一種靈芝菌株液體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝三萜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及真菌發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及一種靈芝菌株液體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝三萜的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 靈芝Ganoderma lucidum[ (Leyss. ex. Fr. ) Karst]是一種珍貴的藥用真菌，作為藥 物在我國已有2000多年的歷史。《本草綱目》將其列為上品藥物，指出赤芝"苦，平，無毒， 主治胸中結(jié)，益心氣，補(bǔ)中，增智慧，不忘"，紫芝"無毒，好顏色，治虛勞，治痔"。2000年《中 華人民共和國藥典》將靈芝補(bǔ)錄，并將靈芝指定為赤芝Ganoderma lucidum(Curtis :Fr.) P. Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的子實(shí)體，明確指出靈芝具有"補(bǔ) 氣安神，止咳平喘"的功效，自此靈芝作為國家法定的藥物進(jìn)入我國的醫(yī)藥殿堂。
[0003] 現(xiàn)代研宄表明，靈芝的藥理作用主要有：抗腫瘤、抗放療與抗化療、抗心肌缺血、抗 缺氧、清除自由基、延緩衰老、保肝、鎮(zhèn)靜、免疫雙向調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)血脂、降血糖、抑制組織胺釋 放、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、抑制膽固醇合成、抑制血小板聚集、抗HIV-I及HIV-I蛋白酶活 性等。
[0004] 靈芝中所含的活性物質(zhì)主要有：多糖類、三萜類、核苷類、留醇類、生物堿類、呋喃 衍生物、氨基酸多肽類、微量元素、脂肪酸等，其中，靈芝多糖和三萜是靈芝主要的生物活性 成分，同時(shí)也逐漸成為評(píng)價(jià)靈芝質(zhì)量的重要指標(biāo)。
[0005] 與靈芝子實(shí)體和孢子粉相比，靈芝菌絲中所含的活性物質(zhì)活性更高，并且液體發(fā) 酵具有發(fā)酵時(shí)間短、污染可能性小等優(yōu)點(diǎn)，更有利于菌絲的工業(yè)化生產(chǎn)。靈芝三萜是作為靈 芝主要的生物活性成分，如何通過調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件使三萜產(chǎn)量達(dá)到最高，一直 以來都是靈芝液體發(fā)酵的主要研宄方向。而如何利用成本低廉、來源廣泛的培養(yǎng)基質(zhì)獲得 高含量靈芝三萜則是實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)的重要前提。
[0006] 授權(quán)公告號(hào)為CN101353689B發(fā)明專利文獻(xiàn)公開了一種提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三 貓產(chǎn)量的方法，該方法使用靈芝屬Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr) Karst.的菌種，菌株 保藏號(hào)為CCGMC 5. 616,并通過如下步驟進(jìn)行：
[0007] 1)將靈芝菌種接種含有碳源、氮源、礦物元素成分的培養(yǎng)基，在溫度為26~30°C、 轉(zhuǎn)速為130~180r/min條件下回轉(zhuǎn)式深層發(fā)酵1~5天；培養(yǎng)基組成是以玉米粉、葡萄糖為 碳源，以蛋白胨、豆餅粉為氮源，以KH 2POJP MgSO4為礦物元素；培養(yǎng)基中玉米粉含量為5~ l〇g/L、葡萄糖含量為25~40g/L ;培養(yǎng)基中蛋白胨含量為3~5g/L、豆餅粉含量為2~4g/ L ;培養(yǎng)基中KH2PO4含量為I. 5g/L、MgS0 4含量為0. 75g/L)補(bǔ)加棕櫚酸I. 5-3. Og/L后，在溫 度為25~30°C、轉(zhuǎn)速為100~180r/min條件下回轉(zhuǎn)式深層發(fā)酵3~6天結(jié)束；3)從發(fā)酵 液中提取靈芝三萜。
[0008] 申請(qǐng)公布號(hào)為CN104017852A的發(fā)明專利申請(qǐng)文獻(xiàn)公開了一種提高靈芝液體深層 發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法，該方法包括：取在斜面培養(yǎng)基中活化后的斜面菌絲體 靈芝菌株，挑取菌絲塊接入種子培養(yǎng)基中，接種后于20~30°C、50~200r/min下培養(yǎng)7~ 14天，得到種子培養(yǎng)液；將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照5~15%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基 中，接種后于20~30°C、50~200r/min下培養(yǎng)3~10天，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加 Ivol %~ 5vol %的油酸，最終獲得靈芝菌絲體，進(jìn)而提取菌絲體中的靈芝三萜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種靈芝菌株液體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝三萜的方法，該方法能夠顯著提高 發(fā)酵液中靈芝三萜以及多糖的產(chǎn)量。
