Sirt1蛋白及其組合物在成骨轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及SIRTl蛋白及其組合物在成骨轉(zhuǎn)化中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國社會逐步步入老齡化社會，中老年性骨科疾病發(fā)生率也將大幅度上升，因此 中國也將面臨人工骨移植材料的極大需求。據(jù)統(tǒng)計，中國有肢體不自由患者1500萬，由于 缺乏重建技術(shù)和材料已有300萬人截肢，全國每年骨缺損和骨損傷患者近350萬，按年手術(shù) 40萬例計算，整個中國骨移植材料的市場規(guī)模也將達到24億人民幣以上的規(guī)模，這還不包 括大量牙科矯形手術(shù)中需要的骨移植材料。在美國，每年實施45萬例骨移植手術(shù)，骨移植 材料市場高達80億美元。對于歐洲市場，骨替代產(chǎn)品35%為合成材料，并且以每年41. 7% 的速率增長，2000年骨移植手術(shù)145775例，骨移植材料市場價值達35億美元。上述數(shù)據(jù) 尚未包括牙科用骨移植材料。牙科用骨移植材料估計有骨科用骨移植材料的1/4。作為生 物醫(yī)學(xué)材料中一個重要的組成部分，人工骨移植材料的市場銷售額在以每年50%的速率增 長，由此可見人工骨材料的市場規(guī)模與潛力將十分巨大。目前市場上的人工骨修復(fù)材料大 都缺少誘導(dǎo)成骨活性因子，這些材料植入人體后成骨的時間和數(shù)量受限，一定程度上限制 了新骨的形成。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs)是目前唯一能應(yīng)用 的能夠單獨誘導(dǎo)成骨的生長因子，骨形成蛋白（bone morphogenetic protein BMP)作為最 有效的成骨誘導(dǎo)活性物質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用在骨缺修復(fù)損及骨折愈合的研宄中。其中以BMP-2 的成骨能力最強。但天然的BMP2半衰期短，局部應(yīng)用時很快被稀釋和代謝，不僅數(shù)量有限， 活性不穩(wěn)定，遠遠不能滿足臨床需要，而且混入載體中有許多副作用。
[0003] 此外，移植能夠進行骨生成分化的干細胞或者定向于骨生成分化的細胞也是治 療骨相關(guān)疾?。ㄌ貏e是當(dāng)所述治療需要新骨產(chǎn)生時）的有前景的途徑。先前已使用骨髓 干細胞（BMSC)和間充質(zhì)干細胞（MSC)治療骨疾?。℅angji等，2005, Expert Opin Biol Ther(5) :437-42)。然而，盡管可以將這些相對未分化的干細胞進行移植，但是它們并不定 向分化為骨生成譜系，因此這樣移植的干細胞中有相當(dāng)大的比例最終可能不會形成期望的 骨組織。因此在干細胞相關(guān)的骨相關(guān)疾病的治療中，同樣需要成骨誘導(dǎo)劑的參與。
[0004] 在各種物種中發(fā)現(xiàn)的SIR2的同源蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為Sirtuins家族（Michishita，Park 等人，2005)。哺乳動物中Sirtuins家族有7個成員（Sirtl-Sirt7)，其中Sirtl與Sir2的 同源性最高。Sirtl通過與不同的組蛋白（Vaquero, Scher等人，2004)和非組蛋白底物相 互作用（Luo，Nikolaev 等人，2001 ;Vaziri，Dessain 等人，2001 ;Langley，Pearson 等人， 2002 ;Smith 2002 ;Yeung，Hoberg 等人，2004 ;Nemoto, Fergusson 等人，2005)，對細胞的生 存、凋亡、代謝等都發(fā)揮重要作用。人Sirtl基因位于10q22. 1，長約33kb，翻譯后的蛋白質(zhì) 分子量大小約為60ku，不存在剪切變異體，具有NAD依賴的脫乙?；富钚?。該蛋白廣泛存 在于機體的各種體細胞及生殖細胞中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供Sirtl蛋白作為成骨分化誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。
[0006] 具體的，Sirtl蛋白可作為成骨分化誘導(dǎo)劑添加到骨移植材料上，也可以添加到體 外細胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞或脂肪間質(zhì)干細胞向成骨方向轉(zhuǎn)化，從而使上述干 細胞作為種子細胞應(yīng)用到骨組織工程或骨移植材料當(dāng)中。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供Sirtl蛋白在制備治療骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。
[0008] 在本發(fā)明中，Sirtl蛋白可以為純化的重組Sirtl蛋白或適于在人體內(nèi)表達的重 組Sirtl表達載體。
[0009] 優(yōu)選地，所述純化的重組Sirtl蛋白利用常規(guī)的原核表達系統(tǒng)或真核表達系統(tǒng)獲 得。例如，在專利CN201010512043公開的方法來進行制備而獲得的重組Sirtl蛋白。當(dāng)然 也可以通過商業(yè)渠道購買獲得。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種包含Sirtl蛋白的組合物，所述組合物可以作為 成骨分化誘導(dǎo)劑應(yīng)用于現(xiàn)有技術(shù)，所述組合物由Sirtl蛋白和β-甘油磷酸鈉組成。
[0011] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述Sirtl蛋白和β-甘油磷酸鈉的重量比為1~ 3 :10,優(yōu)選為 2 :10。
[0012] 在本發(fā)明進一步地實施方案中，所述組合物由Sirtl蛋白、β -甘油磷酸鈉和芒果 苷組成，Sirtl蛋白、β-甘油磷酸鈉和芒果苷的重量比為~3 :10 :2~6 ;優(yōu)選為2 :10 : 3〇
[0013] 本發(fā)明的所述組合物可以作為成骨分化誘導(dǎo)劑添加到骨移植材料上，也可以添加 到體外細胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞或脂肪間質(zhì)干細胞向成骨方向轉(zhuǎn)化，從而使上 述干細胞作為種子細胞應(yīng)用到骨組織工程或骨移植材料當(dāng)中。
