNA連接到含有重組位點attB和attP的微環(huán)制備載體上，接著采用微環(huán)DNA制備技術，attB和attP重新組合后形成attR，從而制備出HBV微環(huán)DNA，該HBV微環(huán)DNA即為所述cccDNA標準品。
[0028]在一個實施方式中，所述跨越rcDNA兩個缺刻的一對引物和一個熒光探針引物具體為:
[0029]上游引物:如SEQ ID N0.1所示的DNA序列，
[0030]下游引物:如SEQ ID N0.2所示的DNA序列，
[0031]熒光探針引物:FAM-如SEQ ID N0.3所示的DNA序列-TAMRA。
[0032]這種定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法能夠解決上述實時熒光定量PCR法檢測cccDNA假陽性的問題，以綠豆核酸酶清除rcDNA干擾的同時，制備HBV微環(huán)DNA作為cccDNA標準品，以PCR技術結合熒光標記探針雜交法對乙型肝炎病毒cccDNA進行定量檢測，相對于傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR檢測cccDNA，定量精確。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為實時熒光定量PCR檢測cccDNA的PCR示意圖；
[0034]圖2為采用微環(huán)DNA制備技術制備cccDNA標準品的示意圖；
[0035]圖3為一實施方 式的定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0036]如圖1所示，傳統(tǒng)的采用實時熒光定量PCR檢測cccDNA由一對跨rcDNA雙缺口的特殊引物和一個熒光探針實現(xiàn)。正義引物Pi與負鏈互補結合，位于正鏈缺口上游，反義引物P2與正鏈互補結合，位于負鏈缺口下游，rcDNA因為存在缺口而不被擴增，cccDNA則能被選擇性的擴增。在cccDNA負鏈缺口下游加入一個與負鏈互補的熒光探針，可實現(xiàn)熒光定量PCR對cccDNA的定量分析。
[0037]然而，上述實時熒光定量PCR檢測cccDNA的方法存在如下缺點:1、在PCR檢測cccDNA時，由于rcDNA的存在，起始模板量不能過高，否則引物Pl與P2對rcDNA的PCR產物自身退火(selfannealing)造成非特異擴增，cccDNA假陽性出現(xiàn),假陽性再通過突光放大使得cccDNA的定量嚴重偏離實際。2、由于cccDNA陽性標準品獲得困難，多為PCR擴增得到的cccDNA線性雙鏈片段，其構象、鏈間作用力等理化特征與天然的cccDNA相差甚遠，從而對熒光定量PCR過程和結果造成影響，使得cccDNA的定量不能精確。
[0038]為了能夠定量檢測乙肝病毒cccDNA,需要提供cccDNA標準品。
[0039]提供一種cccDNA標準品，包括一個單位的HBV基因組DNA和一個重組位點attR。
[0040]該cccDNA標準品通過如下方法制備得到。
[0041 ] 首先將一個單位的HBV基因組DNA連接到含有重組位點attB和attP的微環(huán)制備載體ZY781上，接著采用微環(huán)DNA制備技術(Mark A Kay，Cheng-Yi He&Zh1-YingChen.2010)，如圖2所示，attB和attP重新組合后形成attR，從而制備出HBV微環(huán)DNA。該HBV微環(huán)DNA即為本步驟制備的cccDNA標準品。
[0042]該HBV微環(huán)DNA與乙肝cccDNA相比，僅僅多了一個35堿基的重組位點attR同時HBV的復制單元被敲除，其理化性質相當于天然cccDNA。
[0043]該HBV微環(huán)DNA首次作為cccDNA的標準品使用，不同于以往其它技術。是保證cccDNA精確定量的關鍵。
[0044] 制備得到的cccDNA標準品可以轉化入能生產重組酶及內切酶的工程菌ZYCY10P3S2T表達擴增。
[0045]此外，還提供一種定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法，如圖3所示，包括如下步驟。
[0046]S10、從待測物中提取DNA，接著采用綠豆核酸酶去除提取得到的DNA中的rcDNA，得到待測DNA樣品。
[0047]一般選擇質粒提取試劑盒(OMEGA E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit)提取血液或組織中的DNA，其中包括乙肝病毒的rcDNA、cccDNA以及其它DNA。
[0048]其具體操作過程參照OMEGA E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit操作說明書。
[0049]提取完成后測定DNA的濃度，rcDNA、cccDNA為環(huán)狀，相當于質粒DNA，任何能測定質粒DNA濃度的儀器或方法都能測定提取的cccDNA。
[0050]綠豆核酸酶編號為EC 3.1.30.1，是一種單鏈特異的DNA和RNA內切酶，降解DNA和RNA分子:V和Y端的單鏈突出產生可用于連接平端的DNA或RNA片段。
[0051]由于rcDNA單鏈缺刻的存在，rcDNA能被綠豆核酸酶降解突出末端，從而防止熒光定量PCR中由rcDNA擴增出的片段自身退火造成cccDNA假陽性。
[0052]而cccDNA中的兩條DNA鏈均是完整的，二者共價互補，形成超螺旋結構。因此，cccDNA不會被綠豆核酸酶降解。
[0053]S20、制備 cccDNA 標準品。
