出芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白及其重組載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及出芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，還涉及含有出 芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的重組載體和出芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚蘋果酸（Polymalic acid，PMA)是一種新型的可完全生物降解的聚醋型聚合物， 由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性，可作為藥物載體與微膠囊材料、生物 醫(yī)學(xué)材料、吸水材料、化妝品、食品包裝等材料，具有廣泛的應(yīng)用前景。此外，聚蘋果酸的單 體為L-蘋果酸，是一種優(yōu)良的食品酸味劑和C4平臺化合物，市場年需求在10萬噸以上。
[0003] 聚蘋果酸主要由出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans)合成并分泌到胞外， 對聚蘋果酸的生物合成途徑研宄表明，聚蘋果酸可能由TCA循環(huán)產(chǎn)生的蘋果酸為底物進行 合成，然而蘋果酸如何從線粒體轉(zhuǎn)運及參與合成的聚蘋果酸如何從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到胞外，尚未 報道。聚蘋果酸聚合物的轉(zhuǎn)運過程不同于單體羧酸的轉(zhuǎn)運，可能存在一些功能獨特的轉(zhuǎn)運 蛋白參與。但是目前并無有關(guān)出芽短梗霉菌轉(zhuǎn)運蛋白的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供出芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白；本發(fā)明的目 的之二在于提供含有出芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的重組載體；本發(fā)明的目的之三 在于提供含有重組載體的轉(zhuǎn)化子；本發(fā)明的目的之四在于提供出芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白 在提高出芽短梗霉聚蘋果酸產(chǎn)量中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之五在于提供重組載體在提高出 芽短梗霉聚蘋果酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0005] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 1、出芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，所述出芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 或 SEQ ID NO. 10 所示。
[0007] 優(yōu)選的，所述出芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因組序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
[0008] 2、含有所述出芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的重組載體。
[0009] 優(yōu)選的，所述重組載體為在pBARGPEl質(zhì)粒的EcoRV和XhoI酶切位點之間連入SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示序列而得。
[0010] 3、含有所述重組載體的轉(zhuǎn)化子，優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)化子為出芽短梗霉；更優(yōu)選的，出 芽短梗霉為CCTCC M2012223菌株。
[0011] 4、所述出芽短梗霉二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白在提高出芽短梗霉聚蘋果酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0012] 5、所述的重組載體在提高出芽短梗霉聚蘋果酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明首次從真核生物出芽短梗霉克隆了 5個涉及聚 蘋果酸有關(guān)的二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因組序列，利用二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的編碼序列，構(gòu)建過表 達(dá)二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化出芽短梗霉后可提高聚蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)量 10-30%，同時發(fā)酵液中未檢測到游離的蘋果酸，表明過量表達(dá)的二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白基因與聚 蘋果酸的合成轉(zhuǎn)運有關(guān)；由于聚蘋果酸可進一步酸水解制備L-蘋果酸，因此本發(fā)明過表達(dá) 二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，也可有效提高L-蘋果酸的發(fā)酵產(chǎn)量。
【附圖說明】
[0014] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0015] 圖1為pBARGPEl質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0016] 圖2為原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化OE: :g6666轉(zhuǎn)化子基因組中草銨磷抗性基因 bar檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0017] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0018] 本發(fā)明通過對公開號為102827778A的中國專利公開的高產(chǎn)聚蘋果酸出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans)菌株CCTCC M2012223的全基因組測序分析，結(jié)合生物信息學(xué) 相關(guān)知識預(yù)測獲得5個可能與聚蘋果酸合成轉(zhuǎn)運有關(guān)的二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的編碼序列， 基因序號分別為gl688，g4644，g6666，g5215和g6113，其基因組序列分別如SEQIDN(λl~ 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6~10所示。