[0010] 一種靈芝菌株液體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝三萜的方法，包括：將靈芝接種到種子培養(yǎng)基中 培養(yǎng)后，再接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵液中提取靈芝三萜；所述發(fā)酵培養(yǎng)基以 麥芽汁為碳源、以酵母浸出粉為氮源，所述麥芽汁的重量百分?jǐn)?shù)為2~5%，所述酵母浸出 粉的重量百分?jǐn)?shù)為〇. 8~2. 8%。
[0011] 碳源作為靈芝生長過程中主要的營養(yǎng)物質(zhì)，不同的碳源對(duì)靈芝菌種次生代謝有不 同的影響。
[0012] 麥芽作為啤酒生產(chǎn)中主要的原料，其所含的主要成分包括：碳水化合物 (70% -85% )、蛋白質(zhì)（10. 5% -11. 5% )、無機(jī)物（2% -4% )、脂肪（1. 5% -2% )、其他物 質(zhì)（1.0% -2.0% );其中，碳水化合物主要包括：淀粉（50% -63% )、單糖（1.8% -2% )、 纖維素（5% -6% )、半纖維素（β-葡聚糖80% -90%、戊聚糖10% -20% )。將麥芽按照 EBC (European Brewery Cenvention)法糖化處理之后，干物質(zhì)中75% -80 %的成分溶解于 糖化液中，并水解得到很多碳水化合物，包括麥芽糖、糊精、葡萄糖等，同時(shí)也得到可溶性的 含氮物質(zhì)、氨基氮、樹膠及部分無機(jī)物。另一方面，麥芽成本低、來源廣泛、容易獲取，更有利 于微生物培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)。
[0013] 本發(fā)明中，糖化后的麥芽汁使用糖度儀測(cè)定其含糖量，所述的麥芽汁的含量均以 麥芽汁中糖分的含量來計(jì)。
[0014] 作為優(yōu)選，以重量百分比計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：3. 5~4. 5%的麥芽汁和1. 5~ 2. 3%的酵母浸出粉。
[0015] 發(fā)酵培養(yǎng)基的pH會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞形態(tài)及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用情況， 作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為5~6。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選，以重量百分比計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：麥芽汁3. 5~4. 5%，酵母浸 出粉 0· 8 ~2. 8%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB10.00 5%，ρΗ5· 40。
[0017] 更優(yōu)選，以重量百分比計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽汁4. 10%，酵母浸出粉1.8%， KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB10.00 5%，ρΗ5· 40〇
[0018] 所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：28°C下培養(yǎng)6~8天。
[0019] 以重量百分比計(jì)，所述種子培養(yǎng)基包括馬鈴薯1%，葡萄糖2%，蛋白胨1.8%， KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB10.00 5%，pH 5. 5〇
[0020] 種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)的條件為：28°C下培養(yǎng)7~9天。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0022] 本發(fā)明采用以麥芽汁為碳源、酵母浸出粉為氮源的培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)靈 芝菌體，可實(shí)現(xiàn)靈芝菌絲產(chǎn)量的最優(yōu)最大化，同時(shí)獲得盡可能多的活性物質(zhì)，顯著提高了發(fā) 酵液中靈芝三萜和多糖的產(chǎn)量，利于靈芝三萜的工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0023] 圖1為不同碳源對(duì)靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)生物量及胞內(nèi)三貓（Intracellular Triterpenoids，IT)產(chǎn)量的影響。