[0054]首先將來自陳志英、何成宜實驗室的一個單位的HBV基因組DNA連接到含有重組位點attB和attP的微環(huán)制備載體ZY781上，該載體來源于微環(huán)DNA技術發(fā)明人陳志英、何成宜，接著采用微環(huán) DNA 制備技術(Mark A Kay, Cheng-YiHe&Zh1-Ying Chen.2010)，如圖 2所示，attB和attP重新組合后形成attR，從而制備出HBV微環(huán)DNA。該HBV微環(huán)DNA即為本步驟制備的cccDNA標準品。
[0055]該HBV微環(huán)DNA與乙肝cccDNA相比，多了一個35堿基的重組位點attR，同時HBV 的復制單兀 DRl 和 DR2 (Michael Nassal.(2008).“Hepatitis B viruses: Reversetranscription a different way.Virus Research 134:235-249)被敲除，該 HBV 微環(huán)DNA不能復制，沒有傳染性，其理化性質相當于天然cccDNA。
[0056]該HBV微環(huán)DNA首次作為cccDNA的標準品使用，不同于以往其它技術。是保證cccDNA精確定量的關鍵。
[0057]制備得到的cccDNA標準品可以轉化入能生產重組酶及內切酶的工程菌ZYCY10P3S2T表達擴增，該菌株來源于微環(huán)DNA技術發(fā)明人陳志英、何成宜。
[0058]S30、cccDNA 的定量檢測。
[0059]采用He等建立了實時熒光定量PCR檢測cccDNA的方法(He ML,ffu J，Chen Y，LinMC, Lau GK, Kung HF.(2002) “A new and sensitive method for thequantification ofHBV cccDNA by real-time PCR.Biochem Biophys.” Res Commun295:1102-1107)
[0060]設計跨越rcDNA兩個缺刻的一對引物和一個熒光探針引物。
[0061]上游弓丨物:5’-GCCCAAGGTCTTACATAA-3’(SEQ ID N0.1),下游弓丨物:5’-CCAAATTCTTTATAAGGGT-3’ (SEQ ID N0.2)，熒光探針引物:5’-FAM-CATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTC (SEQ ID N0.3)-TAMRA-3’ (FAM:羧基熒光素，TAMRA:羧基四甲基羅丹明)。
[0062]以寶生物(TAKARA)的SYBR?Premix Ex TaqTM II 試劑對 SlO 得到的 DNA 樣品
進行精確定量。簡要步驟如下:
[0063]第一步:按說明書組份配制PCR反應液(反應液配制請在冰上進行)。
[0064]第二步:進行Real Time PCR 反應。
[0065]第三步:實驗結果分析。反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR定量時制作標準曲線等。
[0066]每次定量時以精確定量的S20得到的cccDNA標準品制備標準曲線。標準品的濃度分別為:
[0067]5copies/ml 102copies/ml 103copies/ml 104copies/ml
[0068]105copies/ml 106copies/ml 107copies/ml 108copies/ml。
[0069]以每個濃度相應的熒光值計算標準曲線，對cccDNA定量的分辨率及精確度大大提聞。 [0070]這種定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法能夠解決上述實時熒光定量PCR法檢測cccDNA假陽性和精確定量困難兩大難題，以綠豆核酸酶清除rcDNA干擾的同時，制備HBV微環(huán)DNA作為cccDNA定量標準品，以PCR技術結合熒光標記探針雜交法對乙型肝炎病毒cccDNA進行定量檢測，對科研和臨床檢測具有輔助作用。
[0071]此外，還提供一種定量檢測乙肝病毒cccDNA的試劑盒。
[0072]上述定量檢測乙肝病毒cccDNA的試劑盒包括:質粒提取試劑盒、綠豆核酸酶、cccDNA標準品以及跨越rcDNA兩個缺刻的一對引物和一個熒光探針引物。
[0073]質粒提取試劑盒用于從待檢測血液或組織中提取DNA。
[0074]綠豆核酸酶用于降解rcDNA。
[0075]cccDNA標準品用于繪制標準曲線，其制備方法如下:
[0076]首先將一個單位的HBV基因組DNA連接到含有重組位點attB和attP的微環(huán)制備載體ZY781上，接著采用微環(huán)DNA制備技術(Mark A Kay，Cheng-Yi He&Zh1-YingChen.2010)，如圖2所示，attB和attP重新組合后形成attR，從而制備出HBV微環(huán)DNA。該HBV微環(huán)DNA即為本步驟制備的cccDNA標準品。
[0077]該HBV微環(huán)DNA與乙肝cccDNA相比，僅僅多了一個35堿基的重組位點attR同時HBV的復制單元被敲除，其理化性質相當于天然cccDNA。
[0078]該HBV微環(huán)DNA首次作為cccDNA的標準品使用，不同于以往其它技術。是保證cccDNA精確定量的關鍵。
[0079]制備得到的cccDNA標準品可以轉化入能生產重組酶及內切酶的工程菌ZYCY10P3S2T表達擴增。
