專利名稱：瘧疾重組抗原、IgY抗體及瘧疾檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的瘧疾重組抗原。具體而言，本發(fā)明涉及一種新的瘧疾抗原，通過該抗原免疫雞獲得的IgY抗體，以及含有該IgY抗體的檢測(cè)瘧疾感染的試劑盒。
背景技術(shù)：
瘧疾位居全球最嚴(yán)重的三大傳染病之一，威脅近40億居住在熱帶及亞熱帶地區(qū) 人口的健康。其中惡性瘧疾每年感染3-5億人，奪去數(shù)百萬(wàn)人的生命。瘧疾也因此嚴(yán)重阻礙 了發(fā)展中國(guó)家的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)。由于瘧疾治療藥物的特殊性，精確快速的診斷不僅能及時(shí)發(fā)現(xiàn) 并治療瘧疾患者，大大降低病死率，也能通過早期排除瘧疾，及時(shí)挽救感染了其它傳染性疾 病患者的生命。與此同時(shí)，精確快速的早期診斷也是對(duì)瘧疾進(jìn)行實(shí)時(shí)流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和控制 的必要手段。目前診斷瘧疾的經(jīng)典方法仍為血涂片顯微鏡檢法，該方法對(duì)檢驗(yàn)者的技能和 經(jīng)驗(yàn)要求很高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足非洲和南美洲國(guó)家中絕大多數(shù)生活在偏遠(yuǎn)地區(qū)患者的需要， 造成大量患者因延誤診治而死亡。此外，用于瘧疾早期診斷瘧疾抗原的方法為雙抗體夾心 法和PCR方法。其中，基于單克隆抗體的雙抗體夾心法近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注，它們主 要應(yīng)用三類單克隆抗體1，抗HRP-II抗體；2，抗pLDH抗體；3，抗Aldolase抗體。迄今為止， 現(xiàn)有的該類方法存在的主要問題是1)敏感性低由于單克隆抗體只能識(shí)別單個(gè)表位和抗 原，因此敏感性低于血涂片顯微鏡檢法在82 % -95. 2 %之間，最低的僅有57 %，尤其當(dāng)蟲 血率低于0.01%時(shí)，敏感性明顯下降至50% ；2)特異性低由于受到流行區(qū)蟲株間差異和 變異的影響，仍不夠理想一般在93%左右，最低的僅有76. 9% ；3)交叉反應(yīng)單克隆抗體 的使用易與類風(fēng)濕因子、異嗜性抗體、抗核抗體有交叉反應(yīng)；檢測(cè)的假陽(yáng)性率較高；4)半衰 期短大多數(shù)商品化的快速檢測(cè)試劑盒要求在2-30°C存放，但真正在疫區(qū)使用時(shí)這一條件 難以保證；理想的試劑盒應(yīng)能在40-50°C高溫下保存兩年；5)成本高尤其是單克隆抗體的 研發(fā)和生產(chǎn)成本很難再大幅度降低，這對(duì)于瘧疾泛濫的發(fā)展中國(guó)家人民仍然難以接受。因 此，建立一套穩(wěn)定、敏感和廉價(jià)的診斷方法成為全球瘧疾防治亟待解決的重要問題。雞卵黃抗體——IgY被越來(lái)越多的應(yīng)用在疾病診斷、預(yù)防、治療，食品科學(xué)和獸醫(yī) 科學(xué)等領(lǐng)域，被認(rèn)為是除哺乳動(dòng)物外產(chǎn)生多克隆抗體最佳抗體來(lái)源。由于禽類與哺乳動(dòng)物遠(yuǎn)源，因此不僅可針對(duì)許多哺乳動(dòng)物中高度保守的抗原產(chǎn)生 免疫反應(yīng)，而且能針對(duì)更多的表位產(chǎn)生抗體?，F(xiàn)有技術(shù)披露IgY抗體也不與類風(fēng)濕因子和其它IgG分子反應(yīng)，避免了免疫分析 中的假陽(yáng)性結(jié)果并且降低實(shí)驗(yàn)背景。IgY抗體對(duì)酸、堿、熱、蛋白酶的耐受性很高，適合瘧疾 疫區(qū)的環(huán)境特點(diǎn)。經(jīng)收集雞蛋生產(chǎn)IgY的方法既方便又快捷，并且目前已建立了高效、經(jīng)濟(jì)、可自動(dòng) 化控制的IgY純化技術(shù)，適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。這些優(yōu)點(diǎn)均可成為提高檢測(cè)靈敏性、降低成 本、解決上述瘧疾診斷問題的關(guān)鍵因素。現(xiàn)有技術(shù)中未有在瘧疾免疫診斷中使用IgY的報(bào)道，尤其是使用本發(fā)明的抗原獲 得的特異性IgY抗體在瘧疾免疫診斷中應(yīng)用未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從已證實(shí)的惡性瘧疾特異性表位結(jié)合瘧疾基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)在線分析和軟 件預(yù)測(cè)出來(lái)自五個(gè)瘧疾主要抗原的9個(gè)表位，將其連接，從而設(shè)計(jì)出一種新的人工重組抗 原。