專利名稱：瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑。特別是，本發(fā)明涉及一種用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑。本發(fā)明還涉及一種用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM和/或IgG的瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑。另外，本發(fā)明還涉及一種用酵母菌或大腸桿菌制備瘧原蟲表面蛋白的方法。
每年有200萬人死于瘧疾。瘧疾在全世界廣泛傳播。然而，在一些地區(qū)，從20世紀(jì)60年代以來，由于采取有效控制，瘧疾已得到根除或減少。但近年來，由于抗藥菌株的增加，對(duì)殺蟲劑抗性的增加，非正常氣候，如厄爾尼諾性氣候等，瘧疾在全世界范圍內(nèi)又有所增加。
瘧疾可分為非洲型、美洲型和亞洲型。
每種類型的地理分布、種屬特性以及瘧原蟲表現(xiàn)的遺傳傾向均不同。
瘧疾的生活周期分為分裂生殖和孢子生殖。
在人類宿主中的生活周期是分裂生殖，在蚊蟲宿主中的生活周期是孢子生殖。人被感染的蚊蟲叮咬后，可被孢子感染。孢子通過人的血管轉(zhuǎn)移到肝臟，或以休眠狀態(tài)存在，或在肝細(xì)胞中繁殖發(fā)展為裂殖體。
一定時(shí)期后，裂殖體進(jìn)入血循環(huán)并全面繁殖。當(dāng)裂殖體成熟時(shí)，發(fā)生分裂并釋放出成千上萬裂殖子進(jìn)入血流中。裂殖子侵入紅細(xì)胞，大部分裂殖子進(jìn)入又一輪無性繁殖，再形成裂殖體。一些裂殖子變?yōu)榕渥幽讣?xì)胞。該配子母細(xì)胞隨人體血流循環(huán)。當(dāng)蚊蟲叮咬受感染的人時(shí)，同時(shí)吸取了血中的配子母細(xì)胞，然后，雄性配子母細(xì)胞和雌性配子母細(xì)胞在蚊子腹中融合，形成受精卵。作為卵母細(xì)胞在腹壁中生長的受精卵，逐漸成為感染性孢子體，進(jìn)入蚊子的唾液腺和胃。然后，此蚊子能感染另一個(gè)人類宿主。
藥物，如氯喹和首喹已用于治療瘧疾。然而，近來瘧原蟲對(duì)這些藥產(chǎn)生了抗性。因此，在瘧疾治療中，藥物抗性是個(gè)大難題。
在韓國，瘧疾稱為Hakjil。從上世紀(jì)60年代開始，做了很大努力根除此病，到70年代后，瘧疾發(fā)生已很少報(bào)道。
然而，自從1993年報(bào)道了在非軍事區(qū)(DMZ)附近一個(gè)被瘧原蟲感染的病例后，瘧疾開始迅速傳播，在1998年，被瘧原蟲感染的病人數(shù)量就達(dá)3,800人。
人類瘧疾可被以下四種之一寄生蟲引起瘧原蟲vivax，瘧原蟲falciparum，瘧原蟲malariae和瘧原蟲ovale。
其中，發(fā)生在韓國的瘧疾由瘧原蟲vivax引起(Choi.S.Y.，KoreanJ Parasit.，32(4)，281-284)。瘧原蟲vivax的特點(diǎn)是診斷較難，因其潛伏期長，且血中原蟲數(shù)目少。用進(jìn)口瘧疾診斷試劑檢測(cè)瘧疾抗原，如瘧疾乳酸鹽脫氫酶。然而進(jìn)口瘧疾診斷試劑診斷潛伏期長、血中原蟲數(shù)目少的韓國型瘧疾較困難，因?yàn)樵\斷試劑的敏感度僅有50％。
最常用的診斷瘧疾方法是血痕法。該方法是一種經(jīng)典方法，將被瘧原蟲感染的血細(xì)胞染色，然后用顯微鏡觀察被染色的樣品。然而，這種方法花費(fèi)較長時(shí)間，并且需要培訓(xùn)檢查人員學(xué)會(huì)判斷被瘧原蟲感染的血細(xì)胞。
近來可購到一種檢測(cè)瘧疾抗原的診斷試劑。但因此診斷試劑敏感性低，需與血痕法配合使用。另一種檢測(cè)瘧原蟲基因的方法是PCR方法，敏感性高但過程復(fù)雜。因此不能實(shí)際應(yīng)用，僅可用于實(shí)驗(yàn)室研究。此外，常規(guī)方法均難以診斷潛伏期長且血中原蟲數(shù)目少的韓國型瘧疾。
迄今有關(guān)瘧疾抗原本身表達(dá)的研究較少，而對(duì)開發(fā)通過超表達(dá)編碼抗原蛋白的基因獲得蛋白的方法的研究已經(jīng)很發(fā)達(dá)。大多數(shù)抗原在與蛋白，如血凝因子Xa(Ellinger et al.，Virol.180，81，1991)，葡萄球菌蛋白A((Marczinovits et al.，J.Biochem.，31，225，1993)及Bgalactosidase(β-半乳糖苷酶)融合后被表達(dá)。其結(jié)果使融合抗原量增加。
然而，當(dāng)它們作為診斷試劑時(shí)，因蛋白是融合配偶體，假陽性信號(hào)也增加了。雖然有人用切割融合蛋白來解決此問題 (Chang et al.，Biotechnology 3，985-990，1985；Ellinger et al.，Virology，180，811-813，1991)，但在進(jìn)一步減少假陽性信號(hào)方面沒有什么效果，且產(chǎn)量減少，制備成本增加，因?yàn)閺目乖谐ト诤系鞍椎那懈詈图兓椒ǚ浅?fù)雜。
另外，本發(fā)明開發(fā)了一種瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑，用瘧原蟲抗原特定檢測(cè)瘧疾患者血中瘧疾特異性IgM。在瘧疾抗體中，IgG可在出現(xiàn)瘧疾后維持幾年或幾十年。因此，長期以來，在瘧疾流行地區(qū)，檢測(cè)包括IgG的瘧疾抗體時(shí)，出現(xiàn)許多假陽性信號(hào)，引起混淆。在本發(fā)明的抗原夾層免疫檢測(cè)中，在正常未感染瘧疾人中，十多歲到三十多歲人的受試者，很少有發(fā)現(xiàn)瘧疾抗體陽性反應(yīng)出現(xiàn)，然而，在四十多歲或更大年齡人中，出現(xiàn)5％或更高瘧疾抗體陽性反應(yīng)。即在四十多歲或更大年齡人中發(fā)生相對(duì)較高IgG假陽性信號(hào)。這是因?yàn)樗氖鄽q人在60代年以前暴露于感染瘧疾蚊子的概率高。
同樣，在瘧疾流行地區(qū)，瘧疾特異性IgGs在完全恢復(fù)健康的瘧疾患者體內(nèi)存留，相對(duì)高的假陽性信號(hào)在瘧疾抗體試驗(yàn)中出現(xiàn)。因此，用抗瘧疾抗體試驗(yàn)診斷瘧疾的效果較差。所以在瘧疾流行地區(qū)或?qū)?0歲以上人診斷瘧疾，檢測(cè)IgM比檢測(cè)IgG的方法更為有效。IgM值在治療瘧疾后隨時(shí)間消失，而IgG甚至在瘧疾治療后仍存在。
根據(jù)本發(fā)明，用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的瘧疾免疫檢測(cè)比現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)特異性抗原的免疫檢測(cè)方法更靈敏，從而使早期診斷出瘧疾的病人成為可能。而且根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)瘧疾特異性IgM的瘧疾免疫檢測(cè)法，可以從已完全恢復(fù)健康的人中區(qū)別出瘧疾患者。
另一方面，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中獲得抗原蛋白的上述問題和為了開發(fā)能診斷韓國型瘧疾的免疫診斷方法和診斷試劑，本發(fā)明研究了一種制備方法，該方法從國內(nèi)患瘧疾人血中克隆瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白，優(yōu)選瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端，更優(yōu)選多肽PV200C，然后從酵母菌或大腸桿菌表達(dá)，并不切割純化。
本發(fā)明的制備方法可以通過酵母菌或大腸桿菌的瘧原蟲重組表面蛋白的表達(dá)，然后用一種簡(jiǎn)單方法分離純化大量生產(chǎn)對(duì)抗體高靈敏性及高純度的抗原。由此產(chǎn)生的抗原可通過檢測(cè)瘧疾抗原的抗體，成為判斷瘧疾患者的診斷試劑。
另外，如此產(chǎn)生的抗原可用作疫苗。
本發(fā)明的第一目的是提供一種瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑，用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體。本發(fā)明的第二目的是提供一種間接免疫測(cè)定方法，用抗人IgG抗體和/或抗人IgM抗體作為標(biāo)記的抗原結(jié)合物的抗原。本發(fā)明第三目的是提供一種抗原夾層免疫檢測(cè)方法，用部分或完整的瘧疾裂殖子表面蛋白作為標(biāo)記的抗原結(jié)合物的抗原。
本發(fā)明的第四目的是提供一種瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑，用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM。本發(fā)明的第五目的是提供一種瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑，用抗人IgM抗體檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM。
本發(fā)明的第六目的是提供一種制備方法，通過克隆瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白基因制備重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)移至酵母菌，然后將酵母菌轉(zhuǎn)化體表達(dá)的表面蛋白分離純化至高純度。本發(fā)明的第七目的是用上述方法提供一種大量生產(chǎn)診斷瘧原蟲vivax抗原的方法，用該方法制備的抗原敏感性高，特異性強(qiáng)，并具有明顯低的假陽性信號(hào)。
本發(fā)明的第八目的是提供一種制備方法，通過克隆瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白基因制備重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)移至大腸桿菌，然后將大腸桿菌轉(zhuǎn)化體表達(dá)的表面蛋白分離純化至高純度。本發(fā)明的第九目的是用上述方法提供一種大量生產(chǎn)診斷瘧原蟲vivax抗原的方法，用該方法制備的抗原敏感性高，特異性強(qiáng)，并具有明顯低的假陽性信號(hào)。
本發(fā)明提供了一種瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑，檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體，比現(xiàn)有技術(shù)免疫檢測(cè)特異性抗原更靈敏，可以檢測(cè)瘧疾攜帶者及瘧疾患者，用于診斷潛伏期長且血中原蟲數(shù)目少的韓國型瘧疾。
本發(fā)明還提供了一種瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑，檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM，使用該試劑檢測(cè)可將痊愈瘧疾患者與瘧疾患者區(qū)別出來。
本發(fā)明還提供了一種制備方法，可以比現(xiàn)有技術(shù)方法方便快速地生產(chǎn)高純度的瘧原蟲表面抗原。通過本發(fā)明的制備方法純化的瘧原蟲表面蛋白純度、敏感性及特異性高，并具有明顯低的假陽性信號(hào)，適用于瘧疾診斷試劑。
圖2是SDS-聚丙烯酰胺凝膠用Probond吸附樹脂純化表面抗原的電泳結(jié)果的照片。
泳道1是細(xì)胞培養(yǎng)物離心后的顆粒沉淀；泳道2是細(xì)胞培養(yǎng)物離心后濃縮的上清液；泳道3是用Probond柱純化的濃縮上清液。
圖3是瘧疾患者血清用蛋白印跡法進(jìn)行抗原性檢測(cè)結(jié)果的照片泳道4是濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)物；泳道5是純化的裂殖子表面蛋白。
圖4示出了大腸桿菌制成的瘧原蟲裂殖子表面蛋白C-端的表達(dá)PV200C多肽的表達(dá)載體pELK-MSP的制備方法圖5是在SDS-PAGE上用組氨酸親和樹脂純化的PV200C多肽電泳結(jié)果的照片。
M是尺寸標(biāo)記；泳道1是誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物；泳道2未誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物；泳道3是在柱上被純化的蛋白。
圖6是瘧疾患者的血清的PV200C多肽的蛋白印跡法的結(jié)果的照片。
M是尺寸標(biāo)記；泳道4是誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物；泳道5是純化的裂殖子表面蛋白。
圖7是根據(jù)瘧疾特異性的IgM捕捉酶免疫試驗(yàn)方法測(cè)定的216個(gè)瘧疾-陽性樣品和353個(gè)瘧疾-陰性樣品的診斷結(jié)果圖。
圖8是根據(jù)瘧疾特異性的IgM捕捉酶免疫試驗(yàn)和間接酶免疫試驗(yàn)方法測(cè)定的75個(gè)瘧疾-陽性樣品和92個(gè)瘧疾-陰性樣品的診斷結(jié)果圖。
圖9是根據(jù)瘧疾特異性的IgM捕捉酶免疫試驗(yàn)和抗原夾層酶免疫試驗(yàn)方法測(cè)定的不同年齡的129個(gè)瘧疾-陰性樣品的診斷結(jié)果圖。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳實(shí)施例為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾免疫測(cè)定方法，和一種檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾診斷試劑，包括有瘧原蟲抗原的瘧疾診斷試劑。
