一種櫛山香內(nèi)酯提取物的制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種櫛山香內(nèi)酯提取物的制備方法與應(yīng)用，具體是涉及一種應(yīng)用高速 逆流色譜技術(shù)從櫛山香地上部分中分離純化櫛山香內(nèi)酯提取物的方法，還涉及櫛山香內(nèi)酯 提取物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 櫛山香內(nèi)酯為δ -內(nèi)酯類化合物，主要從唇形科植物櫛山香辦 pecii/wia (L.) Poit.地上部分分離得到，包括f節(jié)山香內(nèi)醋A、f節(jié)山香內(nèi)醋B和f節(jié)山香內(nèi)醋C， 這三種單體成分均具有一定的抗菌作用，對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的MIC ( μ g/ml)分 別為12. 5和6. 25、100和25、100和12. 5,另外這三種化合物還具有細(xì)胞毒活性，對多種腫 瘤細(xì)胞的ED5tl均< 4 μ g/ml。
[0003] 現(xiàn)有提取櫛山香內(nèi)酯提取物的報(bào)道并不多見，市場上也尚未有櫛山香內(nèi)酯提取物 對照品的出售，因此提供一種櫛山香內(nèi)酯提取物的制備方法與應(yīng)用則很有必要，可以為其 后續(xù)研宄提供支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種櫛山香內(nèi)酯提取物的制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明方法制得 的櫛山香內(nèi)酯提取物質(zhì)量好，純度高。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種櫛山香內(nèi)酯提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 提取：將櫛山香地上部分粉碎，加入7-12倍藥材重量的70-90%乙醇水溶液，空化 混懸20-40min，進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取1-2次，得到萃取液； (2) 大孔樹脂富集：萃取液回收乙醇得浸膏，加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶 液洗脫，收集櫛山香內(nèi)酯提取物流分，濃縮得櫛山香內(nèi)酯提取物粗品； (3) 純化：將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化，以氯仿-甲醇-水為兩相溶劑系 統(tǒng)，ELSD檢測器監(jiān)測，收集目標(biāo)流分，回收試劑，真空干燥得產(chǎn)品。
[0006] 步驟（1)所述乙醇水溶液濃度為75%，用量為10倍藥材重量。
[0007] 步驟（1)所述混懸時(shí)間為30min，萃取2次。
[0008] 步驟（2)所述萃取液濃縮至密度1. 1-1. 2g/ml。
[0009] 步驟（2)所述大孔樹脂為DlOl型，醇水溶液為85%的乙醇溶液。
[0010] 步驟（3 )所述氯仿-甲醇-水體積比為（5-9 ) : (15-17 ) : (6-8 )。
[0011] 本發(fā)明制備方法制得的化合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明制備方法制得的化合物進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明：該化合物具有較強(qiáng)的抗 腫瘤活性，在天然新藥開發(fā)中具有良好的應(yīng)用前景。
[0013] 本發(fā)明制備方法制得的櫛山香內(nèi)酯提取物采用MTT法（四甲基偶氮唑鹽微量酶反 應(yīng)比色法）進(jìn)行抗腫瘤活性測試。
[0014] 試驗(yàn)用細(xì)胞株： HeLa :人子宮頸癌細(xì)胞株；HEC-I :人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株；T-98和U251-SP :人腦神經(jīng)膠 質(zhì)瘤細(xì)胞株；HLE :人肝癌細(xì)胞株；MMl-CB和HMV-I :人黑色素瘤細(xì)胞株。
[0015] 方法：（1) 0. 25%胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，10%NBS的RPMI 1640調(diào)細(xì)胞濃度 50000個(gè)/ml。96孔板IOOul/孔。設(shè)溶劑對照，每組3平行孔。37°C，5%C0 2、95%空氣的 培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h，棄上清。
[0016] (2)加藥物5個(gè)10倍稀釋的濃度(溶劑為有二甲亞砜和水），為KT4 mol/L。
[0017] (3)細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入10 μ I 5mg/ml的MTT溶液（以無血清培養(yǎng)基配 制)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
[0018] (4)吸去上清。加入200 μ1 DMS0,輕輕振蕩以使甲臜完全溶解。570nm處用酶標(biāo) 儀測定OD值。
[0019] (5)計(jì)算抑制率（%)=(對照OD-藥物0D) /對照0D*100% 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本發(fā)明化合物的抑制率以相對于對照(添加 DMS0)的結(jié)果如下表1表示。
[0020] 表1櫛山香內(nèi)酯提取物的腫瘤細(xì)胞增值抑制率％
以上試驗(yàn)表明，櫛山香內(nèi)酯提取物具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性，其可在制備 抗腫瘤藥物中得到應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明為制備抗腫瘤藥物提供了一種新的選擇。
[0022] 本發(fā)明所述櫛山香內(nèi)酯提取物在制備抗腫瘤藥物時(shí)，可按照常規(guī)的制劑方法以櫛 山香內(nèi)酯提取物為藥物活性成分，添加適宜的藥物載體，制成各種藥物劑型，如片劑、膠囊、 滴丸、注射劑、緩控釋劑等等。
[0023] 在用于治療腫瘤疾病時(shí)，口服制劑的用量一般可控制在每日服用櫛山香內(nèi)酯提取 物200_500mg。其他劑型的用量可參考該用量。本發(fā)明的藥物用法用量，也不完全限于此， 臨床醫(yī)師也可以根據(jù)病人的具體情況決定藥物的用法用量。
[0024] 下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限 于下列實(shí)施方式。
[0025]
【具體實(shí)施方式】： 實(shí)施例1 : 取櫛山香地上部分lkg，粉碎成粗粉，與10kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min， 進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. 2g/ml，得浸膏，向浸膏中加 DlOl型大孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用6倍柱體積的85%的乙醇溶液洗 脫，薄層檢測，收集目標(biāo)流分，濃縮得粗品。
[0026] 取氯仿-甲醇-水按（5:15:6)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層作 為固定相，下層作為流動(dòng)相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固定相 泵入色譜柱中，再以4ml/min流速泵入流動(dòng)相，并通過進(jìn)樣閥連續(xù)進(jìn)樣，控制轉(zhuǎn)速為850r/ min，ELSD檢測器監(jiān)測，收集流出液，濃縮，干燥得櫛山香內(nèi)酯提取物，檢測含量96. 4%。