[0014] 還需要說明的是，本發(fā)明的所述組合物也可以作為藥物用于骨質(zhì)疏松癥的治療， 并且也可聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植來防治一些骨疾病。
[0015] 當(dāng)作為藥物進行使用時，優(yōu)選將組合物制備成注射劑進行使用。更優(yōu)選地，所述注 射劑選自皮內(nèi)注射劑、皮下注射劑、肌內(nèi)注射劑或靜脈注射劑。
【具體實施方式】
[0016] 下面將進一步的詳細說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求 保護的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護范圍以所附 權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0017] 實施例1 Sirtl蛋白及其組合物誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs)體外成骨分化的 研宄
[0018] 骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs)的培養(yǎng)：將2月齡雄性大鼠脫頸處死后，在無菌取下雙 側(cè)股骨和脛骨，暴露骨髓腔，反復(fù)沖洗骨髓腔至平皿中，收集平皿中的培養(yǎng)液至離心管中， lOOOrpm，3min離心，棄上清液，再用含10% FBS的a -MEM培養(yǎng)液重懸細胞，當(dāng)細胞密度達 80 %時，進行傳代培養(yǎng)，第4代細胞可用于實驗。以5 X IO4個· mL，農(nóng)度接種于96孔細胞 培養(yǎng)板，每孔200 yL。試驗分為以下各組：
[0019]
[0020] 對比例組：采用常規(guī)成骨誘導(dǎo)劑，具體為：終濃度為0. 01M/L地塞米松，lOmM/L的 β -甘油磷酸鈉和50mg/L的維生素 C。對照組不添加任何成骨誘導(dǎo)劑，僅添加等量的培養(yǎng) 基。
[0021] 每組設(shè)置6個復(fù)孔，在加入誘導(dǎo)劑7天后，收集細胞，粉碎，離心取上清，采用常規(guī) 試劑盒測定ALP活性和骨鈣素含量，具體結(jié)果如下：
[0022]
[0023] 在加入誘導(dǎo)孵育14天后/采用茜素紅法??定鈣結(jié)節(jié)數(shù)量I具體結(jié)果如下：
[0024]

[0025] 實施例2
[0026] 將可吸收人工骨材料（北京益而康生物工程開發(fā)中心）切成直徑7_，厚約I. 5_ 的圓片，用C〇60照射（2. 5Mrad)消毒。無菌條件下將本發(fā)明的誘導(dǎo)成骨短肽用雙蒸水溶解， 將消毒后的材料浸泡在成骨誘導(dǎo)劑溶液（成骨誘導(dǎo)劑濃度為lmg/ml，各組誘導(dǎo)劑中成分重 量比同實施例1中的組1-6)中30分鐘，待溶液完全進入材料后取出材料密封，置于4°C保 存。對照采用單純?nèi)斯す遣牧稀?br>[0027] 取成年雄性SD大鼠18只，體重200g_250g，隨機分組，每組9只。兩組分別使用成 骨誘導(dǎo)劑/人工骨材料和單純?nèi)斯す遣牧?。?%戊巴比妥鈉 I. 5ml/100g腹腔注射麻醉， 背部消毒，切開皮膚，分離左側(cè)肌間隙，植入材料。術(shù)后4周處死大鼠，取出植入材料及新長 的骨頭，稱量骨鮮重，然后將新骨放入高溫爐中煅燒6h，稱量灰分重量。具體結(jié)果如下：
[0028]
[0029] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技 術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到 的技術(shù)方案也在本申請保護范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開 內(nèi)容中具體記載一樣。
【主權(quán)項】
1. Sirtl蛋白作為成骨分化誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。 2. Sirtl蛋白在制備治療骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。3. -種包含Sirtl蛋白的組合物，所述組合物由Sirtl蛋白和0-甘油磷酸鈉組成。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述Sirtl蛋白和0 -甘油磷酸鈉的重 量比為1~3 :10。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述Sirtl蛋白和0 -甘油磷酸鈉的重 量比為2 :10。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述組合物由Sirtl蛋白、0 -甘油磷 酸鈉和芒果苷組成，Sirtl蛋白、0-甘油磷酸鈉和芒果苷的重量比為1~3 :10 :2~6。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述組合物由Sirtl蛋白、0 -甘油磷 酸鈉和芒果苷組成，Sirtl蛋白、0-甘油磷酸鈉和芒果苷的重量比為2 :10 :3。8. 權(quán)利要求3-7任一項所述組合物作為成骨分化誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求3-7任一項所述組合物在制備治療骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及SIRT1蛋白及其組合物在成骨轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。所述組合物可以作為成骨分化誘導(dǎo)劑應(yīng)用于現(xiàn)有技術(shù)，所述組合物由Sirt1蛋白和β-甘油磷酸鈉組成。所述Sirt1蛋白和β-甘油磷酸鈉的重量比為1～3：10，優(yōu)選為2：10。所述組合物也可由Sirt1蛋白、β-甘油磷酸鈉和芒果苷組成，Sirt1蛋白、β-甘油磷酸鈉和芒果苷的重量比為：1～3：10：2～6；優(yōu)選為2：10：3。
【IPC分類】A61P19/10, C12N5/077, A61K38/17, A61L27/54
【公開號】CN104911146
【申請?zhí)枴緾N201510270768
【發(fā)明人】張靜瑩
【申請人】大連大學(xué)
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年5月22日