本發(fā)明還提供了一種用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的瘧疾免疫測(cè)定方法，及一種檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的瘧疾診斷試劑，包括有瘧原蟲抗原的瘧疾診斷試劑。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾免疫測(cè)定方法，該方法包括(a)將瘧原蟲表面抗原固定在一個(gè)固體支持體上；(b)傾入血清或血漿樣品，使瘧疾特異性抗體與固定在該固體支持體上的抗原結(jié)合；(c)加入抗原和標(biāo)記物組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，使該標(biāo)記抗原結(jié)合物與瘧疾特異性抗體結(jié)合；(d)用結(jié)合到瘧疾特異性抗體的標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物進(jìn)行分析。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種通過檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的瘧疾IgM捕捉免疫測(cè)定方法，該方法包括(i)將抗人IgM抗體固定在一個(gè)固體支持體上；(ii)傾入血清或血漿樣品，使瘧疾特異性IgM與固定在該固體支持體上的抗人IgM抗體結(jié)合；(iii)加入由標(biāo)記物和瘧原蟲抗原組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，使該標(biāo)記抗原結(jié)合物與瘧疾特異性IgM結(jié)合；(iv)用結(jié)合在瘧疾特異性IgM上的標(biāo)記的抗原結(jié)合物的標(biāo)記物進(jìn)行分析。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種通過檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾診斷試劑，該診斷試劑包括覆蓋有瘧原蟲表面抗原的固體支持體；由抗原和標(biāo)記物組成的標(biāo)記的抗原結(jié)合物；及含有一種著色固定劑的底物溶液。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的瘧疾診斷試劑，該試劑包括包括覆蓋有抗人IgM抗體的固體支持體；由標(biāo)記物和瘧原蟲抗原組成的標(biāo)記的抗原結(jié)合物；及含有一種著色固定劑的底物溶液。
本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，該載體包括瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白基因，酵母菌的α因子前導(dǎo)肽和組氨酸殘基。本發(fā)明提供了一種用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母菌轉(zhuǎn)化體pYLJ-MSP/S.cerevisiae INVSC1(保藏號(hào)KCTC 0937BP)。本發(fā)明提供了一種用酵母菌轉(zhuǎn)化體制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的方法。本發(fā)明提供了一種瘧疾診斷試劑，該試劑包括用上述制備方法生產(chǎn)的表面蛋白。
本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，該載體包括瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白基因，組氨酸標(biāo)記物和T7啟動(dòng)子。本發(fā)明提供了用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體pELK-MSP/BL21(保藏號(hào)KCTC(0936BP)。本發(fā)明提供了一種用大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的方法。本發(fā)明提供了一種瘧疾診斷試劑，該試劑包括用上述制備方法生產(chǎn)的表面蛋白。
本發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾免疫測(cè)定方法，和一種檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體，包括瘧原蟲抗原的瘧疾診斷試劑。本發(fā)明還提供了一種用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的瘧疾免疫測(cè)定方法，和一種檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM，包括瘧原蟲抗原的瘧疾診斷試劑。
優(yōu)選地，在本發(fā)明上述免疫測(cè)定方法和診斷試劑中，瘧原蟲抗原是重組抗原。
優(yōu)選地，在本發(fā)明上述免疫測(cè)定方法和診斷試劑中，瘧原蟲表面抗原可被用作瘧原蟲抗原。優(yōu)選的瘧原蟲表面抗原包括部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白，更優(yōu)選的包括瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端。上述瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端包括瘧原蟲Vivax亞種共同的氨基酸序列，特別是包括了含有108個(gè)氨基酸的多肽(以下指″PV200C″)，它顯示100％瘧原蟲Vivax亞種的同源性，如SEQ.ID NO1所示。優(yōu)選的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端例子包括在瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端的部分或完整的PV200C多肽。而且，優(yōu)選的PV200C多肽氨基酸序列包括如SEQ.ID NO1所示的氨基酸序列。
該P(yáng)V200C多肽可從重組轉(zhuǎn)化體大量表達(dá)。本發(fā)明制備了一種表達(dá)PV200C多肽的酵母菌轉(zhuǎn)化體和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并已于1999年12月18日保藏在Korean Collection for Type Cultures of Korea ResearchInstitute of Bioscience and Biotechnology(保藏號(hào)KCTC 0937BP，KCTC 0936BP)。
本發(fā)明提供了一種用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾免疫測(cè)定方法。優(yōu)選地，本發(fā)明上述檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的免疫測(cè)定可以是酶免疫測(cè)定法。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾免疫測(cè)定方法，該方法包括(a)將瘧原蟲表面抗原固定在一個(gè)固體支持體上；(b)傾入血清或血漿樣品，使瘧疾特異性抗體與固定在該固體支持體上的抗原結(jié)合；(c)加入由抗原和標(biāo)記物組成的標(biāo)記的抗原結(jié)合物，將該標(biāo)記抗原結(jié)合物與瘧疾特異性抗體結(jié)合；(d)用結(jié)合到瘧疾特異性抗體上的標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物進(jìn)行分析。
優(yōu)選地，在上述免疫測(cè)定方法中，本發(fā)明提供了一種間接瘧疾免疫測(cè)定方法，其中步驟(C)中標(biāo)記了抗原結(jié)合物的抗原是抗人IgG抗體和/或抗人IgM抗體。
優(yōu)選地，在上述免疫測(cè)定方法中，本發(fā)明提供了一種瘧疾的抗原夾層免疫檢測(cè)方法，其中步驟(C)中標(biāo)記了抗原結(jié)合物的抗原是瘧原蟲表面抗原。優(yōu)選的瘧原蟲表面抗原包括部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白，更優(yōu)選的包括瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白(C-端。
優(yōu)選的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端例子包括在瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端部分或完整的PV200C多肽。而且，優(yōu)選的PV200C多肽氨基酸序列包括如SEQ.ID NO1所示的氨基酸序列。
優(yōu)選地，作為瘧疾免疫測(cè)定方法，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的免疫測(cè)定方法，該方法包括(a′)表達(dá)從轉(zhuǎn)化體得到的瘧原蟲Vivax裂殖子表面抗原并純化；(a)將純化的表面抗原固定在一個(gè)固體支持體上；(b)傾入血清或血漿樣品，使瘧疾特異性抗體與固定在該固體支持體上的表面抗原結(jié)合；(c)加入由抗原和標(biāo)記物組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，將該標(biāo)記抗原結(jié)合物與瘧疾特異性抗體結(jié)合；(d)用結(jié)合在瘧疾特異性抗體上的標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物誘導(dǎo)顯色；(e)用96孔板讀出器測(cè)定吸光率。
上述優(yōu)選的固體支持體包括孔板的孔。上述優(yōu)選的方法還可進(jìn)一步包括在標(biāo)記抗原結(jié)合物與瘧疾特異性抗體結(jié)合步驟后洗滌固體支持體如孔板的步驟。用標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物分析的步驟包括，如，用結(jié)合到瘧疾特異性抗體上的標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物誘導(dǎo)顯色及96孔板讀出器測(cè)定吸光率的步驟。用標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物誘導(dǎo)顯色的步驟包括，如，加入一種由緩沖液和著色固定劑組成的底物溶液。
作為一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提供了一種瘧疾間接免疫測(cè)定方法，用覆蓋有瘧原蟲抗原，優(yōu)選瘧原蟲表面抗原的固體支持體檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體。上述免疫測(cè)定方法采用結(jié)合了標(biāo)記物的源自山羊的抗人IgG抗體和/或抗人IgM抗體，優(yōu)選辣根過氧化物酶(HRP)作為標(biāo)記抗原結(jié)合物。
在本發(fā)明瘧疾間接免疫測(cè)定方法的一個(gè)實(shí)施例中，患者血中瘧疾特異性抗體與固定在固體支持體上的瘧原蟲表面抗原結(jié)合，然后標(biāo)記了抗原結(jié)合物的HRP-抗人IgG抗體or HRP-抗人IgM抗體與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。
之后，所加入的底物溶液中的著色固定劑被標(biāo)記的抗原結(jié)合物的HRP分解，誘導(dǎo)顯色，然后用96孔板讀出器測(cè)定吸光率，以檢測(cè)瘧疾特異性抗體的存在以及抗體的量。在上述間接免疫測(cè)定方法中，可診斷瘧疾-陽性樣品(瘧疾患者血漿)和瘧疾-陰性樣品(正常人血漿)。結(jié)果表明，上述方法顯示出約90％敏感性及95.8％特異性。
作為另一實(shí)施例，本發(fā)明提供了一種抗原夾層免疫檢測(cè)瘧疾方法，用覆蓋有瘧原蟲抗原，優(yōu)選瘧原蟲表面抗原的固體支持體檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體。上述免疫測(cè)定方法用瘧原蟲表面抗原，優(yōu)選結(jié)合了標(biāo)記物的部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白，優(yōu)選辣根過氧化酶(HRP)作為標(biāo)記抗原結(jié)合物。
在本發(fā)明抗原夾層免疫檢測(cè)瘧疾實(shí)施例中，患者血中瘧疾特異性抗體與固定在固體支持體上的瘧原蟲表面抗原結(jié)合，然后標(biāo)記抗原結(jié)合物的瘧原蟲HRP表面抗原與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。之后，底物溶液中含有的著色固定劑被標(biāo)記的抗原結(jié)合物的HRP分解，誘導(dǎo)顯色，然后用96孔板讀出器測(cè)定吸光率，以檢測(cè)瘧疾特異性抗體的存在以及抗體的量。在上述抗原夾層免疫檢測(cè)方法中，診斷瘧疾-陽性樣品(瘧疾患者血漿)和瘧疾-陰性樣品(正常人血漿)。結(jié)果表明，上述方法顯示出約98.5％敏感性及99.6％特異性。
上述間接免疫測(cè)定方法用源自山羊抗人IgG抗體和/或抗人IgM抗體作為標(biāo)記抗原結(jié)合物的抗原，間接檢測(cè)患者血中瘧疾特異性抗體。同時(shí)，上述抗原夾層免疫檢測(cè)，用源自瘧原蟲表面抗原本身作為標(biāo)記了抗原結(jié)合物的抗原，可檢測(cè)所有患者血中瘧疾特異性抗體。
本發(fā)明免疫檢測(cè)瘧疾的方法提供了一種覆蓋有瘧原蟲抗原的固體支持體。當(dāng)可能為瘧疾患者的血樣傾入該支持體上時(shí)，血中瘧疾特異性抗體抗原專一地與固定在固體支持體上的抗原結(jié)合。加入標(biāo)記抗原結(jié)合物后，通過識(shí)別與固定在固體支持體上的抗原結(jié)合的瘧疾特異性抗體的Fc(fragment crystallization)區(qū)，標(biāo)記抗原結(jié)合物與瘧疾特異性抗體結(jié)合。然后，該標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物分解該底物溶液中的著色固定劑，產(chǎn)生顯色反應(yīng)。最后，通過用測(cè)量吸光率檢測(cè)血中抗體的存在和抗體量，本發(fā)明可用瘧疾免疫檢測(cè)方法診斷瘧疾的感染情況。