[0024] 圖2為不同麥芽汁濃度對(duì)靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)生物量及IT產(chǎn)量的影響。
[0025] 圖3為不同N源對(duì)靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)生物量及IT產(chǎn)量的影響。
[0026] 圖4為不同酵母浸出粉濃度對(duì)靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)生物量及IT產(chǎn)量的影響。
[0027] 圖5為不同發(fā)酵培養(yǎng)基pH對(duì)靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)生物量及IT產(chǎn)量的影響。
[0028] 圖6為麥芽汁與酵母浸出粉交互作用對(duì)菌絲生物量的影響（A :等值線圖；B :曲面 圖）。
[0029] 圖7為麥芽汁與酵母浸出粉交互作用對(duì)IT產(chǎn)量的影響（A :等值線圖；B :曲面圖）。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 1、培養(yǎng)基與溶液的配制
[0031] 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯 1%，葡萄糖 2%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. ISKVB10.00 5%，瓊脂 2%，121°C濕熱滅菌20min，VB1過濾除菌。
[0032] 種子液培養(yǎng)基：馬鈴薯1%，葡萄糖2%，蛋白胨1.8%，KH2P040. 3%，MgS040. 15%， VB10.00 5%，pH 5· 5,121°C 濕熱滅菌 20min，VB1 過濾除菌。
[0033] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2 %，蛋白胨1. 8 %，KH2PO4O. 3 %，MgSO4O. 15 %， VB10.00 5%，pH 5. 5,121°C濕熱滅菌20min，VB1S濾除菌（該培養(yǎng)基為優(yōu)化前的基礎(chǔ)培養(yǎng) 基）。
[0034] 麥芽汁制備：取啤酒制備所用小麥芽，按照European Brewery Cenvention (EBC) 方法糖化麥芽，于72°C加熱IOmin以滅酶活，最后于3000rpm離心收集上清液，獲得麥芽 汁，利用手持糖度折光儀測(cè)定麥芽汁含糖量，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基中麥芽汁的含量均以含糖 量（％ )計(jì)。
[0035] 2、靈芝菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)方法
[0036] 各菌株經(jīng)斜面試管培養(yǎng)后，取4-5塊Icm2菌絲塊接種到種子培養(yǎng)液（250ml三角 瓶，裝液量100ml)，于28°C，180rpm培養(yǎng)8d后得靈芝液體種子液。然后按10% (v/v)接種 量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基（250ml三角瓶，裝液量100ml)，于28°C，180rpm培養(yǎng)7d。
[0037] 3、菌絲生物量（Mycelia Biomass)的測(cè)定
[0038] 將菌株發(fā)酵液于2500 Xg離心25min，收集菌絲沉淀，并用蒸餾水洗滌、離心，重復(fù) 3次，于60°C干燥至恒重，計(jì)算各菌株的生物量（以菌絲體干重g/100ml發(fā)酵液計(jì)）。
[0039] 4、靈芝菌株液體發(fā)酵過程中三萜產(chǎn)量的測(cè)定
[0040] (1)胞內(nèi)三貓（Intracellular Triterpenoids IT)的測(cè)定：
[0041] 采用超聲波提取方法：靈芝菌絲經(jīng)離心、收集、烘干至恒重后，取適量菌絲按 lg/50ml加入95% (v/v)乙醇并用細(xì)胞破碎儀破碎，于75°C，400W下提取lh，并重復(fù)一次， 合并上清液，定容后待測(cè)。其IT含量（mg/g)采用香草醛-高氯酸方法測(cè)定。
[0042] IT 產(chǎn)量（mg/100ml) = IT 含量（mg/g) X 菌絲生物量（g/100ml) (1)
[0043] 香草醛-高氯酸測(cè)定方法：取待測(cè)樣品溶液或樣品稀釋液0.1 ml于試管中，60°C加 熱揮干溶劑，再加5% (m/v)香草醛冰醋酸溶液0. 2ml，高氯酸0. 5ml，混勻后于60°C水浴中 保溫20min，取出后置于冷水中15min，最后加入冰醋酸5ml，于550nm下測(cè)定吸光值。
[0044] (2)胞外三貓（Extracellular