免疫抑制劑雷帕霉素在提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產(chǎn)量中的應(yīng)用及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及免疫抑制劑雷帕霉素在提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產(chǎn)量中的應(yīng)用，還涉及利用免疫抑制劑雷帕霉素提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]出芽短梗霉(Aureobasidum pulIulan)是一類酵母真菌，具有菌絲體和酵母樣兩種形態(tài)。該菌種在自然界中存在較為廣泛。通常出芽短梗霉發(fā)酵過(guò)程會(huì)同時(shí)產(chǎn)生聚蘋果酸和普魯蘭多糖兩個(gè)大分子代謝產(chǎn)物。聚蘋果酸和普魯蘭多糖的合成共同的前體有葡萄糖-1-磷酸，如碳代謝流進(jìn)入TCA循環(huán)或者乙酸循環(huán)積累蘋果酸，將最終聚合生成聚蘋果酸；而碳代謝流經(jīng)葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化UDPG-葡萄糖，將最終合成普魯蘭多糖。
[0003]現(xiàn)有的專利報(bào)道希望能同時(shí)生產(chǎn)兩種高分子聚合物，如喬長(zhǎng)晟等一種出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法(專利授權(quán)號(hào)ZL201110430053.3)，但是由于兩種聚合物的具有不同的物理性質(zhì)和產(chǎn)品附加值，同時(shí)生產(chǎn)兩種高分子聚合物，會(huì)對(duì)下游提取純化造成困難。因此，從生產(chǎn)實(shí)踐上，更希望獲得單一目標(biāo)的聚合物產(chǎn)品。現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道了0.1%,0.5%和I %的吐溫-80能夠提高出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭多糖的能力；但是未見(jiàn)其他物質(zhì)提高普魯蘭多糖的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有聚蘋果酸和普魯蘭多糖發(fā)酵生產(chǎn)工藝技術(shù)的不足，經(jīng)過(guò)大量研宄發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉生長(zhǎng)受氮源調(diào)節(jié)，且在氮限制條件下有利于聚蘋果酸和普魯蘭多糖合成。通常微生物適應(yīng)外界營(yíng)養(yǎng)環(huán)境完成的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄、翻譯和后翻譯修飾等過(guò)程，主要依賴于營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)，其中雷帕霉素革El蛋白(Target of rapamycin,TOR)信號(hào)途徑被認(rèn)為是感應(yīng)氮信號(hào)的重要途徑，TOR信號(hào)通路在真核生物感受外界營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和逆境脅迫、調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)中起重要作用，通過(guò)響應(yīng)外界氮及氨基酸、滲透壓、熱、氧化應(yīng)激、以及碳饑餓等信號(hào)，調(diào)節(jié)翻譯、轉(zhuǎn)錄、核糖體生物合成、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)以及自噬作用調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。雷帕霉素是雷帕霉素靶蛋白(TOR)的特異性抑制劑，本發(fā)明采用雷帕霉素靶蛋白(TOR)特異性抑制劑雷帕霉素，通過(guò)抑制TOR途徑靶蛋白的活性，調(diào)節(jié)代謝流向普魯蘭多糖合成方向進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)對(duì)出芽短梗霉合成的聚蘋果酸和普魯蘭多糖合成的代謝流轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)高效合成普魯蘭多糖。本發(fā)明使用的產(chǎn)聚蘋果酸菌種為Aureobasidiumpullulans CCTCC M 2012223，或者來(lái)源于美國(guó)農(nóng)業(yè)部菌種保藏中心(NRRL)，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)等機(jī)構(gòu)保藏或自然分離的Aureobasidium 屬菌種。
[0005]優(yōu)選的，所述雷帕霉素的濃度為5?80mg/L ;更優(yōu)選的，所述雷帕霉素的濃度為10 ?70mg/Lo
[0006]本發(fā)明還公開(kāi)了利用免疫抑制劑雷帕霉素提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，將出芽短梗霉活化后在含5?80mg/L雷帕霉素的條件下發(fā)酵。
[0007]優(yōu)選的，所述發(fā)酵是在溫度為23-30°C、轉(zhuǎn)速為180-300rpm條件下培養(yǎng)96-150小時(shí)；
[0008]或在溫度為23-30 °C、轉(zhuǎn)速為300-1000rpm、通氣比1:0.8-1:1.6條件下培養(yǎng)72-200 小時(shí)。
[0009]更優(yōu)選的，所述發(fā)酵是在溫度為25°C、轉(zhuǎn)速為220rpm條件下培養(yǎng)96小時(shí)；
[0010]或在溫度為25°C、轉(zhuǎn)速為600rpm、通氣比1: 1.2條件下培養(yǎng)96小時(shí)。
[0011]優(yōu)選的，所述發(fā)酵使用的培養(yǎng)基各組分如下:糖50-200g/L，硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀或硝酸鈉 l_5g/L，KH2PO40.005-0.3g/L，ZnSO40.005-0.3g/L，MgSO40.005-0.3g/L，玉米漿0.05-3g/L 和 CaC0310-50g/L，溶劑為水。
[0012]更優(yōu)選的，所述出芽短梗霉活化的方法是將出芽短梗霉接種于種子培養(yǎng)基中，然后在溫度為23-30°C、轉(zhuǎn)速180-300rpm條件下培養(yǎng)36-96小時(shí)；所述種子培養(yǎng)基各組分如下:葡萄糖 40-100g/L、硝酸銨 l_5g/L、KH2PO40.005-0.3g/L、ZnSO40.005-0.3g/L、MgSO40.005-0.3g/L、玉米漿 0.05_3g/L 和 CaC0310_50g/L，溶劑為水。