通過用標(biāo)記物-抗人IgG抗體和/或標(biāo)記物-抗人IgM抗體，本發(fā)明上述間接免疫測(cè)定方法檢測(cè)與固定在固體支持體上的抗原結(jié)合的瘧疾特異性抗體。用包括有瘧原蟲抗原的標(biāo)記抗原結(jié)合物，本發(fā)明上述抗原夾層免疫檢測(cè)方法還可檢測(cè)與固定在固體支持體上的抗原結(jié)合的瘧疾特異性抗體。在上兩種方法中，都采用了瘧疾患者和正常人血漿都進(jìn)行了瘧疾診斷。結(jié)果表明，兩種方法均顯示出高于90％的敏感性和特異性。
本發(fā)明提供了一種瘧疾診斷試劑，用以檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體，該試劑包括覆蓋有瘧原蟲表面抗原的固體支持劑；由抗原和標(biāo)記物組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物；及含有一種著色固定劑的底物溶液。
瘧原蟲表面抗原的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例包括部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白，優(yōu)選的實(shí)例包括瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端。瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例包括瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端部分或完整的PV200C多肽。并且，一個(gè)優(yōu)選的PV200C多肽氨基酸序列的實(shí)例包括SEQ.ID NO1所示的氨基酸序列。
優(yōu)選地，在上述診斷試劑中，本發(fā)明可用抗人IgG抗體和/或抗人IgM抗體，作為標(biāo)記了抗原結(jié)合物的抗原。
優(yōu)選地，在上述診斷試劑中，本發(fā)明可用瘧原蟲表面抗原作為標(biāo)記了抗原結(jié)合物的抗原。瘧原蟲表面抗原優(yōu)選的例子包括部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白，更優(yōu)選的例子包括瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端。瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端的優(yōu)選的例子包括在瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端部分或完整的PV200C多肽。并且，一個(gè)優(yōu)選的PV200C多肽氨基酸序列的實(shí)例包括SEQ.ID NO1所示的氨基酸序列。
優(yōu)選地，本發(fā)明可用一種酶，如辣根過氧化酶(HRP)和堿性磷酸酶，膠體金，熒光物質(zhì)，染色劑等作為該標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物。更優(yōu)選地，本發(fā)明可用辣根過氧化酶(HRP)作為該標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物。
在本發(fā)明上述診斷試劑中，標(biāo)記抗原結(jié)合物通過將瘧疾特異性抗體結(jié)合到瘧疾特異抗體改變不大的Fc(fragment crystallization)區(qū)來檢測(cè)瘧疾特異性抗體的存在。
作為優(yōu)選的標(biāo)記抗原結(jié)合物，本發(fā)明提供了HRP-抗人IgG抗體和/或HRP-抗人IgM抗體，其中抗人IgG抗體和/或HRP-抗人IgM抗體源自山羊。作為優(yōu)選的標(biāo)記抗原結(jié)合物，本發(fā)明也提供了HRP表面抗原結(jié)合物。其中該表面抗原是部分或完整的瘧原蟲表面蛋白。
本發(fā)明的診斷試劑包括當(dāng)與該標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)的誘導(dǎo)顯色的底物溶液。優(yōu)選地，該底物溶液由一種緩沖溶液和一種當(dāng)與該標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)的誘導(dǎo)顯色的著色固定劑組成。優(yōu)選的著色固定劑包括四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯等。該底物溶液中的著色固定劑如四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯被HRP分解，(HRP是優(yōu)選的標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物)產(chǎn)生顯色。然后，用吸光率測(cè)定瘧疾特異性抗體的存在及量。
本發(fā)明提供了一種用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的瘧疾免疫測(cè)定方法。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的IgM捕捉免疫測(cè)定方法。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的IgM捕捉酶免疫測(cè)定方法。優(yōu)選地，本發(fā)明也提供了一種用瘧原蟲抗原和抗人IgM抗體檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的免疫測(cè)定方法。
本發(fā)明提供了一種覆蓋有源自山羊的抗人IgM抗體的96孔板，該板作為優(yōu)選的固體支持劑，用于診斷瘧疾。本發(fā)明還提供了一種由標(biāo)記物和瘧原蟲抗原組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，以檢測(cè)瘧疾特異性IgM。本發(fā)明該標(biāo)記抗原結(jié)合物由標(biāo)記物和抗原組成，該抗原優(yōu)選地可以是從酵母菌或大腸桿菌轉(zhuǎn)化體純化的瘧原蟲重組表面抗原，用以檢測(cè)瘧疾特異性IgM。該標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物包括，但不限于，一種酶，如辣根過氧化酶(HRP)和堿性磷酸酶，膠體金，熒光物質(zhì)，染色劑等。優(yōu)選地，該標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物是一種酶，更優(yōu)選地，是辣根過氧化酶(HRP)。
本發(fā)明優(yōu)選的瘧疾IgM捕捉免疫測(cè)定方法檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM，包括(i)將抗人IgM抗體固定在一個(gè)固體支持體上；(ii)傾入血清或血漿樣品使瘧疾特異性IgM與固定在固體支持體上的抗人IgM抗體結(jié)合；(iii)加入由標(biāo)記物和瘧原蟲抗原組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，使標(biāo)記抗原結(jié)合物與瘧疾特異性IgM結(jié)合；(iv)用與瘧疾特異性IgM的結(jié)合的標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物進(jìn)行分析。
優(yōu)選地，在上述IgM捕捉免疫測(cè)定方法中，本發(fā)明可用瘧原蟲表面抗原作為步驟(iii)中標(biāo)記了抗原結(jié)合物的抗原。優(yōu)選的表面抗原包括部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白，更優(yōu)選的例子包括瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端。優(yōu)選的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端包括瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端部分或完整的PV200C多肽。并且，優(yōu)選的PV200C多肽氨基酸序列包括SEQ.ID NO1示出的氨基酸序列。
本發(fā)明更優(yōu)選的瘧疾IgM捕捉免疫測(cè)定方法檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM包括(1)傾入血清或血漿樣品在覆蓋有源自山羊的抗人IgM抗體的多孔板的每個(gè)孔中；(2)洗滌該多孔板；(3)加入由HRP和重組表面抗原組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，使該標(biāo)記抗原結(jié)合物與與抗人IgM抗體結(jié)合的IgM結(jié)合；(4)洗滌該多孔板；(5)加入一種緩沖液和一種著色固定劑組成的底物溶液以顯色；(6)用96孔板讀出器測(cè)定吸光率。
本發(fā)明瘧疾免疫測(cè)定方法的優(yōu)選實(shí)施例是，提供了一種覆蓋有源自山羊的抗人IgM抗體的固體支持物。本發(fā)明瘧疾免疫測(cè)定方法的更優(yōu)選實(shí)施例是提供如下述實(shí)施例3-3所記錄的結(jié)合HRP的抗原蛋白的標(biāo)記抗原結(jié)合物?？乖鞍子山湍妇痛竽c桿菌的轉(zhuǎn)化體表達(dá)的，轉(zhuǎn)化體由瘧疾瘧原蟲的編碼抗原蛋白的基因嵌入制成的表達(dá)載體制備，純化而得。
當(dāng)可能是瘧疾患者的血樣被傾入覆蓋有源自山羊的抗人IgM抗體的固體支持物中時(shí)，血液中的人類IgM和固定在固體支持物上的抗人IgM抗體結(jié)合。將由HRP和瘧疾瘧原蟲表面抗原組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物加入固體支持物之后，結(jié)合物開始和瘧疾患者的IgM發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，患者的IgM來自結(jié)合在抗人IgM抗體上的IgMs，該抗人IgM抗體固定在固定固體支持物上。在底物溶液中，與瘧疾患者的IgM抗體結(jié)合的HRP結(jié)合物分解著色固定劑，誘導(dǎo)顯色。最后，本發(fā)明的瘧疾免疫檢測(cè)方法采用吸光度方法檢測(cè)血液中的IgM的存在以及IgM的數(shù)量來診斷瘧疾感染情況。
在本發(fā)明的上述免疫檢測(cè)中，同時(shí)檢測(cè)了瘧疾患者和正常人的血漿。結(jié)果顯示，上述方法有98％以上的敏感性，以及99％以上的特異性。優(yōu)選是，四十歲或四十歲以上的正常人或曾被瘧疾感染過的人以及懷疑有IgG瘧疾抗體的人的血漿均被診斷為陰性。
本發(fā)明提供了一種瘧疾診斷試劑，可用于測(cè)定血液中的瘧疾特異性的IgM，包括瘧原蟲抗原。本發(fā)明提供了一種可測(cè)定血液中的瘧疾特異性的IgM的瘧疾診斷試劑，其組成為覆蓋有抗人IgM抗體固體支持體，由標(biāo)記物和瘧原蟲抗原組成的標(biāo)記的抗原結(jié)合物，以及含有著色固定劑的底物溶液。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述的上述診斷試劑可用瘧原蟲表面蛋白作為標(biāo)記的抗原結(jié)合物的抗原。瘧原蟲表面蛋白優(yōu)選包括瘧原蟲的部分或完整的瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白，優(yōu)選包括瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白C端。在瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白C端優(yōu)選包括在C為末端的瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白中有部分或完整的PV200C多肽。在PV200C多肽中，氨基酸順序優(yōu)選包括SEQ.ID NO1所示的氨基酸順序。
本發(fā)明所述的作為診斷試劑的抗人IgM抗體包括，但不僅僅限于如從山羊中提取的抗人IgM抗體，優(yōu)選是根據(jù)與抗原和抗體的親合作用進(jìn)行純化的、對(duì)IgM的mu鏈具有特異性的抗人IgM抗體，并且不與人體IgG或其它免疫球蛋白進(jìn)行交叉反應(yīng)。
本發(fā)明所述的作為診斷試劑的被標(biāo)記的抗原結(jié)合物的標(biāo)記物包括，但不僅僅限于酶，如辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酯酶，膠體金，熒光物質(zhì)，染色劑或其他類似物等。被標(biāo)記的抗原結(jié)合物的標(biāo)記物優(yōu)選為辣根過氧化物酶(HRP)。
本發(fā)明所述的診斷試劑包括底物溶液，該底物溶液在與被標(biāo)記的抗原結(jié)合物的標(biāo)記物反應(yīng)時(shí)，誘導(dǎo)顯色。底物溶液的組成優(yōu)選為緩沖溶液和著色固定劑，該著色固定劑當(dāng)與被標(biāo)記的抗原結(jié)合物反應(yīng)時(shí)，誘導(dǎo)顯色，著色固定劑優(yōu)選包括N-四甲聯(lián)苯胺及類似物。底物溶液中的著色固定劑如N-四甲聯(lián)苯胺由HRP分解，HRP是可引導(dǎo)顯色的被標(biāo)記的抗原結(jié)合物的較好標(biāo)記物。由此，通過測(cè)定吸光率可檢測(cè)IgM的存在及其數(shù)量。
本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其組成為瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白基因，酵母菌的α因子前導(dǎo)肽，以及組氨酸殘基。本發(fā)明的表達(dá)載體中的裂殖子表面蛋白基因優(yōu)選包含部分或完整的瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白基因。以瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白的C端PV200C多肽的基因中優(yōu)選含有部分或完整的瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白基因，已知PV200C多肽的氨基酸序列與一些瘧原蟲的亞種相同。在本發(fā)明的表達(dá)載體中，PV200C多肽的氨基酸序列優(yōu)選是SEQ.ID NO1所示的序列。