[0080]跨越rcDNA兩個缺刻的一對引物和一個熒光探針引物可以根據He等建立了實時熒光定量 PCR 檢測 cccDNA 的方法(Mark A Kay，Cheng-Yi He&Zh1-YingChen.(2010)." Arobust system for production of minicircle DNA vectors.^NatureBiotechnology28(12):1287-1289 )設計。
[0081]具體的，可以采用如下序列。[0082]上游弓丨物:5’-GCCCAAGGTCTTACATAA-3’(SEQ ID N0.1),下游弓丨物:5’-CCAAATTCTTTATAAGGGT-3’ (SEQ ID N0.2)，熒光探針引物:5’-FAM-CATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTC (SEQ ID N0.3)-TAMRA-3’。
[0083]采用該定量檢測乙肝病毒cccDNA的試劑盒檢測乙肝病毒的方法基本與本發(fā)明提供的定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法相同，在此不再重復。
[0084]以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的一種或幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明 專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【權利要求】
1.一種cccDNA標準品，其特征在于,所述cccNDA標準品包括一個單位的HBV基因組DNA和一個重組位點attR。
2.—種cccDNA標準品的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 首先將一個單位的HBV基因組DNA連 接到含有重組位點attB和attP的微環(huán)制備載體上，接著采用微環(huán)DNA制備技術，attB和attP重新組合后形成attR，從而制備出HBV微環(huán)DNA,該HBV微環(huán)DNA即為所述cccDNA標準品。
3.如權利要求2所述的cccDNA標準品的制備方法，其特征在于，所述微環(huán)制備載體為微環(huán)制備載體ZY781。
4.一種定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法，其特征在于，包括如下步驟: 從待測物中提取DNA，并采用綠豆核酸酶去除得到的DNA中的rcDNA，得到待測DNA樣品; 制備cccDNA標準品,所述cccNDA標準品包括一個單位的HBV基因組DNA和一個重組位點attR ； 采用實時熒光定量PCR檢測cccDNA的方法，設計跨越rcDNA兩個缺刻的一對引物和一個突光探針引物，以所述cccDNA標準品制備標準曲線,對所述待測DNA樣品進行cccDNA的定量檢測。
5.如權利要求4所述的定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法，其特征在于，還包括從待測物中提取DNA后測定環(huán)狀DNA的濃度的步驟。
6.如權利要求4所述的定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法，其特征在于，所述制備cccDNA標準品的步驟具體為:首先將一個單位的HBV基因組DNA連接到含有重組位點attB和attP的微環(huán)制備載體上，接著采用微環(huán)DNA制備技術，attB和attP重新組合后形成attR,從而制備出HBV微環(huán)DNA，該HBV微環(huán)DNA即為所述cccDNA標準品。
7.如權利要求4所述的定量檢測乙肝病毒cccDNA的方法，其特征在于，所述跨越rcDNA兩個缺刻的一對引物和一個熒光探針引物具體為: 上游引物:如SEQ ID N0.1所示的DNA序列， 下游引物:如SEQ ID N0.2所示的DNA序列， 熒光探針引物:FAM-如SEQ ID N0.3所示的DNA序列-TAMRA。
8.一種定量檢測乙肝病毒cccDNA的試劑盒，其特征在于，包括: 質粒提取試劑盒，用于從待測物中提取DNA ； 綠豆核酸酶，用于降解rcDNA ； cccDNA標準品，所述cccNDA標準品包括一個單位的HBV基因組DNA和一個重組位點attR ；以及 跨越rcDNA兩個缺刻的一對引物和一個熒光探針引物。
9.如權利要求8所述的定量檢測乙肝病毒cccDNA的試劑盒，其特征在于，所述備cccDNA標準品通過如下步驟制備:首先將一個單位的HBV基因組DNA連接到含有重組位點attB和attP的微環(huán)制備載體上,接著采用微環(huán)DNA制備技術，attB和attP重新組合后形成attR，從而制備出HBV微環(huán)DNA，該HBV微環(huán)DNA即為所述cccDNA標準品。
10.如權利要求8所述的定量檢測乙肝病毒cccDNA的試劑盒，其特征在于，所述跨越rcDNA兩個缺刻的一對引物和一個熒光探針引物具體為:上游引物:如SEQ ID N0.1所示的DNA序列，下游引物:如SEQ ID N0.2所示的DNA序列，熒光探針引物:F AM-如SEQ ID N0.3所示的DNA序列-TAMRA。
【文檔編號】C12N15/11GK103898100SQ201210576370
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月26日 優(yōu)先權日:2012年12月26日
【發(fā)明者】陳志英, 何成宜, 王天燕 申請人:深圳先進技術研究院