[0019] 然后設(shè)計引物從出芽短梗霉中成功克隆得到5個二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因全長，并 通過構(gòu)建過表達(dá)載體，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子，搖瓶和發(fā)酵罐發(fā)酵試驗表明可有效提高 聚蘋果酸和蘋果酸的發(fā)酵產(chǎn)量。
[0020] 實施例1、克隆二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白基因
[0021] 根據(jù)二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的編碼序列，設(shè)計克隆gl688, g4644, g6666, g5215和 g6113的引物，為了便于構(gòu)建重組載體，在上游引物的5'端設(shè)計EcoRV酶切位點，在下游引 物的5'端設(shè)計XhoI酶切位點，具體的引物如表1所示。
[0022] 表1、克隆二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的引物 [00231

[0024] 然后分別以 gl688_up_EcoRV 與 gl688_down_XhoI，g4644_up_EcoRV 與 g4644_ down_XhoI， g6666_up_EcoRV 與 g6666_down_XhoI， g5215_up_EcoRV 與 g5215_down_XhoI， g6113_up_EcoRI與g6113_down_XhoI為引物對，出芽短梗霉基因組DNA為模板進行PCR擴 增，PCR擴增的退火溫度為50-65°C，延伸時間為Imin 45s。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電 泳，結(jié)果顯示獲得了與預(yù)期大小相同的條帶。
[0025] 實施例2、出芽短梗霉過表達(dá)gl688提高聚蘋果酸產(chǎn)量
[0026] -、質(zhì)粒構(gòu)建
[0027] 將實施例1克隆的gl688基因用EcoR V和Xho I進行酶切，回收gl688基因酶切 片段，同時用EcoR V和Xho I酶切pBARGPEl質(zhì)粒（圖1)，回收載體骨架。然后將回收的 gl688基因酶切片段與pBARGPEl質(zhì)粒的載體骨架連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩 選獲得過表達(dá)gl688基因的重組表達(dá)載體pBARGPEl-gl644(簡稱為0Ε: :gl688)。
[0028] 二、0E::gl688轉(zhuǎn)化出芽短梗霉
[0029] 將0E: :gl688制成原生質(zhì)體，然后轉(zhuǎn)化出芽短梗霉，轉(zhuǎn)化后以8mg/mL草按磷為篩 選壓力經(jīng)兩次復(fù)篩得到OE: : gl688轉(zhuǎn)化子，連續(xù)傳5代后接種于含有8mg/mL草銨磷的平板 中，0E: :gl688轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出草銨磷抗性。以SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12為引物檢測 OE: : gl688轉(zhuǎn)化子的gl688基因，檢測結(jié)果呈陽性。然后提取轉(zhuǎn)化子基因組，進行PCR分析， PCR 分析的引物為：bar.S:5'-tctgcaccatcgtcaaccact_3'（SEQ ID N0.21)，bar.A:5'-ctg ccagaaacccacgtcat-3'（SEQ ID N0.22);退火溫度為59°C，延伸時間為35s。結(jié)果顯不，草 銨磷抗性基因 bar已經(jīng)整合進入宿主基因組，過表達(dá)轉(zhuǎn)化成功。
[0030] 三、0E: :gl688轉(zhuǎn)化子發(fā)酵
[0031] 將0E: : gl688轉(zhuǎn)化子接種于含葡萄糖90g/L、硫酸銨3g/L、KH2PO4O. 2g/L、 ZnSO4O. 15g/L、MgS040. 2g/L、CaC0330g/L 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度為 25°C下 220rpm，搖 瓶發(fā)酵96小時，取樣分析生物量；同時以出芽短梗霉CCTCC M2012223在相同條件下發(fā)酵， 作為對照。結(jié)果顯示，0E: :gl644轉(zhuǎn)化子生物量為23. 4±0. 6g/L，出芽短梗霉的生物量為 22. 6±1. 3g/L，0E: :gl644轉(zhuǎn)化子聚蘋果酸產(chǎn)量為48. 6g/L，比對照株提高了 17. 4%，并且 在發(fā)酵上清液中未檢測到游離的蘋果酸。
[0032] 然后用5L發(fā)酵罐進行放大試驗，結(jié)果表明，0E::gl644轉(zhuǎn)化子發(fā)酵60小時，聚蘋 果酸產(chǎn)量為46. 8g/L，比對照組提高了 27. 2%。
[0033] 實施例3、出芽短梗霉過表達(dá)g6666提高聚蘋果酸產(chǎn)量
[0034] -、質(zhì)粒構(gòu)建
[0035] 將實施例1克隆的g6666基因用EcoR V和Xho I進行酶切，回收g6666基因酶切 片段，同時用EcoR V和Xho I酶切pBARGPEl質(zhì)粒（圖1)，回收載體骨架。然后將回收的 g6666基因酶切片段與pBARGPEl質(zhì)粒的載體骨架連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩 選獲得過表達(dá)g6666基因的重組表達(dá)載體pBARGPEl-g6666(簡稱為OE: :g6666)。
[0036] 二、0E: :g6666轉(zhuǎn)化出芽短梗霉
[0037] 將0E: :g6666制成原生質(zhì)體，然后轉(zhuǎn)化出芽短梗霉，轉(zhuǎn)化后以8mg/mL天草按磷為 篩選壓力經(jīng)兩次復(fù)篩得到0E: : g6666轉(zhuǎn)化子，連續(xù)傳5代后接種于含有8mg/mL草銨磷的平 板中，0E: :g6666轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出草銨磷抗性。以SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16為引物檢 測OE: : g6666轉(zhuǎn)化子的g6666基因，檢測結(jié)果呈陽性。然后提取轉(zhuǎn)化子基因組，進行PCR分 析，PCR分析的引物及擴增條件與實施例2相同，分析結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，草銨磷 抗性基因 bar已經(jīng)整合進入宿主基因組，過表達(dá)轉(zhuǎn)化成功。
[0038] 三、OE: : g6666轉(zhuǎn)化子發(fā)酵
[0039] 將0E: : g6666轉(zhuǎn)化子接種于含葡萄糖90g/L、硫酸銨3g/L、KH2PO4O. 2g/L、 ZnSO4O. 15g/L、MgS040. 2g/L、CaC0330g/L 中發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度為 25°