本發(fā)明優(yōu)選提供一種具有

圖1所示克隆圖(或限制酶位點(diǎn)圖)的表達(dá)載體pYLJ-MSP。同時(shí)，本發(fā)明還提供一種用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母菌轉(zhuǎn)化體pYLJ-MSP/S.cerevisiae INVSC1(保藏號(hào)KCTC 0937BP)。pYLJ-MSP的組成包括與PV200C多肽的N-末端相連的酵母菌α因子前導(dǎo)肽，PV200C多肽，以及與PV200C多肽的C-末端相連的6個(gè)組氨酸殘基。
為克隆PV200C多肽，本發(fā)明對(duì)瘧疾陽性血液的RNA進(jìn)行純化，并用獲得的RNA制備cDNA。之后，本發(fā)明用對(duì)PV200C具有特異性的一對(duì)引物和上述cDNA做模板，來進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，從而獲得放大的PV200C的DNA片段。
同時(shí)，使PV200C多肽在酵母菌中表達(dá)，使其分泌至細(xì)胞外，從而可以得到糖基化活性態(tài)的蛋白質(zhì)，為了獲得這種糖基化活性態(tài)的蛋白質(zhì)，將酵母菌的α因子前導(dǎo)肽序列與PV200C多肽的N-末端相連。酵母菌的α因子前導(dǎo)肽序列的放大的DNA片段可使用含有酵母菌α因子前導(dǎo)肽序列的質(zhì)粒根據(jù)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制得。
為了使酵母菌α因子前導(dǎo)肽的DNA片段和按上述方法制得的PV200C多肽連接起來，用2個(gè)PCR產(chǎn)物做模板重疊PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因由108個(gè)氨基酸編碼組成，見SEQ.ID NO1。本發(fā)明可制備pYLJ-MSP，它是在pYES-2載體(見圖1)中插入基因片段的重組表達(dá)載體。同樣，本發(fā)明也可獲得一種轉(zhuǎn)化體pYLJ-MSP/S.cerevisiae INVSC1，用轉(zhuǎn)化帶有重組表達(dá)載體pYLJ-MSP的酵母菌制成。轉(zhuǎn)化體在1999年12月18日被保藏在韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所的典型培養(yǎng)物中心中(Korean Collection for Type Cultures of Korea Research Instituteof Bioscience and Biotechnology)(保藏號(hào).KCTC 0937BP)。
本發(fā)明也可提供一種使用酵母菌轉(zhuǎn)化體制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的方法。本發(fā)明也可提供一種瘧疾診斷試劑，其組成是由該制備方法制成的表面蛋白。本發(fā)明優(yōu)選提供一種使用酵母菌轉(zhuǎn)化體制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的方法，該方法包括(i)制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的表達(dá)載體；(ii)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化為酵母菌，以得到酵母菌轉(zhuǎn)化體；(iii)培養(yǎng)酵母菌轉(zhuǎn)化體，得表面蛋白；(iv)分離純化表面蛋白。在上述制備方法中，本發(fā)明在步驟iv中優(yōu)選使用對(duì)組氨酸具有親和作用的柱和凝膠過濾層析法。瘧原蟲裂殖子表面蛋白優(yōu)選為活性態(tài)的PV200C多肽。上述轉(zhuǎn)化體表達(dá)的PV200C多肽可由與PV200C的N-末端偶合的α因子前導(dǎo)肽分泌到細(xì)胞外。分泌后，α因子前導(dǎo)肽可用存在與細(xì)胞膜中的肽酶進(jìn)行轉(zhuǎn)移。由此可證明，只有表面蛋白可被分泌到培養(yǎng)介質(zhì)中。
因?yàn)榻湍妇D(zhuǎn)化體表達(dá)的表面蛋白被分泌到培養(yǎng)介質(zhì)中，本發(fā)明利用表面蛋白的C-末端連接著6個(gè)組氨酸殘基的特性，采用Probond柱對(duì)表面蛋白的吸收作用來分離表面蛋白。用凝膠過濾層析法進(jìn)行純化，可得到純度為99％或更高純度的裂殖子表面蛋白，(見圖2)。分離純化的裂殖子表面蛋白約為18KDa，對(duì)表面蛋白N-末端的氨基酸序列進(jìn)行分析證明，表達(dá)表面蛋白是瘧原蟲的PV200C多肽。
同時(shí)使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)瘧疾患者的血清，以測(cè)定用酵母菌轉(zhuǎn)化體分離和純化的表面蛋白的抗原性。結(jié)果顯示，只有具有18KDa的MSPPV200C多肽被檢測(cè)到(見圖3)。由此證明，按本發(fā)明制備方法從酵母菌轉(zhuǎn)化體分離純化的蛋白質(zhì)是具有高敏感性和高特異性的抗原。
本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，該載體包括瘧原蟲裂殖子表面蛋白基因，組氨酸標(biāo)記物和T7啟動(dòng)子。在本發(fā)明表達(dá)載體中，裂殖子表面蛋白的基因可由部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白基因組成。瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白的C-末端中PV200C多肽的基因優(yōu)選為部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白基因。在本發(fā)明的表達(dá)載體中，PV200C多肽的氨基酸序列優(yōu)選為SEQ.ID NO1中所示的氨基酸序列。本發(fā)明優(yōu)選提供一種具有圖4所示的卵裂圖的表達(dá)載體pELK-MSP。本發(fā)明也提供用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體pELK-MSP/BL21(保藏號(hào)KCTC 0936BP)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，使用體積330bp的基因，該基因由瘧疾患者血液通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)得到。很明顯，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，采用現(xiàn)有技術(shù)手段改變表達(dá)載體的不定基因插入片段的被插入的基因的體積、堿基對(duì)序列等，是顯而易見的。
為了用大腸桿菌制備大量的可產(chǎn)生PV200C多肽的表達(dá)載體，對(duì)pET-19b(見圖4)的T7啟動(dòng)子下游中的PV200C基因進(jìn)行克隆，制備pELK-MSP。由于有起始基因pET-19b中l(wèi)acZ基因，當(dāng)異丙基硫-B-D-半乳糖苷(IPTG)被加入后，IPTG成為表達(dá)引導(dǎo)體，引導(dǎo)lacZ的表達(dá)。由此可誘導(dǎo)T7啟動(dòng)子產(chǎn)生的PV200C表達(dá)。
另外，不出現(xiàn)假陽性信號(hào)的10個(gè)組氨酸殘基可以在這樣一種狀態(tài)下被表達(dá)當(dāng)這些殘基與由表達(dá)載體表達(dá)的PV200C多肽的N-末端融合時(shí)。由表達(dá)載體表達(dá)的PV200C多肽的特性是易于被組氨酸親和樹脂純化。當(dāng)重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的被表達(dá)時(shí)，可表明收率占總蛋白質(zhì)的15-20％。
另外，本發(fā)明提供了pELKMSP轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，在pELK-MSP中引入大腸桿菌株BL21(DE3)lysS可制備大腸桿菌轉(zhuǎn)化體。導(dǎo)入技術(shù)可以是已有技術(shù)，如熱激法和電穿孔法等。除BL21(DE3)lysS外，在轉(zhuǎn)化時(shí)也可使用其它大腸桿菌株。
1999年12月18日，E.Coli/BL21(DE3)lysS/pELK-MSP被韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所的典型培養(yǎng)物中心保藏(Korean Collectionfor Type Cultures of Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology)(保藏號(hào)KCTC 0936BP)。
同樣，本發(fā)明可提供一種用大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的方法。另外，本發(fā)明也提供一種瘧疾診斷試劑，其組成是該制備方法制成的表面蛋白。
本發(fā)明優(yōu)選提供一種使用大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的方法，該方法包括(i)制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的表達(dá)載體；(ii)轉(zhuǎn)化表達(dá)載體至大腸桿菌，以獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化體；(iii)切割該大腸桿菌轉(zhuǎn)化體以獲得表面蛋白；(iv)分離并純化表面蛋白。在上述制備方法中，本發(fā)明在步驟iv中優(yōu)選使用對(duì)組氨酸具有親和作用的柱和凝膠過濾層析法。瘧原蟲裂殖子表面蛋白優(yōu)選為活性態(tài)的PV200C多肽。由于10個(gè)組氨酸殘基在它們與表達(dá)載體表達(dá)的PV200C多肽的N-末端連接時(shí)，才能獲得表達(dá)，所以，首先用組氨酸親和樹脂純化表達(dá)載體表達(dá)的PV200C多肽。被分離的蛋白質(zhì)被濃縮后，再用凝膠過濾層析法進(jìn)行純化。結(jié)果表明，用上述方法可制成純度為99％或更高的瘧原蟲抗原。
用上述純化方法得到的PV200C蛋白質(zhì)包括108個(gè)氨基酸，大小為15KDa，以及未切斷的多肽(見圖5)。用瘧疾患者的血清檢測(cè)了上述抗原的抗原性和敏感性。結(jié)果顯示，使用蛋白質(zhì)印跡法處理后，瘧疾患者具有PV200C抗體，且敏感性很高，因此，可用上述抗原做為診斷試劑(見圖6)。
本發(fā)明上述的內(nèi)容具有如下優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明提供的瘧疾的免疫檢測(cè)和診斷試劑檢測(cè)血液中瘧疾特異性抗體，比現(xiàn)有技術(shù)中免疫檢測(cè)和診斷試劑特異性抗原敏感性高，也可用來診斷瘧疾攜帶者及瘧疾患者，用于潛伏期長、血液中的瘧原蟲和抗原量少，復(fù)發(fā)的可能性高的韓國類型瘧疾的診斷。
在做間接免疫測(cè)定時(shí)，使用抗人IgG抗體和/或抗人IgM抗體，以及做抗原夾層免疫測(cè)定時(shí)，使用標(biāo)記的抗原結(jié)合物，結(jié)合物由標(biāo)記和表面抗原組成，此為本發(fā)明的具體實(shí)施，可進(jìn)行高敏感性的瘧疾攜帶者診斷，因?yàn)檫@些方法可測(cè)定瘧疾特異性抗體。另外，本發(fā)明間接免疫測(cè)定和抗原夾層免疫測(cè)定也可簡(jiǎn)化分析，因?yàn)檠獦雍蜆?biāo)記的抗原結(jié)合物可同時(shí)反應(yīng)。
而且，本發(fā)明的瘧疾診斷試劑的組成為覆蓋有瘧原蟲表面蛋白的固體支持體，由抗原和標(biāo)記物組成的標(biāo)記的抗原結(jié)合物，以及含有著色固定劑的底物溶液?？珊?jiǎn)單精確的檢測(cè)血液中存在的瘧疾特異性抗體及其數(shù)量。
使用本發(fā)明的瘧原蟲抗原測(cè)定血液中的瘧疾特異性IgM展開的免疫測(cè)定方法，以及瘧疾診斷試劑能區(qū)分瘧疾患者和瘧疾完全康復(fù)的正常人。因?yàn)樗鼈冎粰z測(cè)血液中的瘧疾特異性IgM。另外，也可有效的檢測(cè)老年人體內(nèi)以及瘧疾長期流行地區(qū)人群的瘧疾。
本發(fā)明所述的免疫測(cè)定方法和診斷試劑可測(cè)定血液中的瘧疾特異性的IgM可有效檢測(cè)潛伏期長、血液中的瘧原蟲和抗原量少，復(fù)發(fā)的可能性高的韓國類型瘧疾，因?yàn)樗鼈兛蓹z測(cè)潛伏期的瘧疾。另外，本發(fā)明所述的免疫測(cè)定方法和診斷試劑可測(cè)定血液中的瘧疾特異性的IgM可用于瘧疾患者的早期診斷。
與已有技術(shù)相比，使用本發(fā)明所述的制備方法，可比較容易、快速的制備高純度的瘧原蟲的裂殖子表面蛋白，本發(fā)明使用重組DAN技術(shù)將酵母菌轉(zhuǎn)化體制成活性態(tài)的瘧原蟲表達(dá)MSP。用本發(fā)明制備的純化的表面蛋白對(duì)抗體的靈敏性高，特異性高，且純度高。同時(shí)本發(fā)明制備方法純化的表面蛋白可顯著降低假陽性信號(hào)，可被用做診斷試劑和瘧疾疫苗。
另外，與已有技術(shù)相比，使用本發(fā)明所述的制備方法，可比較容易、快速的制備高純度的瘧原蟲的裂殖子表面蛋白，可通過用大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體大量制備瘧原蟲表達(dá)MSP。
用本發(fā)明所述方法制備的純化的表面蛋白對(duì)抗體的靈敏性高，特異性高，純度高。同樣，本發(fā)明制備的純化的表面蛋白可顯著降低假陽性信號(hào)，可被用做瘧疾診斷試劑。