[0013]更優(yōu)選的，所述出芽短梗霉活化的方法是將出芽短梗霉接種于種子培養(yǎng)基中，然后在溫度為25°C、轉(zhuǎn)速為220rpm條件下培養(yǎng)96小時(shí)；所述種子培養(yǎng)基為葡萄糖90g/L、硝酸鉀 3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、玉米漿 2g/L 和 CaC0320g/L，溶劑為水。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明根據(jù)出芽短梗霉合成聚蘋果酸和普魯蘭多糖的合成特點(diǎn)，采用雷帕霉素靶蛋白特異性抑制劑雷帕霉素，建立操作簡(jiǎn)單的定向調(diào)控策略，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)聚蘋果酸和普魯蘭多糖合成的碳代謝流流向調(diào)節(jié)，抑制聚蘋果酸的合成，轉(zhuǎn)向大幅度合成普魯蘭多糖。同時(shí)添加此范圍濃度的雷帕霉素對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞生長(zhǎng)不會(huì)造成抑制。本發(fā)明具有發(fā)酵成本低、產(chǎn)量高、技術(shù)經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于普魯蘭多糖的工業(yè)實(shí)際放大生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面將結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0016]本發(fā)明使用的種子培養(yǎng)基為:葡萄糖40_100g/L、硝酸銨l_5g/L、KH2PO40.005-0.3g/L、ZnSO40.005-0.3g/L ；MgS040.005-0.3g/L、玉米漿 0.05-0.3g/L 和CaC0310-50g/L ;種子培養(yǎng)條件是采用500mL搖瓶裝液量30_120mL，在溫度為23_30°C，搖床轉(zhuǎn)速為180-300rpm條件下培養(yǎng)時(shí)間為36-96小時(shí)。
[0017]本發(fā)明使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖、木糖或其他可利用糖50_200g/L、氮源為硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀或硝酸鈉 l_5g/L、KH2PO40.005-0.3g/L、ZnSO40.005-0.3g/L ；MgSO40.005-0.3g/L、玉米漿 0.05-3g/L、CaC0310_50g/L。發(fā)酵培養(yǎng)條件是采用 500mL 搖瓶裝液量30-120mL，培養(yǎng)溫度為23_30°C，搖床轉(zhuǎn)速為180_300rpm，培養(yǎng)時(shí)間為96-150小時(shí)；5L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝為裝液量3L，培養(yǎng)溫度23-30°C，轉(zhuǎn)速300-1000rpm，通氣比1: 0.8-1:1.6,培養(yǎng)時(shí)間為60-200小時(shí)。
[0018]實(shí)施例1
[0019]取保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2012223 的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接種于含50mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中(搖瓶體積為500mL)，在溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為220rpm條件下培養(yǎng)48小時(shí)；然后取培養(yǎng)液按接種量為10%接種于500mL搖瓶中，搖瓶含有50mL含10mg/L的雷帕霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，然后在溫度為25°C、轉(zhuǎn)速為220rpm條件下培養(yǎng)120小時(shí)；然后檢測(cè)培養(yǎng)液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結(jié)果顯示，本實(shí)施例聚蘋果酸的產(chǎn)量為48.0lg/L，普魯蘭多糖產(chǎn)量為38.6g/L，出芽短梗霉細(xì)胞量為19.5g/L。
[0020]同時(shí)按照與上述相同的方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基中未加入雷帕霉素，發(fā)酵結(jié)束檢測(cè)培養(yǎng)液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)比實(shí)施實(shí)驗(yàn)相比，聚蘋果酸產(chǎn)量比對(duì)照組降低了 28.7%;普魯蘭多糖產(chǎn)量比對(duì)照組提高了 69%，出芽短梗霉細(xì)胞量比對(duì)照組提高了 21.87%。
[0021]本實(shí)施例中種子培養(yǎng)基為:葡萄糖60g/L、硝酸銨3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.lg/L、MgSO40.15g/L、玉米漿 2g/L 和 CaC0320g/L，溶劑為水。
[0022]發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖90g/L、硫酸銨 3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、3 玉米漿 lg/L 和 CaC030g/L，溶劑為水。
[0023]實(shí)施例2
[0024]取保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2012223 的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接種于含50mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中(搖瓶體積為500mL)，在溫度為23°C，轉(zhuǎn)速為300rpm條件下培養(yǎng)96小時(shí)；然后取培養(yǎng)液按接種量為10%接種于500mL搖瓶中，搖瓶含有50mL含20mg/L的雷帕霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，然后在溫度為23°C、轉(zhuǎn)速為300rpm條件下培養(yǎng)150小時(shí)；然后檢測(cè)培養(yǎng)液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結(jié)果顯示，本實(shí)施例聚蘋果酸的產(chǎn)量為47.9g/L，普魯蘭多糖產(chǎn)量為39.8g/L，出芽短梗霉細(xì)胞量為21g/L。
[0025]同時(shí)按照與上述相同的方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基中未加入雷帕霉素，發(fā)酵結(jié)束檢測(cè)培養(yǎng)液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)比實(shí)施實(shí)驗(yàn)相比，聚蘋果酸產(chǎn)量比對(duì)照組降低了 28.9%;普魯蘭多糖產(chǎn)量比對(duì)照組提高了 74.2%，出芽短梗霉細(xì)胞量比對(duì)照組提高了 31.3%。
[0026]本實(shí)施例中種子培養(yǎng)基為:葡萄糖40g/L、硝酸銨lg/L、KH2PO40.3g/L、ZnSO40.3g/L、MgSO40.3g/L、玉米漿 3g/L 和 CaC0350g/L，溶劑為水。
[0027]發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖50g/L、硫酸銨 lg/L, KH2PO40.3g/L、ZnSO40.3g/L、MgSO40.3g/L、玉米漿 3g/L 和 CaC