采用該重組抗原免疫產(chǎn)蛋雞，從免疫雞卵中提取得到能夠識(shí)別瘧原蟲多個(gè)靶向位點(diǎn)的 特異性IgY抗體。再將此抗體標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)，最終建立雙抗體夾心檢測(cè)瘧疾的 方法。本發(fā)明一方面提供一種瘧疾重組抗原，其具有SEQ ID No 11所示的氨基酸序列。本發(fā)明另一方面提供一種編碼SEQ ID No :11所示的氨基酸序列的多核苷酸。由 于密碼子的簡(jiǎn)并性，所述多核苷酸可具有多種堿基序列。例如，為了在宿主細(xì)胞中(如大腸 桿菌E. coli)表達(dá)，可使用該宿主偏好的密碼子以提高表達(dá)效率。優(yōu)選地，該多核苷酸具有 SEQ ID No 10所示的堿基序列。本發(fā)明又一方面提供一種通過本發(fā)明的抗原免疫雞獲得的特異性IgY抗體。本發(fā)明又一方面提供本發(fā)明特異性IgY抗體在制備檢測(cè)瘧疾的制劑中的用途。由 于本發(fā)明特異性IgY可有效識(shí)別瘧原蟲，因此可用于制備各種檢測(cè)瘧疾的試劑。本發(fā)明又一方面提供含本發(fā)明特異性IgY抗體的試劑盒，優(yōu)選地，該試劑盒使用 ELISA法。該試劑盒可包括本發(fā)明特異性IgY抗體包被的酶聯(lián)反應(yīng)板、辣根過氧化物酶標(biāo)記 的IgY抗體和顯色系統(tǒng)。所述試劑盒可通過本領(lǐng)域公知的方法制備，也可包括現(xiàn)有技術(shù)中 其他可有效提高ELISA試劑盒靈敏度和特異性的輔助成分。本發(fā)明又一方面提供一種制備本發(fā)明特異性IgY抗體的方法，所述的方法包括1)使用本發(fā)明設(shè)計(jì)的抗原免疫雞；2)收取步驟1)中免疫后的雞所產(chǎn)的卵，并從卵黃中提取獲得IgY抗體。產(chǎn)蛋雞通過少量的本發(fā)明抗原免疫3周后，即可持續(xù)不斷的產(chǎn)生高特異性的、性 質(zhì)均一的抗體。優(yōu)選地，可對(duì)上述步驟2)中獲得的IgY抗體進(jìn)一步純化。利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的重組抗原和其特異性IgY抗體的結(jié)合，增加了瘧疾診斷中的靶 向位點(diǎn)，這一點(diǎn)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)單克隆抗體單一識(shí)別的靈敏性。此外，由于IgY抗體本身具有 的特點(diǎn)，避免了傳統(tǒng)方法的交叉反應(yīng)，同時(shí)大幅度降低了應(yīng)用成本。本發(fā)明還能為其它突發(fā) 性重大感染性疾病的快速診斷提供新的研發(fā)思路，取得顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。術(shù)語(yǔ)說明除非另有說明，本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域公知的含義?？乖侵敢环N能刺激人或動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。抗原的基本能力是免疫原性和反應(yīng)原性。最常見的 抗原分子是大分子蛋白質(zhì)。表位免疫細(xì)胞通常難以識(shí)別整個(gè)抗原分子，而僅識(shí)別抗原大分子上的一個(gè)特定 的部分。稱為表位(印itope)或抗原決定簇(antigenic determinant)。因而表位代表 了抗原分子上的一個(gè)免疫活性區(qū)，負(fù)責(zé)與免疫細(xì)胞表面的抗原受體或游離的抗體分子相結(jié) 合。嚴(yán)格說來(lái)，抗體的特異性是針對(duì)表位而不是針對(duì)完整的抗原分子?？贵w抗體是免疫系統(tǒng)用來(lái)鑒別和抑制外源物質(zhì)(例如細(xì)菌和病毒)的一種蛋白 質(zhì)復(fù)合體。每種抗體只識(shí)別特定的目標(biāo)抗原。
IgY抗體IgY普遍存在于鳥類、爬行動(dòng)物和兩棲類，在功能上等價(jià)于哺乳動(dòng)物IgG，但其許多生物學(xué)性質(zhì)仍未被發(fā)現(xiàn)。近來(lái)許多研究者分析了 IgY的基因組成和生物學(xué)功 能，而且證實(shí)其為哺乳動(dòng)物IgG和IgE的直接起源?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明IgY的用途是非常廣泛、 多樣的。其中最重要的功能是由母體傳遞IgY給新生兒提供被動(dòng)地免疫保護(hù)力。產(chǎn)生IgY 的動(dòng)物基本是卵生的，通過卵黃把IgY傳遞給胚胎和新生動(dòng)物。