本發(fā)明將用下列實(shí)施例進(jìn)一步說明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員十分清楚這些實(shí)施例僅是對(duì)本方面的更詳細(xì)的描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1-1用瘧疾陽性血液制備cDNA用TRI試劑TM(Sigma Co.)純化瘧疾陽性血液中的RNA。下列純化方法由Sigma Co.提供。
室溫下，將0.1ml的TRI試劑TM和0.1ml的瘧疾陽性血液靜置5min，在混合物中加入20微升BCP，室溫下將最終混合物靜置5min，在12,000rpm和4℃的條件下離心15min，離心產(chǎn)物分3層。將含有RNAs的最上層部分轉(zhuǎn)移至一個(gè)新試管中，然后往試管中加50微升異丙醇，室溫下靜置5min，再在12,000rpm和4℃的條件下離心結(jié)果混合物10min，去除上清液，用75％的乙醇洗滌小球，然后再用20微升去離子蒸餾水溶解，以用于制備cDNA。
將上述9微升純化RNA和1微升N6隨機(jī)引物(基因技術(shù))混合，在65℃下，反應(yīng)5min，然后轉(zhuǎn)移至冰中冷卻。
將4微升RT緩沖液，2微升0.1M DTT(DL-二硫蘇糖醇)(Sigma，Cal No.D5545)，1微升10mM dNTP，1微升逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco Co)，1微升RNase抑制劑(Promega)以及微升去離子蒸餾水加入上述混合物中，在42℃反應(yīng)1h，然后在70℃下反應(yīng)10min，制備cDNA。實(shí)施例1-2制備含有編碼PV200C基因的重組質(zhì)粒用實(shí)施例1-1中制備的cDNAs作為模板和一對(duì)下述引物SEQ.ID.NO2和SEQ.ID.NO4進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)如下。
反應(yīng)混合物含有5微升PCR緩沖液，5微升2.5mM dNTP，1微升敏感引物，1微升抗敏感引物，2微升cDNA模板以及35微升去離子蒸餾水，在94℃下反應(yīng)30秒。然后在混合物中加入1微升Vent聚合酶(BioLab)，然后將反應(yīng)按下列循環(huán)重復(fù)36次變性94℃，30sec；引物退火55℃，30sec；伸展72℃，30sec。然后用上述增強(qiáng)的DNAs做模板，和一對(duì)引物SEQ.ID.NO3和SEQ.ID.NO4.進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。
Vent聚合酶(BioLab)PCR按上述的同樣條件進(jìn)行。通過在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳可確認(rèn)增強(qiáng)的DNAs，用限制酶剪切增強(qiáng)的DNAs(指Pv200-ct657)和pBluscript KS(+)(Stratagene)載體，使用T4 DNA連接酶(Promega)。將EcoR V和Pv200-ct657嵌入pBluscript KS(+)載體中。結(jié)果制得重組質(zhì)粒(即pBC-Pv200ct657)。然后用pBC-Pv200ct657轉(zhuǎn)化大腸桿菌株JM 109。實(shí)施例1-3表達(dá)載體pYLJ-MSP的制備用實(shí)施例1-2中制得的pBC-Pv200-ct657做模板，和一對(duì)引物SEQ.ID.NO5和SEQ.ID N06進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。PCR按上述的同樣條件進(jìn)行。在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳確認(rèn)增強(qiáng)的DNAs(即PV200-19)。
為獲得與PV200C多肽N-末端相連的酵母菌α因子前導(dǎo)肽序列，使用IFN pYLBC(保藏號(hào)KCTC 0051BP)進(jìn)行PCR，IFN pYLBC的組成是作為模板的酵母菌α因子前導(dǎo)肽序列和一對(duì)引物SEQ.ID.NO7 andSEQ.ID.NO8。PCR按上述的同樣條件進(jìn)行。在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳確認(rèn)增強(qiáng)的DNAs(即酵母菌α-前導(dǎo))。
為連接上述增強(qiáng)的PV200-19和酵母菌α因子前導(dǎo)肽，用上述兩個(gè)PCR產(chǎn)物作為模板，和一對(duì)引物SEQ.ID.NO6和SEQ.ID.NO7進(jìn)行重疊PCR。反應(yīng)混合物含有5微升PCR緩沖液，5微升2.5mM dNTP，1微升敏感引物，1微升抗敏感引物，1微升Pv200-19的PCR產(chǎn)物，1微升酵母菌α因子前導(dǎo)肽的PCR產(chǎn)物，以及35微升去離子蒸餾水，在94℃下反應(yīng)30秒。然后在混合物中加入1微升Vent聚合酶(BioLab)，然后將反應(yīng)按下列循環(huán)重復(fù)36次變性94℃，30sec；引物退火55℃，30sec；伸展72℃，30sec。在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳確認(rèn)增強(qiáng)的DNA s(即α-Pv200-19)。
分別用限制酶HindIII和Xho I剪切增強(qiáng)的α-Pv200-19和pYES-2載體。然后，通過T4連接酶連接α-Pv200-19和pYES-2載體，得到所要的重組表達(dá)載體pYLJ-MSP(見圖1)。對(duì)pYLJ-MSP中的α-Pv200-19序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，α-Pv200-19的組成基因的編碼為108個(gè)如SEQ.ID.NO1所示的氨基酸，使用Hinnen法(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A 75，1929-1933，1978)可用pYLJ-MSP轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)INVSC1，然后在不含有尿嘧啶的小量介質(zhì)中過夜培養(yǎng)酵母菌轉(zhuǎn)化體。該酵母菌轉(zhuǎn)化體在1999年12月18日被保藏在韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所的典型培養(yǎng)物中心保藏(KoreanCollection for Type Cultures of Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology)(保藏號(hào)KCTC 0937BP)。實(shí)施例1-4 MSP從酵母菌表達(dá)和純化為了從酵母菌制備MSP的表面蛋白，將轉(zhuǎn)化體pYLJ-MSP/Scerevisiae INVSC1接種到含有2％葡糖的100ml的YEPD介質(zhì)中，過夜培養(yǎng)。然后，將培養(yǎng)介質(zhì)轉(zhuǎn)移到分別含有1％葡糖和1％半乳糖的2L的YEP介質(zhì)中。在30℃下培養(yǎng)72h，酵母菌轉(zhuǎn)化體表達(dá)為PV200C多肽，耗盡了葡糖。在與PV200C多肽的N-末端連接的α因子前導(dǎo)肽的作用下，表達(dá)PV200C多肽被分泌到細(xì)胞外。而后，α因子前導(dǎo)肽被細(xì)胞膜中的肽酶移走。因此，只有PV200C多肽被分泌到培養(yǎng)介質(zhì)中。
為獲取被分泌到培養(yǎng)介質(zhì)中的PV200C多肽，對(duì)培養(yǎng)2天的培養(yǎng)介質(zhì)進(jìn)行離心，除去生物量。然后只取培養(yǎng)介質(zhì)的流動(dòng)部分，在超濾液容器中濃縮(Amicon，U.S.A.)。為易于得到純化的濃縮液，用Probond柱(Invitrogen)吸收與陽離子組氨酸相連的表面蛋白，陰離子鎳用上述與增強(qiáng)的Pv200-19的C-末端相連的6個(gè)組氨酸殘基偶合。
用含有10mM咪唑的磷酸鹽緩沖液去除未被柱吸收的污染物，然后將被柱吸收的表面蛋白解除吸附，用500mM咪唑和磷酸鹽緩沖液進(jìn)行分離。如圖2所示，此分離過程可得到90％或純度更高的表面蛋白。然后，濃縮分離液，用Sephacryl S-200凝膠過濾層析法進(jìn)行濃縮，可得到這些99％或純度更高的表面蛋白。實(shí)施例1-5 由酵母菌純化制成的瘧原蟲表面蛋白的抗原性測(cè)定用12％的SDS-PAGE分析實(shí)施例1-4中得到的表面蛋白PV200C多肽。結(jié)果顯示，可在18kDa位置檢測(cè)到，由此證明，本發(fā)明的目標(biāo)蛋白質(zhì)是N-末端的氨基酸序列。
另外，還使用蛋白質(zhì)印跡法處理瘧疾患者的血清，以測(cè)定酵母菌純化得到的瘧原蟲表面蛋白的抗原性。按Towbin等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,76,4350-4354，1979)提供的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)。將電泳凝膠浸入緩沖溶液30min，緩沖溶液含25mM的Tris緩沖液，190mM的甘氨酸(pH8.3)和20％的甲醇。用同樣的緩沖液進(jìn)行電泳，可將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜中。然后，在室溫條件下，用含有3％脫脂奶的磷酸鹽緩沖溶液(PH7.4)孵育結(jié)合硝化纖維膜的蛋白質(zhì)1h。將稀釋至1/100的瘧疾患者的血清加入膜內(nèi)，室溫下孵育1h。然后，用0.05％吐溫20/磷酸鹽緩沖溶液清洗5次，每次清洗的時(shí)間間隔5min，將可以偶合HRP的第二個(gè)抗體(Vector Labs)稀釋至1/2000，加入到膜中，室溫下孵育1h。孵育結(jié)束后，用上述溶液清洗硝化纖維膜，然后，將4-氯-萘酚和過氧化氫同時(shí)加入膜中，以誘導(dǎo)顯色。結(jié)果顯示，只有在18KDa位PV200C多肽被檢測(cè)到。由此證明，本發(fā)明所述方法制成的表達(dá)和純化的表面蛋白PV200C多肽是具有高特異性的抗原。(見圖3)實(shí)施例2-1用瘧疾陽性血液制備cDNA用TRI試劑TM(Sigma Co.)純化瘧疾陽性血液中的RNA。下列純化方法由Sigma Co.提供。室溫下，將0.1ml的TRI試劑TM(Sigma Co.，Cat.No.T9424)和0.1ml的瘧疾陽性血液的混合物靜置5min，在混合物中加入20微升BCP，室溫下將最終混合物靜置5min，在12,000rpm和4℃的條件下離心15min，離心產(chǎn)物分3層。將含有RNAs的最上層部分轉(zhuǎn)移至一個(gè)新試管中，然后往試管中加50微升異丙醇，室溫下靜置5min，在12,000rpm和4℃的條件下對(duì)結(jié)果混合物進(jìn)行離心10min，去除上清液，用75％的乙醇洗滌小球，然后再用DEPC(焦碳酸二乙酯)處理的20微升去離子蒸餾水溶解，以用于制備cDNA。
將上述9微升上述純化的RNA和1微升N6隨機(jī)引物(Genotech)混合，在65℃下，反應(yīng)5min，然后轉(zhuǎn)移至冰中冷卻。將4微升PCR緩沖液，2微升0.1M DTT(DL-二硫蘇糖醇)(Sigma，Cal No.D5545)，1微升10mM dNTP，1微升逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco Co)，1微升RNase抑制劑(Promega)以及1微升去離子蒸餾水加入上述混合物中，在42℃反應(yīng)1h，然后在70℃下反應(yīng)10min，制備cDNA。實(shí)施例2-2制備含有PV200C編碼基因的重組質(zhì)粒用實(shí)施例2-1中制備的cDNAs作為模板和一對(duì)序列為SEQ.ID.NO9和SEQ.ID.NO10引物，敏感性引物和抗敏感性引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。
反應(yīng)混合物含有5微升PCR緩沖液，5微升2.5mM dNTP，1微升敏感引物，1微升抗敏感引物，2微升cDNA模板以及35微升去離子蒸餾水，在94℃下反應(yīng)30秒。然后在混合物中加入1微升Vent聚合酶(BioLab)，然后將反應(yīng)按下列循環(huán)重復(fù)36次變性94℃，30 sec；引物退火55℃，30sec；伸展72℃，30sec。然后用上述增強(qiáng)的DNAs做模板，和一對(duì)引物，敏感性引物和抗敏感性引物SEQ.ID.NO10和SEQ.ID.NO11.進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。PCR按上述的同樣條件進(jìn)行。通過在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳可確認(rèn)增強(qiáng)的DNAs的體積約為657bp。
用限制酶剪切增強(qiáng)的DNAs(指Pv200-ct657)和pBluscript KS(+)(Stratagene)載體，使用T4 DNA連接酶(Promega)，將EcoR V和Pv200-ct657嵌入pBluscript KS(+)載體中。結(jié)果制得重組質(zhì)粒(即pBC-Pv200ct657)。然后用pBC-Pv200ct657轉(zhuǎn)化大腸桿菌株JM 109，以備儲(chǔ)藏。實(shí)施例2-3表達(dá)載體pELK-MSP的制備用實(shí)施例2-2中制得的pBC-Pv200-ct657做模板，和一對(duì)引物，敏感性引物和抗敏感性引物，SEQ.ID.NO12和SEQ.ID NO13進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。用1％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，證明增強(qiáng)的DNA碎片的體積約為330bp。
用酚/氯仿的混合物純化增強(qiáng)的DNA碎片，得到高純度的DNA碎片。用NdeI和BamHI剪切DNA碎片、載體和pET-19b(Novagen)。然后，DNA碎片被嵌入到pET-19b，制成表達(dá)載體，pELK-MSP的體積約為6.0kb(見圖4)。