[0027] 實(shí)施例2 : 取櫛山香地上部分2kg，粉碎成粗粉，與20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min， 進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. 2g/ml，得浸膏，向浸膏中加 DlOl型大孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用5倍柱體積的85%的乙醇溶液洗 脫，薄層檢測，收集目標(biāo)流分，濃縮得粗品。
[0028] 取氯仿-甲醇-水按（9:17:8)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層 作為固定相，下層作為流動(dòng)相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固 定相泵入色譜柱中，再以3. 5ml/min流速泵入流動(dòng)相，并通過進(jìn)樣閥連續(xù)進(jìn)樣，控制轉(zhuǎn)速 為900r/min，ELSD檢測器監(jiān)測，收集流出液，濃縮，干燥得櫛山香內(nèi)酯提取物，檢測含量 97. 2%〇
[0029] 實(shí)施例3 : 取櫛山香地上部分2kg，粉碎成粗粉，與20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min， 進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. lg/ml，得浸膏，向浸膏中加 DlOl型大孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用6倍柱體積的85%的乙醇溶液洗 脫，薄層檢測，收集目標(biāo)流分，濃縮得粗品。
[0030] 取氯仿-甲醇-水按（7:16:7)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層作 為固定相，下層作為流動(dòng)相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固定相 泵入色譜柱中，再以4ml/min流速泵入流動(dòng)相，并通過進(jìn)樣閥連續(xù)進(jìn)樣，控制轉(zhuǎn)速為1000 r/ min，ELSD檢測器監(jiān)測，收集流出液，濃縮，干燥得櫛山香內(nèi)酯提取物，檢測含量97. 0%。
[0031] 實(shí)施例4: 取櫛山香地上部分2kg，粉碎成粗粉，與20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min， 進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. 2g/ml，得浸膏，向浸膏中加 DlOl型大孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用5倍柱體積的85%的乙醇溶液洗 脫，薄層檢測，收集目標(biāo)流分，濃縮得粗品。
[0032] 取氯仿-甲醇-水按（8:15:7)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層 作為固定相，下層作為流動(dòng)相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固 定相泵入色譜柱中，再以3. 5ml/min流速泵入流動(dòng)相，并通過進(jìn)樣閥連續(xù)進(jìn)樣，控制轉(zhuǎn)速 為950r/min，ELSD檢測器監(jiān)測，收集流出液，濃縮，干燥得櫛山香內(nèi)酯提取物，檢測含量 96. 3%〇
[0033] 實(shí)施例5 : 本發(fā)明藥物顆粒劑 將實(shí)施例1所制櫛山香內(nèi)酯提取物加入乙醇作黏合劑，加入淀粉作填充劑，制成顆粒。
[0034] 實(shí)施例6 : 本發(fā)明藥物片劑 將實(shí)施例1所制櫛山香內(nèi)酯提取物，加入淀粉、糊精、硬脂酸鎂等，混合制成濕粒，壓 片，每片含櫛山香內(nèi)酯提取物200mg。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種櫛山香內(nèi)酯提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 提?。簩鄙较愕厣喜糠址鬯椋尤?-12倍藥材重量的70-90%乙醇水溶液，空化 混懸20-40min，進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取1-2次，得到萃取液； (2) 大孔樹脂富集：萃取液回收乙醇得浸膏，加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶 液洗脫，收集櫛山香內(nèi)酯提取物流分，濃縮得櫛山香內(nèi)酯提取物粗品； (3) 純化：將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化，以氯仿-甲醇-水為兩相溶劑系 統(tǒng)，ELSD檢測器監(jiān)測，收集目標(biāo)流分，回收試劑，真空干燥得產(chǎn)品。2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（1)所述乙醇水溶液濃度為75%，用 量為10倍藥材重量。3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（1)所述混懸時(shí)間為30min，萃取2 次。4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（2)所述萃取液濃縮至密度 I. 1-1. 2g/ml〇5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（2)所述大孔樹脂為DlOl型，醇水 溶液為85%的乙醇溶液。6. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（3)所述氯仿-甲醇-水體積比為 (5-9) : (15-17) : (6-8)〇7. 如權(quán)利要求1~6所述制備方法制得的化合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種櫛山香內(nèi)酯提取物的制備方法與應(yīng)用，制備方法包括以下步驟：（1）將櫛山香地上部分粉碎，加入乙醇水溶液，進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取，得到萃取液，萃取液回收試劑得浸膏；（2）浸膏加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶液洗脫，收集櫛山香內(nèi)酯提取物流分，濃縮得櫛山香內(nèi)酯提取物粗品；（3）將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化得櫛山香內(nèi)酯提取物。本發(fā)明方法具有所得產(chǎn)品含量高，操作簡單，提率高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明方法所制化合物為開發(fā)應(yīng)用新一代天然來源的抗腫瘤藥物開拓了新徑。
【IPC分類】C07D309/32, A61P35/00, A61K31/366
【公開號】CN104910117
【申請?zhí)枴緾N201510266058
【發(fā)明人】劉東鋒, 楊成東
【申請人】南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年5月22日