圖1 重組抗原12%還原性SDS-PAGE圖譜；M 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1 誘導(dǎo)前菌體； 2 誘導(dǎo)后菌體；3 純化后的重組抗原。圖2 純化后IgY抗體12%還原性SDS-PAGE圖譜；M 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1和2 不同的IgY抗體純化洗脫峰。圖3 萊航雞卵中IgY抗體的動(dòng)力曲線。圖4 純化的IgY抗體對(duì)單個(gè)表位、混合表位和重組抗原的識(shí)別。圖5 純化的IgY抗體識(shí)別重組抗原的免疫印跡圖譜；M 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1 免 疫前IgY抗體不能識(shí)別重組蛋白；2 免疫后IgY抗體能明顯識(shí)別重組蛋白。圖6 純化的IgY抗體對(duì)天然瘧原蟲的免疫熒光圖譜；圖6A 免疫前IgY抗體不能 識(shí)別天然瘧原蟲蟲體；圖6B 免疫后IgY抗體能明顯識(shí)別天然瘧原蟲蟲體。圖7 雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)全血中惡性瘧原蟲。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 惡性瘧重組抗原的制備從已證實(shí)的惡性瘧疾特異性表位結(jié)合瘧疾基因組數(shù)據(jù)庫(kù)分析，最終選擇出包括來(lái) 自RESA、MSA1、CSP、MSA1、MAg-I五個(gè)主要抗原的9個(gè)表位，其序列分別為SEQ ID Nos :1_9， 本發(fā)明設(shè)計(jì)的抗原的表位連接順序?yàn)?-6-9-8-6-7-7-3-9-6-4-9-1-5-6-2 (數(shù)字為相應(yīng)的 序列編號(hào))。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性設(shè)計(jì)編碼相應(yīng)表位的多核苷酸序列，按照本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的引物重疊方法，在表位編碼序列的前后端分別引入BamH I和Bcl II內(nèi)切 酶位點(diǎn)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，把擴(kuò)增后的序列按順序串聯(lián)成為重組抗原的編碼序列(加上起始密 碼子ATG，其多核苷酸序列為SEQ ID No :10，共有1068個(gè)堿基)，并連接至pET30(a)載體 多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL2KDE3)菌株。也可以使用本領(lǐng)域公知的其他方法 合成上述多核苷酸序列SEQ ID No :10并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。使用IPTG誘導(dǎo)上述菌株，其可在 E. coli BL21(DE3)中大量可溶表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到18%。經(jīng)鎳親和柱和分子篩純化得到重組 抗原，SDS-PAGE電泳分析其純度在95%以上，結(jié)果見圖1。該人工重組抗原具有354個(gè)氨 基酸(其序列為SEQ ID No :11)，預(yù)測(cè)分子量為39. 19kD。實(shí)施例2 抗惡性瘧疾(Plasmodium falciparum)重組抗原IgY的制備(1)抗原免疫萊航雞取200 μ 1實(shí)施例1獲得的抗原(0. 5mg/ml)與等體積福氏佐劑充分混合，免疫來(lái) 航雞(Leghorn)(購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院)。第0周采用福氏完全佐劑初次免疫，雞 頸部皮下多點(diǎn)注射；分別在第3、5、11周采用福氏不完全佐劑在腿部和翅部肌肉進(jìn)行多點(diǎn) 加強(qiáng)免疫。每日收取雞卵，標(biāo)記后4°C保存?zhèn)溆谩?br> (2) IgY 粗純化取步驟(1)中獲得的新鮮的萊航雞蛋洗凈后浸于0. 新潔爾滅溶液中消毒，再 用75%酒精棉擦拭雞蛋外殼。