用CaCl2進(jìn)行處理，使pELK-MSPs和大腸桿菌株BL21(DE3)lysS發(fā)生轉(zhuǎn)化。1999年12月18日，轉(zhuǎn)化體被保藏在韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所的典型培養(yǎng)物中心(Korean Collection for Type Cultures ofKorea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)(保藏號(hào)KCTC 0936 BP)實(shí)施例2-4在大腸桿菌中PV200C多肽的大量制備和純化用含有50微克/ml氯霉素和100微克/ml的amphiciline的LB介質(zhì)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體pELK-MSP/株BL21(KCTC 0936BP)，時(shí)間為12h。然后，取50ml結(jié)果培養(yǎng)物，再接種到1L的LB介質(zhì)中，在37℃下培養(yǎng)2h。當(dāng)培養(yǎng)物的吸光率(OD600)變?yōu)?.3時(shí)，往介質(zhì)中加IPTG(異丙基硫-P-D-半乳糖苷)，使最終濃度達(dá)到0.2mM。然后再對(duì)培養(yǎng)物培養(yǎng)7h。
培養(yǎng)過程結(jié)束后，離心，只分離出細(xì)胞。將得到的細(xì)胞懸浮在30ml磷酸鹽緩沖液中(PBS)，用超聲波儀(Branson，Sonifier 450)破裂懸浮液中大腸桿菌，用5000rpm的速度離心。因?yàn)椴糠直磉_(dá)MSP蛋白質(zhì)溶在上清液中，剩余部分在顆粒內(nèi)，將上清液和顆粒都懸浮在4M尿素緩沖液中，(PH7.5)，尿素緩沖液是將4M尿素溶解在PBS制得。然后離心，只收集上清液。
由于過度表達(dá)的表面蛋白在N-末端有10個(gè)組氨酸組成的His標(biāo)記，因此，可用組氨酸親和柱(Invitrogen)的吸收作用進(jìn)行純化。反復(fù)用清洗緩沖液去除柱不吸收的污染物，清洗液是將10mM咪唑和0.1M的NaCI溶解在PBS中制得。如圖5所示，用15％的SDS PAGE證明，此過程可制得約90％或更高純度的表面蛋白。
因此證明，濃縮分離溶液，并用Sephacryl S-200(Pharmacia Co.，瑞典)凝膠過濾層析法進(jìn)行濃縮，從重組大腸桿菌可制成大約99％或更高純度的PV200C多肽。實(shí)施例2-5由大腸桿菌純化制成的瘧原蟲表面蛋白的抗原性的測(cè)定使用蛋白質(zhì)印跡法(Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.76，4350-4354，1979)處理瘧疾患者的血清，以測(cè)定實(shí)施例2-4中制成的MSP PV200C的抗原性。
將實(shí)施例2-4中制成的PV200C每孔5微克加到15％SDS-PAGE凝膠中，電泳。將電泳凝膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖溶液30min，緩沖溶液含25mM的Tris-HCI，190mM的甘氨酸(pH8.3)和20％的甲醇，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜中(Hafer Transphor Power Lid，Pharmacia Co.)。然后，在室溫條件下，用阻斷緩沖液(3％脫脂奶/PBS，pH7.4)阻斷結(jié)合蛋白質(zhì)的硝化纖維膜，將瘧疾患者的血清稀釋至1/100，添加到膜中，室溫條件下，孵育1h。
然后，用洗滌緩沖溶液(0.05％吐溫20/PBS)清洗硝化纖維膜5次，每次清洗的時(shí)間間隔5min。將可以偶合HRP的第二個(gè)抗體(VectorLabs，U.S.A.)稀釋至1/2000，加入到膜中，室溫下孵育1h。孵育結(jié)束后，用清洗緩沖溶液洗滌硝化纖維膜，然后，將4-氯-萘酚和過氧化氫同時(shí)加入膜中，以誘導(dǎo)顯色。
結(jié)果顯示，只有在15KDa位置的表面蛋白PV200C多肽有污痕。由此證明，本發(fā)明所述方法制成的表達(dá)和純化的表面蛋白PV200C多肽是具有高特異性的抗原。(見圖6)實(shí)施例3-1用覆蓋有瘧原蟲表面蛋白孔板制備為提供瘧疾診斷使用的固體支持，用0.1M碳酸鹽緩沖溶液(pH9.5)稀釋實(shí)施例1-4或2-4制備的瘧原蟲的重組表面抗原的溶液，稀釋至0.5微克/ml，然后在96孔板的每個(gè)孔中加入100微升溶液。為吸附孔中的表面抗原，密封孔板，在4℃下放置18h。
在每個(gè)孔中加入含有5％普通山羊血清的磷酸鹽緩沖溶液300微升，去除不能被孔吸附的表面抗原，然后在4℃下放置18h。當(dāng)去除孔中的剩余溶液后，將孔板在室溫下放置1h除水分。然后將孔板轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有除濕劑的密閉容器中，存放在4℃的冰箱中。
本發(fā)明的實(shí)施中，上述方法制備的覆蓋有瘧原蟲表面蛋白孔板可被用作瘧疾診斷試劑和瘧疾免疫測(cè)定的固體支持體。實(shí)施例3-2用間接的酶免疫測(cè)定方法診斷瘧疾為使用間接酶免疫測(cè)定方法診斷瘧疾，使用實(shí)施例3-1所述的在實(shí)施例1-4或2-4制得的覆蓋有重組表面抗原制成的96孔板(Nunc)固體支持，以及由HRP和山羊的抗人IgM抗體或抗人IgG抗體組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物。
將100微升樣品稀釋溶液加入實(shí)施例3-1制得的覆蓋有重組表面抗的96孔板(Nunc)的每個(gè)孔中，稀釋溶液含有1.15mg/ml的NaOH，0.2mg/ml的KH2PO4，0.2mg/ml的KCl，8mg/ml的NaCl，300微升/ml牛血清，0.2mg/ml的硫汞撒等物質(zhì)。然后再往孔中加10微升抗體陰性的血樣品或10微升抗體陽性的血樣品，充分混合反應(yīng)混合物。37℃下，在反應(yīng)器中孵育孔板60min。反應(yīng)結(jié)束后，將孔板用300微升磷酸鹽緩沖溶液清洗5次。緩沖溶液含0.05％的吐溫20。稀釋HRP結(jié)合的山羊抗人IgG抗體(Cappel)或抗人IgM抗體(Bethyl)至1/40,000，稀釋溶液含有10mM Tris，0.5M NaCl，1mM CaCl2，0.5％甘油，0.2微升/ml牛血清，100微升/ml山羊血清，0.05％吐溫20，0.2mg/ml硫汞撒和50微克/ml的酚紅。在96孔板(Nunc)的每個(gè)孔中加入100微升稀釋的結(jié)合物中，37℃下，孵育孔板60min。反應(yīng)結(jié)束后，用0.05％的吐溫20/磷酸鹽緩沖溶液清洗孔板5次。在每個(gè)孔中加入加入100微升底物溶液，底物溶液中含100微克/ml N-四甲聯(lián)苯胺，0.006％過氧化氫，以及檸檬酸磷酸鹽緩沖溶液(pH4.5)。在暗處顯色30min后，在每個(gè)孔中加100微升反應(yīng)終止溶液(2N硫酸溶液)終止顯色反應(yīng)。用96孔板讀出器(分子設(shè)備，USA).測(cè)定450nm(參考波長650nm)的吸光率。底物溶液中作為著色固定劑的N-四甲聯(lián)苯胺在顯色過程中被HRP結(jié)合的抗人IgG抗體或抗人IgM抗體分解。因此，通過測(cè)定吸光率可檢測(cè)瘧疾特異性抗體的存在及數(shù)量。
用上述方法，對(duì)20例瘧疾陽性(瘧疾患者血漿)和48例瘧疾陰性(正常人血漿)進(jìn)行測(cè)定。在陰性樣本的平均值加0.5可決定陽性截?cái)嘀档那闆r下，使用本發(fā)明所述的用瘧原蟲的重組表面抗原所做的間接酶免疫測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，在20例瘧疾患者中可判斷18例呈現(xiàn)陽性，48例正常人中可判斷46例呈現(xiàn)陰性。由此可看出，本發(fā)明所述的間接酶免疫測(cè)定法具有90％的敏感性和95.8％的特異性。實(shí)施例3-3與HRP結(jié)合的瘧原蟲表面抗原的制備制備用作用抗原夾層酶免疫測(cè)定的標(biāo)記的抗原結(jié)合物。
在4℃下，將實(shí)施例1-4或2-4中制成的瘧原蟲的重組表面抗原用1L的0.01M的碳酸鈉緩沖溶液(PH9.6)滲析1天，在滲析過程中，更換緩沖溶液3次。
在試管中將5mg的HRP溶解在0.5ml的蒸餾水中，而后在HRP溶液中加100微升42mg/ml的NaIO4，用箔包扎試管，室溫下振搖試管30min，發(fā)生氧化反應(yīng)。HRP被充分氧化后，往反應(yīng)溶液中加60微升1M甘油。然后，仍用用箔包扎試管，室溫下振搖試管30min，至氧化反應(yīng)終止。
為了讓HRP和表面抗原發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，用0.01M碳酸鈉緩沖溶液(PH9.6)飽和的PD10柱(Pharmacia)去除HRP反應(yīng)溶液中的鹽。將上述表面抗原溶液加入氧化的HRP反應(yīng)溶液。用箔包扎試管，室溫下振搖試管，制得HRPs和表面抗原的結(jié)合物。當(dāng)HRP和表面抗原的共聚反應(yīng)結(jié)束后，為穩(wěn)定HRP表面抗原結(jié)合物，往試管中加40.8微升4mg/ml的NaIO4，仍用箔包扎試管，4℃下振搖2h進(jìn)行反應(yīng)。
為去除反應(yīng)溶液中沒有結(jié)合的HRPs，用Probond柱吸附結(jié)合HRPs的表面蛋白，通過用與表面蛋白的C-末端的連接的組氨酸殘基，使用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行平衡。沒有結(jié)合的HRPs被磷酸鹽緩沖溶液移走，Probond柱吸附的HRPs表面抗原結(jié)合物被含有1M咪唑的磷酸鹽緩沖溶液洗脫。收集結(jié)合物，用購買的有效BSA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)盒測(cè)定收集的HRP-表面抗原結(jié)合物中蛋白質(zhì)的濃度。在終濃度為1％的樣品中加入牛血清白蛋白(BSA)，儲(chǔ)存在冰箱中。
上述過程制備的HRP-表面抗原結(jié)合物在抗原夾層酶免疫測(cè)定和瘧疾診斷試劑中可被用作標(biāo)記抗原結(jié)合物。實(shí)施例3-4在抗原夾層酶免疫測(cè)定中，使用HRP-表面抗原結(jié)合物診斷瘧疾使用實(shí)施例3-3中制備的HRP-表面抗原結(jié)合物進(jìn)行瘧疾的抗原夾層酶免疫測(cè)定。
將實(shí)施例3-1制得的覆蓋有重組表面抗原的96孔板(Nunc)的每個(gè)孔都加入30微升HRP-表面抗原結(jié)合物溶液，然后往孔中加100微升瘧疾陽性樣品(瘧疾患者血漿)或100微升瘧疾陰性樣品(正常人血漿)，充分混合結(jié)果混合物。37℃下，孵育孔板90min。反應(yīng)終止后，用300微升含有吐溫20的磷酸緩沖溶液清洗5次，在孔板的每個(gè)孔中加入100微升含有100微克/ml的N-四甲聯(lián)苯胺，0.006％的過氧化氫，及檸檬酸磷酸鹽緩沖溶液(pH4.5)的底物溶液。在暗處顯色30min后，在每個(gè)孔中加100微升反應(yīng)終止溶液(2N硫酸溶液)終止顯色反應(yīng)。用96孔板讀出器(分子設(shè)備，USA)測(cè)定450nm(參考波長650nm)的吸光率。底物溶液中作為著色固定劑的N-四甲聯(lián)苯胺被HRP結(jié)合的表面抗原分解而顯色。因此，通過測(cè)定吸光率可檢測(cè)瘧疾特異性抗體的存在及抗體的數(shù)量。
用上述方法，對(duì)202例瘧疾陽性(瘧疾患者血漿)和400例瘧疾陰性(正常人血漿)進(jìn)行瘧疾檢測(cè)。在陰性樣本的平均值加0.5可決定陽性截?cái)嘀档那闆r下，使用本發(fā)明所述的用HRP表面抗原聚合物所展開的抗原夾層酶免疫測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，在202例瘧疾患者中可判斷199例呈現(xiàn)陽性，400例正常人中可判斷398例呈現(xiàn)陰性。由此可看出，本發(fā)明所述的抗原夾層酶免疫測(cè)定法具有98.5％的敏感性和99.6％的特異性。實(shí)施例4-1用IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法診斷瘧疾在IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法中，診斷瘧疾時(shí)，需要使用覆蓋有山羊的抗人IgM抗體的固體支持體、HRP和重組表面抗原組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，其中，重組表面抗原是用大腸桿菌轉(zhuǎn)化體純化制得。
用下列方法制板將山羊的抗人IgM抗體(親和純化的抗人IgM mu特異性鏈，Bethyl Co.，USA)用磷酸鹽緩沖溶液(PH7.0)稀釋至1-10微克/ml，然后將100-200微升混合物加入到聚苯乙烯板的每個(gè)孔中。室溫下，將孔板放置約12-18h，吸除孔中的剩余溶液。在每個(gè)孔中加入250微升0.1％凝膠或0.1％酪蛋白的磷酸鹽緩沖溶液。室溫下，將孔板放置約2h。吸除孔中的剩余溶液，在冷室中干燥孔板18h，備用。
將100微升樣品含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液的稀釋溶液加到每個(gè)孔板中，孔板是用覆蓋有山羊的抗人IgM抗體的孔板。然后將2-20微升抗體陰性血漿樣品或2-20微升抗體陽性血漿樣品加入孔中，充分混合結(jié)果混合物。37℃下，在反應(yīng)器中孵育孔板60min，反應(yīng)結(jié)束后，用300微升磷酸鹽緩沖溶液沖洗5次，磷酸鹽緩沖溶液含0.05％的吐溫20。
實(shí)施例1-4或2-4中制備的酵母菌純化的或大腸桿菌轉(zhuǎn)化體純化的瘧原蟲表面抗原可以按照實(shí)施例3-3中所述的方法與HRPs進(jìn)行結(jié)合，備用。
