一種與α-鵝膏毒肽特異結(jié)合的核酸適配體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種與α -鵝膏毒肽特異結(jié)合的核酸適配體及應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸適配體是一類能與靶分子特異性、高親和力結(jié)合的寡核苷酸分子（DNA或 RNA)，可通過SELEX技術(shù)，從特定的寡核苷酸庫中篩選得到。由于其具有靶分子范圍廣、分 子質(zhì)量小、免疫原性低、易于化學(xué)合成、改造和標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，核酸適配體在臨床診斷鑒定和 疾病治療等領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 鵝膏菌毒素（amanitin)是從毒蘑菇中分離出來的一種多肽類物質(zhì)，其中以α-鵝 膏毒肽的毒性最強(qiáng)（α-amanitin)。人若誤食含有α-鵝膏毒肽的鵝膏菌（Amanita)后， 輕者可產(chǎn)生腹瀉、腹痛、嘔吐，重者可出現(xiàn)幻覺、昏迷等多種癥狀，致死率較高。α -鵝膏毒 肽是從鵝膏菌中分離出來的一種八肽化合物，它是RNA聚合酶II的專一性抑制劑，能抑制 真核細(xì)胞RNA聚合酶II的活性，從而阻礙mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成，這也是引起鵝膏毒 素中毒，導(dǎo)致死亡的主要因素。因此，利用SELEX技術(shù)篩選α-鵝膏毒肽的特異性核酸適配 體，進(jìn)而及時(shí)、快速檢測出食用野生菌中是否含有鵝膏毒素，對于降低誤食蘑菇中毒及診斷 治療具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種與α -鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體，其核苷酸序 列如SEQ ID NO :1所示；該核酸適配體為單鏈DNA，由84個(gè)核苷酸組成，拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)為直鏈 狀；預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)具有突出的環(huán)和莖，存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能DG=-14. 901。
[0005] 本發(fā)明另一目的是將與α -鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體應(yīng)用在識別α -鵝 膏毒肽或在制備檢測α-鵝膏毒肽的試劑盒中。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 1、 α -鵝膏毒肽特異性核酸適配體（Ε06)的篩選、克隆、分離和測序 采用SELEX技術(shù)篩選出能夠與α -鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體群體，設(shè)計(jì)引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、分離和測序。利用酶聯(lián)寡核苷酸吸附試驗(yàn)（ELONA)進(jìn)行驗(yàn)證，得 到適配體Ε06,它能夠高親和力高特異性的結(jié)合α-鵝膏毒肽。配體接頭引物序列為： Aptamer Fw: GACATATTCAGTCTGACAGC;反向互補(bǔ)序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC;Aptamer Rv: GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互補(bǔ)序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所獲陽性單克隆進(jìn) 行核苷酸序列測定，測序結(jié)果表明與α-鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體（E06)由84個(gè) 核苷酸組成，其序列（5'端至3'端）為： tgacatattc agtctgacag cgtactgtcg actattgggc ggtatgggga caacattgcg ttgatggacg aatatcgtct agca ； 2、 核酸適配體（E06)單鏈DNA二級結(jié)構(gòu)表征 使用 MFOLD 軟件（http://mfold. rna. albany. edu/q=mfold/DNA_Folding-Form)對與 α -鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體E06單鏈DNA分子進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明，其 二級結(jié)構(gòu)具有突出的環(huán)和莖，存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能DG=-14. 901，顯示該結(jié)構(gòu) 具有較高的穩(wěn)定性；其二級結(jié)構(gòu)如下：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與a -鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述核酸適配體，其特征在于：其二級結(jié)構(gòu)具有突出的環(huán)和莖，存在 G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能DG=-14. 901。
3. 權(quán)利要求1所述核酸適配體在識別a-鵝膏毒肽或在制備檢測a-鵝膏毒肽的試劑 盒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用selex技術(shù)得到的能夠高親和力高特異性結(jié)合α-鵝膏毒肽的核酸適配體，該核酸適配體是一種單鏈DNA，由84個(gè)核苷酸組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其二級結(jié)構(gòu)含有突出的環(huán)和莖，存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能DG=-14.901；該核酸適配體通過酶聯(lián)寡核苷酸吸附試驗(yàn)?zāi)芴禺愋詸z測到α-鵝膏毒肽。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-113
【公開號】CN104862314
【申請?zhí)枴緾N201510234400
【發(fā)明人】韓芹芹, 喬璞, 宋玉竹, 張金陽, 陳強(qiáng)
【申請人】昆明理工大學(xué)
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月11日