去蛋殼后用卵黃分離器盡量去除蛋白，消毒針刺破卵膜，收集 卵黃液，用卵黃稀釋液0.06M NaAcH5.0按1 9稀釋，攪拌均 勻。然后邊攪拌邊加入終濃度 5%的辛酸，室溫放置20min，8，000g/min室溫高速離心20min，用定性濾紙過濾除去沉淀， 獲得去脂的卵黃水溶提取物。再加入飽和硫酸銨溶液至終濃度40%的，室溫放置20min， 12，000g/min室溫高速離心20min，收集上清。(3)純化總IgY抗體本步驟及下一步驟均采用AKTA FPLC層析系統(tǒng)(GE Healthcare公司)進(jìn)行 處理，首先以Phenyl FF疏水層析柱吸附步驟(2)中獲得的樣品，選用的結(jié)合緩沖液為 0. 8M(NH4)2S04,25mM Tris · Cl pH 8. 5,50mM NaCl，洗脫緩沖液為 25mM Tris · Cl pH 8. 5， 50mM NaCl，流速為lml/min，線性梯度洗脫，分管收集蛋白洗脫峰。SDS-PAGE電泳鑒定后， 收集純度高的洗脫樣品經(jīng)30kD超濾管(Millipore公司)濃縮(5，OOOr/minX30min)。用 2 倍柱體積的 PBS 分別預(yù)平衡 HiPr印 16/60S印hacryl S-100HR 和 HiLoad 16/60Superdex 30prep grade (GEHealthcare公司)，上樣品量為2ml，流速為lml/min，再用2倍柱體積的 0. 2M磷酸鹽緩沖液洗脫IgY抗體，分管收集蛋白洗脫峰，12 % SDS-PAGE鑒定IgY純度為 98. 5%以上，每卵產(chǎn)量大于30mg，結(jié)果見圖2。 (4)純化抗多表位抗原特異性IgY抗體取IOmg步驟(3)中獲得的多表位抗原，溶于偶聯(lián)緩沖液中(0. IMNaHCO3O. 5M NaCl)，與準(zhǔn)備好的CNBr-activated SepharoseTM 4B基質(zhì)混合在一個(gè)可封口的管中。室溫 顛倒混勻Ih或4°C過夜。用5倍體積的偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的基質(zhì)。封閉未偶聯(lián)的活性基團(tuán)。將偶聯(lián)過 的基質(zhì)放入 0. IM Tris-HCl buffer, pH 8. O 或者 IM 乙醇胺(ethanolamine)，pH 8. 0，放置 2h。用PH 4.0和PH 8. O的緩沖液洗偶聯(lián)過的基質(zhì)三個(gè)循環(huán)，每種緩沖液用5倍柱床的體 積。把偶聯(lián)好的基質(zhì)以恒定壓力裝柱，0.2M磷酸鹽緩沖液平衡后，備用。0.2M磷酸鹽緩沖 液稀釋粗純化的IgY抗體，以lml/min恒定流速上樣，用親和柱平衡液平衡10倍體積，改用 親和柱洗脫液洗脫，收集脫峰，SDS-PAGE電泳鑒定。實(shí)施例3 IgY抗體的活性鑒定(1)免疫萊航雞卵中IgY抗體的滴度測(cè)定應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定免疫產(chǎn)蛋雞的抗體水平，用包被液稀釋重 組抗原，以0. Iug/孔加入ELISA板，4°C包被過夜。倒掉包被液用PBST洗5次，然后用吸 水紙吸干；用含3% BSA的PBS封閉板子，每孔200ul，37°C孵育1小時(shí)后同前洗滌；2倍梯 度稀釋待測(cè)IgY抗體，每孔加入抗體稀釋液100ul，37°C孵育2小時(shí)后同前洗滌；每孔加入 IOOul II抗HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG以1 10000稀釋(購(gòu)于Promega公司，G1351)，37°C 孵育2小時(shí)后同前洗滌；然后每孔加IOOul顯色液，室溫顯色15分鐘后，每孔加50ul IM硫 酸!^04終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀測(cè)定0D450nm ；以免疫前的IgY抗體為陰性對(duì)照，按照陰性對(duì)照空 0D450nm士3SD為臨界值，判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顯示外周血中抗體的滴度在初次免疫后卵黃抗體 的滴度在第五周達(dá)到最高(稀釋度為1 1.6xl06)，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體的3倍?？?體水平維持6周后下降到一半，此時(shí)再加強(qiáng)免疫一次后，卵黃中的抗體在兩周后即可回復(fù)到原來(lái)的最高滴度，并能夠維持8周以上，結(jié)果見圖3。