上述方法制備的由HRPs和表面抗原組成的結(jié)合物可用磷酸鹽緩沖溶液(PH7.0)稀釋，稀釋程度為1∶100至1∶1,000，磷酸鹽緩沖溶液含有1％BSA和0.05％吐溫20。然后將100微升HRP表面抗原結(jié)合物的溶液加到孔板的每個(gè)孔中。37℃下，孵育孔板30min。反應(yīng)結(jié)束后，孔板用含有0.05％吐溫20的磷酸緩沖溶液清洗5次，在孔板的每個(gè)孔中加入100微升含有100微克/ml的N-四甲聯(lián)苯胺，0.006％的過氧化氫，及檸檬酸磷酸鹽緩沖溶液pH4.5)的底物溶液。在暗處顯色30min后，在每個(gè)孔中加100微升反應(yīng)終止溶液(1N硫酸溶液)終止顯色反應(yīng)。用96孔板讀出器(分子設(shè)備，USA)測(cè)定450nm(參考波長650nm)處的吸光率。底物溶液中作為著色固定劑的N-四甲聯(lián)苯胺在顯色過程中被標(biāo)記抗原結(jié)合物的HRP的顯色引導(dǎo)作用而分解。因此，通過測(cè)定吸光率可檢測(cè)瘧疾特異性抗體IgM的存在及其數(shù)量。
用上述方法，對(duì)216例瘧疾陽性(瘧疾患者血漿)和353例瘧疾陰性(正常人血漿)進(jìn)行瘧疾檢測(cè)。在陰性樣本的平均值加0.5可決定陽性截?cái)嘀档那闆r下，使用本發(fā)明所述的使用瘧原蟲重組表面抗原開展的IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，在216例瘧疾患者中可判斷212例呈現(xiàn)陽性，353例正常人中可判斷351例呈現(xiàn)陰性。由此可看出，本發(fā)明所述的IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法具有98.1％的敏感性和99.4％的特異性(見圖7)。實(shí)施例4-2 IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法與間接酶免疫測(cè)定方法的比較在IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法中，需使用覆蓋有山羊的抗人IgM抗體的固體支持，由HRPs和重組表面抗原組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，其中，重組表面抗原是用酵母菌或大腸桿菌轉(zhuǎn)化體純化制得。IgM捕獲酶免疫測(cè)定的步驟按照實(shí)施例4-1所述進(jìn)行。
同樣，按照實(shí)施例3-2所述的步驟開展間接酶免疫測(cè)定方法。
為比較IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法和間接酶免疫測(cè)定方法，對(duì)75例瘧疾陽性(瘧疾患者血漿)和92例瘧疾陰性(正常人血漿)進(jìn)行瘧疾檢測(cè)。在陰性樣本的平均值加0.05可決定陽性截?cái)嘀档那闆r下，使用本發(fā)明所述的使用瘧原蟲重組表面抗原開展的IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，在75例瘧疾患者中可判斷73例呈現(xiàn)陽性，92例正常人中可判斷92例呈現(xiàn)陰性。由此可看出，本發(fā)明所述的IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法具有99.3％的敏感性和100％的特異性。
同時(shí)，在陰性樣本的平均值加0.2可決定陽性截?cái)嘀档那闆r下，使用本發(fā)明所述的間接酶免疫測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，則75例瘧疾患者中可判斷59例呈現(xiàn)陽性，92例正常人中可判斷85例呈現(xiàn)陰性。由此可看出，本發(fā)明所述的間接酶免疫測(cè)定方法具有78.6％的敏感性和92.4％的特異性(見圖8)。實(shí)施例4-3將正常人群按年齡分組，比較IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法和抗原夾層酶免疫測(cè)定方法在IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法中，需使用覆蓋有山羊的抗人IgM抗體的固體支持，由HRPs和重組表面抗原組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，其中，重組表面抗原是用酵母菌或大腸桿菌轉(zhuǎn)化體純化制得。IgM捕獲酶免疫測(cè)定的步驟按照實(shí)施例4-1所述進(jìn)行。
同樣，按照實(shí)施例3-4的步驟實(shí)施抗原夾層酶免疫測(cè)定方法。
為了比較IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法和抗原夾層酶免疫測(cè)定方法，對(duì)129名正常受試者的血漿樣品進(jìn)行診斷，129名受試者中，10多歲年齡段的有26人，20多歲年齡段的有43人，30多歲年齡段的有33人，40多歲年齡段的有27人。
當(dāng)陰性樣本的平均值加0.05可決定陽性截?cái)嘀档那闆r下，使用本發(fā)明所述的使用瘧原蟲重組表面抗原開展的IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，則129例正常受試者中可判斷129例呈現(xiàn)陰性。由此可看出，本發(fā)明所述的IgM捕獲酶免疫測(cè)定方法具有100％的特異性。
同時(shí)，在陰性樣本的平均值加0.05可決定陽性截?cái)嘀档那闆r下，使用本發(fā)明所述的抗原夾層酶免疫測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，則129例正常受試者中可判斷127例呈現(xiàn)陰性。由此可看出，本發(fā)明所述的抗原夾層酶免疫測(cè)定方法具有98.4％的特異性。特別是對(duì)瘧疾流行之后出生的30多歲或更年輕的受試者進(jìn)行診斷時(shí)，本發(fā)明所述的抗原夾層酶免疫測(cè)定方法的特異性達(dá)到100％。但對(duì)瘧疾流行期出生的40多歲的受試者進(jìn)行診斷時(shí)，27名正常受試者中，有2名呈現(xiàn)陽性，則本發(fā)明所述的抗原夾層酶免疫測(cè)定方法的特異性為92.6％。因此，本發(fā)明所述的抗原夾層酶免疫測(cè)定方法的特異性隨著特定的年齡人群而降低(見圖9)。
序列表序列表<110>株式會(huì)社LGCI<120>瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑<130>P02KR07841<150>KR 10-2000-7648<151>2000-02-17<150>KR 10-2000-7649<151>2000-02-17<150>KR 10-2000-7650<151>2000-02-17<150>KR 10-2000-12172<151>2000-03-10<150>KR 10-2000-45806<151>2000-08-08<160>13<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>108<212>PRT<213>瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白的羧端基多肽<220><221>縮胺酸<222>(1)..(108)<223>瘧原蟲vivax<400>1Asn Glu Ser Lys Glu I1e Leu Ser Gln Leu Leu Asn Val Gln Thr Gln1 5 10 15Leu Leu Thr Met Ser Ser Glu His Thr Cys Ile Asp Thr Asn val Pro20 25 30Asp Asn Ala Ala Cys Tyr Arg Tyr Leu Asp Gly Thr Glu Glu Trp Arg35 40 45Cys Leu Leu Thr Phe Lys Glu Glu Gly Gly Lys Cys Val Pro Ala Ser50 55 60Ash Val Thr Cys Lys AsP Asn Asn Gly Gly Cys Ala Pro Glu Ala Glu65 70 75 80Cys Lys Met Thr Asp Ser Asn Lys Ile Val Cys Lys Cys Thr Lys Glu85 90 95Gly Ser Glu Pro Leu Phe Glu Gly Val Phe Cys Ser100 105<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>2aaaaaagtcg acgccaaaaa ggccgagctg g31<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>3aaaaaagtcg acgagaaqta cctcccgttc c31<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>4aaaaaaatcg atttaaagct ccatgcacag g31<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>5tctctagata agagaaacga gtccaaggaa 30<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>6aaactcgagt cagtggtggt ggtggtggtg gctacagaaa actcc 45<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>7aaaaagctta tgagatttcc ttca24<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>8tctcttatct agagataccc 20<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>9aaaaaagtcg acgccaaaaa ggccgagctg g31<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>10aaaaaagtcg acgagaagta cctcccgttc c31<210>11<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>11aaaaaaatcg atttaaagct ccatgcacag g31<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>12ggtccatatg aacgagtcca aggaaatatt atcc 34<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>13ggacggatcc tcattagcta cagaaaactc cctcaaagag 40
權(quán)利要求
1.一種用瘧原蟲抗原檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾免疫檢測(cè)方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述被檢測(cè)的瘧疾特異性抗體是瘧疾特異性IgM。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的免疫檢測(cè)方法是IgM捕捉免疫檢測(cè)方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述IgM捕捉免疫檢測(cè)方法是IgM捕捉酶免疫檢測(cè)方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述血中瘧疾特異性IgM是用抗人IgM抗體檢測(cè)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的免疫檢測(cè)方法是酶免疫檢測(cè)方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述瘧原蟲抗原是瘧原蟲表面抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述瘧原蟲表面抗原是部分或完整的瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述部分或完整的瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白是瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白的C端。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白的C端是部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端的PV200C多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中PV200C多肽氨基酸序列是SEQ.ID NO1所示的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述瘧原蟲抗原是重組抗原。
