茄子甘露糖焦磷酸化酶SmGMP蛋白及其編碼基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及茄子抗壞血酸合成途徑中的關(guān)鍵酶及其編碼基因，具體涉及一種茄子 甘露糖焦磷酸化酶SmGMP蛋白及其編碼基因，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗壞血酸是植物體內(nèi)最重要的抗氧化物質(zhì)之一，它可以直接清除植物在逆境或正 常代謝中產(chǎn)生的活性氧。其次，抗壞血酸能夠維持另一種重要的抗氧化劑維生素 E處于還 原狀態(tài)，并通過(guò)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)間接清除H2O2，從而保護(hù)植物免于氧化脅迫的傷 害。
[0003] 目前為止，植物中抗壞血酸的生物合成被認(rèn)為有4種途徑，其中受公眾認(rèn)可的是 L-半乳糖途徑。GMP (GDP-D-mannose pyrophosphorylase)，又稱為 VTC1，是 L-半乳糖途徑 的第一個(gè)酶，它催化甘露糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為GDP-D-甘露糖。對(duì)擬南芥抗壞血酸缺失突變體 vtcl的研宄表明，該突變體與野生型相比，GMP活性下降，在該突變體中轉(zhuǎn)入GMP基因能夠 使突變體抗壞血酸的含量恢復(fù)到野生型。在馬鈴薯中利用反義抑制技術(shù)降低GMP的酶活， 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯移栽大田后葉脈和莖上出現(xiàn)深色斑點(diǎn)。在抗壞血酸含量降低最多的系中，植 株地上部分在3個(gè)月后就枯萎死亡，而野生型馬鈴薯未出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。
[0004] 目前已從很多植物中克隆得到GMP基因，如擬南芥、大豆、獼猴桃、番茄等。茄子是 重要的蔬菜作物，但其因?yàn)槿鄙倩蚪M相關(guān)信息，導(dǎo)致相關(guān)研宄比較滯后。目前，未有任何 與茄子GMP基因及其編碼蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于填補(bǔ)茄子GMP蛋白及其編碼基因的空白。本發(fā)明提供了一種茄 子GMP的cDNA以及氨基酸序列；進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了茄子SmGMP基因在不同組織器官 及低溫下的表達(dá)模式。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供一種具有茄子甘露糖焦磷酸化酶（GMP)活性的蛋白質(zhì)，所 述蛋白質(zhì)包括：
[0008] (a)由如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或
[0009] (b)在（a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有茄 子甘露糖焦磷酸化酶（GMP)活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)；
[0010] 該蛋白質(zhì)在茄子不同器官內(nèi)的有無(wú)及活性大小存在較大差異。
[0011] 優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1~50個(gè)氨基酸的缺 失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20個(gè)以內(nèi)氨基酸而得到的序列。
[0012] 優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列中1~10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相 似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
[0013] 第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼所述具有茄子甘露糖焦磷酸化酶（GMP)活性的 蛋白質(zhì)的基因的核酸序列，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 優(yōu)選的，所述基因的核酸序列包括：
[0015] (a)如SEQ ID NO. 1第1~1086位所示的堿基序列；或
[0016] (b)與SEQ ID NO. 1第1~1086位所示的堿基序列具有至少70%的同源性的堿 基序列；或
[0017] (c)能與SEQ ID NO. 1第1~1086位所示的堿基序列進(jìn)行雜交的堿基序列。
[0018] 優(yōu)選的，所述核酸序列包括SEQ ID NO. 1第1~1086位所示的核酸序列中1~90 個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在Y和/或:V端添加60個(gè)以內(nèi)核苷酸形成的堿 基序列。
[0019] 第三方面，本發(fā)明提供一對(duì)用于擴(kuò)增所述基因的核酸序列的CDNA的引物對(duì)，所述 引物對(duì)的序列如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5所示。
[0020] 第四方面，本發(fā)明還提供一種所述基因的核酸序列的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包括SEQ ID NO. 3所示的堿基序列。
[0021] 在本發(fā)明中，"分離的DNA"、"純化的DNA"是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位 于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開， 而且已經(jīng)與在細(xì)胞中相伴隨的蛋白質(zhì)分開。
[0022] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"SmGMP蛋白編碼序列"指編碼具有茄子SmGMP蛋白活性的多肽 的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示的第1~1086位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序 列是指，位于SEQ ID NO. 1所示的第1~1086位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相 同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO. 1 所示的第1~1086位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的同源性至少70%的 核苷酸序列。
[0023] 該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的茄子SmGMP相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1所 示序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：通常為1~90個(gè)核苷酸的缺失、 插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個(gè)以內(nèi)核苷酸。
[0024] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"SmGMP蛋白"指具有茄子SmGMP蛋白活性的SEQ ID NO. 2所示 序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與茄子SmGMP蛋白相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的變異 形式。這些變異形式包括（但并不限于）：通常為1~50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取 代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或?yàn)?0個(gè)以內(nèi)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能 相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括茄子SmGMP蛋白 的活性片段和活性衍生物。
[0025] 本發(fā)明的茄子SmGMP蛋白的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異 體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與茄子SmGMP相關(guān)DNA雜交的DNA 所編碼的蛋白、以及利用茄子SmGMP蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0026] 在本發(fā)明中，"茄子SmGMP保守性變異多肽"指與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列 相比，有至多10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異 多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
[0027] 表1
[0030] 本發(fā)明還包括茄子SmGMP蛋白或多肽的類似物。這些類似物與茄子SmGMP相關(guān)多 肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼
[0028]
[0029] 而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如 通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的 技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基（如D-氨基酸）的類似物，以及具 有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ-氨基酸）的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并 不限于上述列舉的代表性的多肽。
[0031] 修飾（通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu)）形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙 酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn) 行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶（如哺乳動(dòng) 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪 氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu) 化了溶解性能的多肽。
[0032] 在本發(fā)明中，可用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分析茄子SmGMP基因產(chǎn)物的表達(dá)模式， 即分析茄子SmGMP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
[0033] 此外，根據(jù)本發(fā)明的茄子SmGMP核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或 表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選茄子SmGMP相關(guān)同源基因或同源蛋白。
[0034] 為了得到與茄子SmGMP相關(guān)基因的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選茄子cDNA文庫(kù)，這 些探針是在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，用32P對(duì)茄子SmGMP相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。 適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來(lái)自茄子的文庫(kù)。構(gòu)建來(lái)自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù) 的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買到，例如購(gòu) 自Clontech, Stratagene, Palo Alto, Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與前子SmGMP相關(guān)的基 因家族的核苷酸序列。
[0035] 本發(fā)明的茄子SmGMP相關(guān)核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組 法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其 是開放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法 所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次 PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0036] 當(dāng)獲得了有關(guān)序列后，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其 克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0037] 此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0038] 除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò)直接合成肽 而加以生產(chǎn)（Stewart 等人，（1969)固相多肽合成，WH Freeman Co.，San Francisco; Merrifield J. (1963) J. Am Chem. Soc 85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自 動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀（Foster City，CA)來(lái)自動(dòng) 合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的 分子。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0040] 圖1為本發(fā)明的茄子GMP基因與番茄GMP基因 mRNA的同源比較（GAP)結(jié)果；
[0041] 圖2為本發(fā)明的茄子GMP蛋白與番茄GMP蛋白的氨基酸序列同源比較（FASTA)結(jié) 果；其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出；
[0042] 圖3為本發(fā)明的茄子GMP基因在不同組織的表達(dá)情況；
[0043] 圖4為本發(fā)明的前子GMP基因在低溫下不同處理時(shí)間的表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通