同時(shí)以9種單表位分別包被后，應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定顯示，免疫后萊航雞 得到的IgY能夠有效識(shí)別每一種單個(gè)表位，結(jié)果見圖4。(2)純化后IgY抗體的免疫學(xué)功能測(cè)定以重組抗原包被應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定(具體實(shí)驗(yàn)方法同上)顯示純化后的 特異性IgY抗體較粗純化的IgY抗體識(shí)別力明顯提高，且在0. 002ug/ml時(shí)仍能夠明顯識(shí)別 重組抗原，結(jié)果見圖5。同時(shí)，用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)了純化的IgY抗體能夠有效識(shí)別培養(yǎng)的惡性瘧原 蟲。具體實(shí)施時(shí)，首先將蟲株培養(yǎng)物均勻涂于載玻片上，放入100%丙酮中固定5分鐘后取 出風(fēng)干；用PBS倍比稀釋待測(cè)IgY抗體，小心加在血涂片上，37°C濕盒內(nèi)孵育30分鐘；吸干 I抗后，PBS洗三遍，每次10分鐘；再加入FITC標(biāo)記的羊抗雞IgG(l 200)，37°C濕盒內(nèi)孵 育30分鐘后同上洗滌，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。純化的IgY抗體能夠明顯識(shí)別惡性瘧原蟲 (Plasmodium falciparum)天然蟲體的多個(gè)位點(diǎn)，且效價(jià)能夠達(dá)到1 1，600，而對(duì)天然紅 細(xì)胞無(wú)交叉反應(yīng)，結(jié)果見圖6。實(shí)施例4 檢測(cè)用試劑盒的制備(1)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記IgY抗體6mg HRP (RZ > 3. 0)溶于1. 5ml去離子水，攪拌下緩慢加入0. 3ml新鮮配制的0. IM 高碘酸鈉NaIO4,室溫下攪拌40分鐘。將HRP反應(yīng)液在0. OOlM醋酸鈉溶液中4°C透析20小 時(shí)。同時(shí)，取上述純化的總IgY抗體12mg，在0. OlM碳酸鈉中透析3小時(shí)。將HRP轉(zhuǎn)移至小 瓶中，攪拌下加入300微升0. 2M碳酸鈉溶液(pH9. 5)，立刻加入抗體，用0. 2M碳酸鈉溶液 (pH9. 5)調(diào)pH至9. 5。室溫下攪拌3小時(shí)，加150微升新鮮配制的硼氫化鈉溶液，4°C放置 2小時(shí)，在PBS里透析過夜后，加終濃度為0. 01%的柳硫汞4°C保存?zhèn)溆谩?2)酶聯(lián)反應(yīng)板的制備上述純化的特異性IgY抗體用包被液(1. 36g Na2C03/7. 35g NaHC03/H20 1000ml, PH 9. 2)稀釋后以 2ug/ 孔的量包被板子，每孔加 lOOul， 37°C孵育2小時(shí)；用磷酸鹽緩沖液洗三次，控干；每孔加入150ul的3%牛血清白蛋白，37°C 封閉2小時(shí)，用0. IM磷酸鹽緩沖液洗三次，37°C干燥，密封保存?zhèn)溆谩?3)酶結(jié)合底物上述辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgY抗體，加入抗體保護(hù)劑(0. 01 % 的硫柳汞和的牛血清白蛋白)和0. IM磷酸鹽緩沖液。(4)顯色系統(tǒng)由A液和B液組成，使用時(shí)等體積混合，其中A 液6. 2g 檸檬酸，25g Na2HPO4-12H20, H2O 500ml, 0. 03%過氧化氫；B 液1. 05g 檸檬酸，0. 093g EDTA, H2O 480ml，140mg TMB, 二甲基亞砜 20ml。實(shí)施例5 檢測(cè)全血中惡性瘧原蟲按照上述的方法包被純化的特異性IgY抗體，包被濃度為2ug/ml。同時(shí)收集人全血瘧原蟲培養(yǎng)物，血涂片法計(jì)數(shù)瘧原蟲感染率，用新鮮的正常人全血調(diào)整感染率為1 %、 0. 1%,0. 01%,0. 001%和0. 0001%，再用含有0. 02% Triton X-100的磷酸鹽緩沖液裂解 樣品，然后把裂解后的樣品加入上述封閉好的ELISA板中，每孔lOOul，37°C孵育2小時(shí)。再 將HRP標(biāo)記的IgY抗1 2000稀釋后加入ELISA板，經(jīng)孵育、洗滌、顯色后讀取0D450nm并 判定結(jié)果。當(dāng)把體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲感染率用正常人全血稀釋到0. 0001%時(shí)，按照上述 IgY抗體配伍及濃度仍然能夠檢測(cè)到蟲體。