13.檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾免疫檢測(cè)方法，該方法包括(a)將瘧原蟲表面抗原固定在一個(gè)固體支持體上；(b)傾入血清或血漿樣品，使瘧疾特異性抗體與固定在該固體支持體上的抗原結(jié)合；(c)加入由抗原和標(biāo)記物組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，將該標(biāo)記抗原結(jié)合物與瘧疾特異性抗體結(jié)合；(d)用結(jié)合到瘧疾特異性抗體的標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物進(jìn)行分析。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的瘧疾免疫檢測(cè)方法，該方法包括(a′)表達(dá)來自轉(zhuǎn)化體的虐原蟲Vivax的裂殖子表面抗原Vivax并將其純化；(a)將純化的表面抗原固定在一個(gè)固體支持體上；(b)傾入血清或血漿樣品，使瘧疾特異性抗體與固定在該固體支持體上的表面抗原結(jié)合；(c)加入由抗原和標(biāo)記物組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，將該標(biāo)記抗原結(jié)合物與瘧疾特異性抗體結(jié)合；(d)用結(jié)合到瘧疾特異性抗體的標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物誘導(dǎo)顯色；(e)用96孔板讀出器測(cè)定吸光率。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述瘧疾免疫檢測(cè)方法是間接免疫檢測(cè)方法，且步驟(C)中所述標(biāo)記抗原結(jié)合物的抗原是抗人IgG抗體和/或抗人IgM抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中所述瘧疾免疫檢測(cè)方法是抗原夾層免疫檢測(cè)方法，其中步驟(C)中所述標(biāo)記了抗原結(jié)合物的抗原是瘧原蟲表面抗原。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的免疫檢測(cè)方法，其中步驟(C)中標(biāo)記了抗原結(jié)合物的抗原是部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白。
18.一種檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的IgM捕捉免疫檢測(cè)瘧疾方法，該方法包括(i)將抗人IgM抗體固定在一個(gè)固體支持體上；(ii)傾入血清或血漿樣品使瘧疾特異性IgM與固定在固體支持體上的抗人IgM抗體結(jié)合；(iii)加入由標(biāo)記物和瘧原蟲抗原組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物，使標(biāo)記抗原結(jié)合物與瘧疾特異性IgM結(jié)合；(iv)用結(jié)合到瘧疾特異性IgM的標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物進(jìn)行分析。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中步驟(iii)所述標(biāo)記抗原結(jié)合物的抗原是瘧原蟲表面抗原。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的瘧疾免疫檢測(cè)方法，其中步驟(iii)所述標(biāo)記抗原結(jié)合物的抗原是部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白。
21.一種檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾診斷試劑，該試劑包括瘧原蟲抗原。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的瘧疾診斷試劑，其中所述被檢測(cè)的瘧疾特異性抗體是瘧疾特異性IgM。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的瘧疾診斷試劑，其中所述瘧原蟲抗原是瘧原蟲表面抗原。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的瘧疾診斷試劑，其中所述瘧原蟲表面抗原是部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的瘧疾診斷試劑，其中所述部分或完整的瘧原蟲vivax裂殖子表面蛋白是瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白的C端。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的瘧疾診斷試劑，其中所述瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白的C端是瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白C-端部分或完整的PV200C多肽。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的瘧疾診斷試劑，其中PV200C多肽氨基酸序列是SEQ.ID NO1所示的氨基酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求21或22的瘧疾診斷試劑，其中所述瘧原蟲抗原是重組抗原。
29.一種檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾診斷試劑，該試劑包括覆蓋有瘧原蟲表面抗原的固體支持體；抗原和標(biāo)記物組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物；及含有一種著色固定劑的底物溶液。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的瘧疾診斷試劑，其中所述瘧原蟲表面抗原是部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的瘧疾診斷試劑，其中所述標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物是辣根過氧化酶，堿性磷酸酶，膠體金，熒光物質(zhì)，染色劑等。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的瘧疾診斷試劑，其中該底物溶液由一種緩沖液和一種當(dāng)與該標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物反應(yīng)時(shí)誘導(dǎo)顯色的著色固定劑組成。
33.根據(jù)權(quán)利要求29的瘧疾診斷試劑，其中所述標(biāo)記抗原結(jié)合物的抗原是抗人IgG抗體和/或抗人IgM抗體。
34.根據(jù)權(quán)利要求29的瘧疾診斷試劑，其中所述標(biāo)記抗原結(jié)合物的抗原是瘧原蟲表面抗原。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的瘧疾診斷試劑，其中所述標(biāo)記抗原結(jié)合物的抗原是部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白。
36.一種檢測(cè)血中瘧疾特異性IgM的瘧疾診斷試劑，該試劑包括覆蓋有抗人IgM抗體的固體支持體；由標(biāo)記物和瘧原蟲抗原組成的標(biāo)記抗原結(jié)合物；及含有一種著色固定劑的底物溶液。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的瘧疾診斷試劑，其中所述標(biāo)記抗原結(jié)合物的抗原是瘧原蟲表面抗原。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的瘧疾診斷試劑，其中所述標(biāo)記抗原結(jié)合物的抗原是部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白。
39.根據(jù)權(quán)利要求36的瘧疾診斷試劑，其中所述標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物是辣根過氧化酶，堿性磷酸酶，膠體金，熒光物質(zhì)，染色劑等。
40.根據(jù)權(quán)利要求36的瘧疾診斷試劑，其中該底物溶液由一種緩沖液和一種當(dāng)與該標(biāo)記抗原結(jié)合物的標(biāo)記物反應(yīng)時(shí)誘導(dǎo)顯色的著色固定劑組成。
41.一種表達(dá)載體，該載體由瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白基因、酵母菌的α因子前導(dǎo)肽和組氨酸殘基組成。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的表達(dá)載體，其中裂殖子表面蛋白基因包括部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白基因。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的表達(dá)載體，其中裂殖子表面蛋白基因是裂殖子表面蛋白C-端PV200C多肽的基因。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的表達(dá)載體，其中PV200C多肽氨基酸序列是SEQ.ID NO1所示的氨基酸序列。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體是具有圖1所示的克隆圖譜的pYLJ-MSP。
46.用根據(jù)權(quán)利要求45的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母菌轉(zhuǎn)化體pYLJ-MSP/S.cerevisiae INVSC1(保藏號(hào)KCTC 0937BP)。
47.用酵母菌轉(zhuǎn)化體制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的方法。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，該方法包括(i)制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的表達(dá)載體；(ii)轉(zhuǎn)化表達(dá)載體成為酵母菌，以獲得酵母菌轉(zhuǎn)化體；(iii)切割該酵母菌轉(zhuǎn)化體以獲得表面蛋白；(iv)分離并純化該表面蛋白。
49.根據(jù)權(quán)利要求的48方法，其中步驟(iv)用具有對(duì)組氨酸有親和作用的柱及凝膠過濾層析進(jìn)行。
50.一種瘧疾診斷試劑，該試劑包括根據(jù)權(quán)利要求的47制備方法生產(chǎn)的表面蛋白。
51.一種包括瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白基因，組氨酸標(biāo)記物和T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的表達(dá)載體，其中裂殖子表面蛋白基因包括部分或完整的瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白基因。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的表達(dá)載體，其中裂殖子表面蛋白基因是裂殖子表面蛋白C-端PV200C多肽的基因。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的表達(dá)載體，其中PV200C多肽氨基酸序列是SEQ.ID NO1所示的氨基酸序列。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的表達(dá)載體，其中表達(dá)載體是具有圖4所示的克隆圖譜的pELK-MSP。
56.用根據(jù)權(quán)利要求55的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體pELK-MSP/BL21(保藏號(hào)KCTC 0936BP)。
57.用大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的方法。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，該方法包括(i)制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白的表達(dá)載體；(ii)轉(zhuǎn)化表達(dá)載體至大腸桿菌，以獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化體；(iii)切割該大腸桿菌轉(zhuǎn)化體以獲得表面蛋白；(iv)分離并純化該表面蛋白。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中步驟(iv)用具有對(duì)組氨酸有親和作用的柱及凝膠過濾層析進(jìn)行。
60.一種瘧疾診斷試劑，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求的57制備方法生產(chǎn)的表面蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用瘧原蟲抗原進(jìn)行的瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種用瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)血中瘧疾特異性抗體的瘧疾免疫檢測(cè)和診斷試劑具有高的特異性和敏感性，可用于診斷潛伏期長、血中瘧原蟲數(shù)目少的類型的瘧疾。本發(fā)明還涉及一種用酵母菌或大腸桿菌制備瘧原蟲表面蛋白的方法。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，包括有瘧原蟲Vivax裂殖子表面蛋白基因和組氨酸殘基，及用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還提供了一種用該轉(zhuǎn)化體制備瘧原蟲裂殖子表面蛋白方法。根據(jù)本發(fā)明方法用酵母菌或大腸桿菌制備的瘧原蟲裂殖子表面蛋白對(duì)抗體具有高的敏感性和特異性，且具有高純度。此外，本發(fā)明的制備方法制備的表面蛋白用于診斷瘧疾時(shí)具有顯著低的假陽性信號(hào)。
文檔編號(hào)C07K14/445GK1406284SQ01805160
公開日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2001年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月17日
發(fā)明者林國鎮(zhèn), 孫美進(jìn), 柳承范, 李相翊, 吳宰勳, 李承遠(yuǎn), 金炯澈 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Lgci