這與現(xiàn)有技術(shù)中同類的快速檢測(cè)卡相比，靈敏度要高出1000倍，結(jié)果見圖7。序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>瘧疾重組抗原、IgY抗體及瘧疾檢測(cè)試劑盒<130>890040CG<160>11<170>PatentIn version 3. 4<210>1<211>8<212>PRT<213> 惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)<400>1Glu Glu Asn Val Glu His Asp Ala15<210>2<211>20<212>PRT<213> 惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)<400>2Leu Asp Asn lie Lys Asp Asn Val Gly Lys Met Glu Asp Tyr lie Lys151015Lys Asn Lys Lys20<210>3<211>15<212>PRT<213> 惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)<400>3Lys Lys lie Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val151015<210>4<211>19<212>PRT<213> 惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)<400>4Glu Asp Ser Gly Ser Asn Gly Lys Lys lie Thr Cys Glu Cys Thr Lys151015Pro Asp Ser
<210>5
<211>19<212>PRT<213>J^^. (Plasmodium falciparum)<400>5Asp Gly Asn Cys Glu Asp lie Pro lie lie Val Asn Glu Phe Ser Ala151015lie Asp Leu<210>6<211>18<212>PRT<213> 惡個(gè)生皰原蟲(Plasmodium falciparum)<400>6Gly Asn Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Met Asp Glu Pro Gln His Tyr Gly151015Lys Ser<210>7<211>19
<212>PRT<213> 惡個(gè)生皰原蟲(Plasmodium falciparum)<400>7Asp Gln Pro Lys Gln Tyr Glu Gln His Leu Thr Asp Tyr Glu Lys lie151015Lys Glu Gly<210>8<211>17<212>PRT<213> 惡個(gè)生皰原蟲(Plasmodium falciparum)<400>8Gly lie Ser Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Ala Lys Tyr Lys Asp Asp Leu151015Glu<210>9<211>10<212>PRT<213> 惡個(gè)生皰原蟲(Plasmodium falciparum)<400>9Gln Thr Asp Glu lie Lys Asn Asp AsnIle1510<210>10
<211>1068<212>DNA〈213〉人工序列<400>10 atggaattcg gatcacagac cgacgagatc aagaacgacc acatccagac cgatgaaatt 60aaaaatgata atattggatc aggcaacgcc gagaagtacg acaagatgga cgagccgcag 120cactacggca agagcggatc acagaccgac gagatcaaga acgaccacat ccagaccgat 180gaaattaaaa atgataatat tggatcaggc atcagctact acgagaaggt gctggccaag 240tacaaggacg acctggaggg atcaggcaac gccgagaagt acgacaagat ggacgagccg 300cagcactacg gcaagagcgg atcagaccag ccgaagcagt acgagcagca cctgaccgac 360tacgagaaga tcaaggaggg cggatcagac cagccgaagc agtacgagca gcacctgacc 420gactacgaga agatcaagga gggcggatca aagaagatcg ccaagatgga gaaggccagc 480agcgtgttca acgtgggccc cggccccgga tcaaacaaga acgacaacaa gaacgacgga 540tcacagaccg acgagatcaa gaacgaccac atccagaccg atgaaattaa aaatgataat 600attggatcag gcaacgccga gaagtacgac aagatggacg agccgcagca ctacggcaag 660agcggatcaa acaagaacga caacaagaac gacggatcag aggacagcgg cagcaacggc 720aagaagatca cctgcgagtg caccaagccg gacagcggat cacagaccga cgagatcaag 780aacgaccaca tccagaccga tgaaattaaa aatgataata ttggatcaga ggagaacgtg 840gagcacgacg ccggatcaga cggcaactgc gaggacatcc cgcacgtgaa cgagttcagc 900gccatcgacc tgggatcagg caacgccgag aagtacgaca agatggacga gccgcagcac 960tacggcaaga gcggatcact ggacaacatc aaggacaacg tgggcaagat ggaggactac 1020atcaagaaga acaagaaggg ccccggcccc ggatccgcta gctaataa1068<210>11<211>354<212>PRT〈213〉人工序列<400>11Met Glu Phe Gly Ser Gln Thr Asp Glu lie Lys Asn Asp His lie Gln151015Thr Asp Glu lie Lys Asn Asp Asn lie Gly Ser Gly Asn Ala Glu Lys202530Tyr Asp Lys Met Asp Glu Pro Gln His Tyr Gly Lys Ser Gly Ser Gln354045Thr Asp Glu lie Lys Asn Asp His lie Gln Thr Asp Glu lie Lys Asn505560Asp Asn lie Gly Ser Gly lie Ser Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Ala Lys65707580Tyr Lys Asp Asp Leu Glu Gly Ser Gly Asn Ala Glu Lys Tyr Asp Lys859095
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權(quán)利要求
一種瘧疾重組抗原，其具有SEQ ID No11所示的氨基酸序列。
2.一種編碼如權(quán)利要求1所述抗原的多核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其具有SEQID No :10所示的堿基序列。
4.一種通過如權(quán)利要求1所述抗原免疫雞獲得的IgY抗體。
5.如權(quán)利要求4中所述的抗體在制備檢測(cè)瘧疾的制劑中的用途。
6.含有如權(quán)利要求4中所述的抗體的試劑盒。
7.一種制備如權(quán)利要求4所述抗體的方法，所述的方法包括1)使用如權(quán)利要求1所述抗原免疫雞；2)收取步驟1)中免疫后的雞所產(chǎn)的卵，并從卵黃中提取獲得IgY抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)步驟2)獲得的抗體的純化步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種瘧疾重組抗原、IgY抗體及瘧疾檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明設(shè)計(jì)出一種序列如SEQ ID No11所示的瘧疾抗原，通過該抗原免疫雞獲得IgY抗體，并制備含有該IgY抗體的檢測(cè)瘧疾感染的試劑盒。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)中同類的快速檢測(cè)卡相比，靈敏度高出1000倍。
文檔編號(hào)C07K16/20GK101838322SQ200910080270
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2009年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月18日
發(fā)明者王恒, 藺亞暉 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所