一種地溝油的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及地溝油檢測，尤其是涉及一種地溝油的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] "地溝油"是指從下水道或者非法途徑獲取已經(jīng)油炸或者烹飪過并且廢棄的油性 殘?jiān)?，?jīng)過過濾、沉淀、加熱蒸發(fā)分離得到的油。也包括將劣質(zhì)、過期、腐敗了的動(dòng)物皮、肉、 內(nèi)臟經(jīng)過簡單加工提煉后生成的油脂。廣義的地溝油還包括餿水油、萬年油等廢棄食用油。 這些劣質(zhì)、有毒的地溝油部分流入很多飯店和普通家庭中，給社會(huì)和群眾健康帶來巨大的 危害。如果長期食用地溝油，會(huì)造成代謝紊亂、消化系統(tǒng)炎癥、生殖能力降低、心腦血管慢性 疾病等。而且地溝油中的重金屬和黃曲霉毒素對(duì)細(xì)胞和組織具有致畸、致瘤、致癌等風(fēng)險(xiǎn)。 為此，國家相關(guān)部門出臺(tái)一些措施（2010年3月18日，國家食品藥品監(jiān)督管理局辦公室發(fā) 布《關(guān)于嚴(yán)防"地溝油"流入餐飲服務(wù)環(huán)節(jié)緊急通知》（食藥監(jiān)辦食〔2010〕25號(hào)）因此，快 速鑒別周圍的食用油的品質(zhì)，對(duì)打擊地溝油的擴(kuò)散起很大作用。
[0003]當(dāng)前，地溝油與正規(guī)的食用油經(jīng)過一定比例勾兌，如果通過一般的感官判斷，很難 分辨出地溝油與普通一級(jí)油的差別。國內(nèi)目前具有快速而且快捷地較大批量檢測地溝油的 方法不多。一般都是應(yīng)用地溝油的獨(dú)特物理和化學(xué)性質(zhì)來判別，但是由于地溝油往往經(jīng)過 兌換一定比例的一級(jí)食用油，給地溝油的鑒定帶來一些困難，影響地溝油成分的準(zhǔn)確判定， 特別是加入的地溝油比較少時(shí)，就比較容易誤判。
[0004]幾種比較常用的檢測地溝油的方法如下：
[0005]常規(guī)理化檢測技術(shù)。電導(dǎo)率測定法，酸值檢測和過氧化值與碘價(jià)的測定。電導(dǎo)率 測定法被運(yùn)用的最廣泛。地溝油在不斷的提煉和處理過程中，摻入了很多金屬元素，較合格 的食用油的含量高，因此地溝油的電導(dǎo)率高于合格食用油的電導(dǎo)率。彭進(jìn)等測定潲水油經(jīng) 提取后水相平均電導(dǎo)率達(dá)到119us/cm，潲水油與精練菜籽油混合后，潲水油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與 電導(dǎo)率呈線形關(guān)系，潲水油與合格食用油電導(dǎo)率測定結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不過地溝油 的添加量低于20%時(shí)，電導(dǎo)率測定法試驗(yàn)條件操作試驗(yàn)的顯著性與重復(fù)性就比較差。
[0006]色譜檢測技術(shù)。檢測指標(biāo)為油脂的脂肪酸組成、羰基化合物以及黃曲霉毒素、苯并 (a)芘等有毒物質(zhì)。黃軍等對(duì)黃曲霉毒素、苯并（a)芘以及總鉛總砷分別進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)即 使經(jīng)過3~4次充分提煉的地溝油，黃曲霉毒素、苯并（a)芘的含量仍然超標(biāo)10%~20%， 與合格油脂的含量差別明顯。此外，色譜法可選擇檢測指標(biāo)多，可以準(zhǔn)確、定量檢測痕量物 質(zhì)，效果好，試驗(yàn)成本、對(duì)儀器和操作者要求相對(duì)較高。
[0007] 光譜檢測技術(shù)。紫外可見分光光度法和熒光分析法、拉曼光譜檢測技術(shù)等。光譜 檢測技術(shù)具有快速、低成本、大量樣本檢測的優(yōu)勢。但是，光譜技術(shù)往往只是關(guān)注某個(gè)指標(biāo)， 具有局限性。而且對(duì)試驗(yàn)儀器條件、數(shù)據(jù)結(jié)果的分析的要求較高。所以，光譜檢測技術(shù)可以 作為一種參考指標(biāo)，不適合獨(dú)立應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供快速便捷的一種地溝油的檢測方法。
[0009] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0010] 1)對(duì)待檢測油提取DNA后，以磁珠富集核酸所提取的DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增動(dòng) 物特有基因片段；
[0011] 2)利用RBC BioscienceHF-16和相應(yīng)RBC抽取核酸試劑提取全基因組DNA，根據(jù) 地溝油來源的動(dòng)物DNA設(shè)計(jì)特定引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的條帶，然后于2%的瓊脂糖凝膠電 泳，定性判斷是否有地溝油；
[0012] 3)PCR片段經(jīng)電泳后的條帶定性檢測地溝油檢測限采用對(duì)照品梯度稀釋方法來確 定。
[0013] 在步驟1)中，所述動(dòng)物特有基因片段可采用豬、牛、羊、雞、鴨的MY0D1的 保守區(qū)域；在篩選獲得動(dòng)物特有基因片段后，可利用primer 5. 0軟件，設(shè)計(jì)特異性 引物；所述動(dòng)物特有基因片段的核苷酸序列為MY0D1 ;PCR時(shí)所用的上游引物為： GTCAACGAGGCCTTCGAGAC(SEQ ID N0:1)，下游引物為：GATGGCGITGCGCAGGAT(SEQ ID N0:2)。
[0014] 本發(fā)明所述檢測地溝油的方法用于定性檢測食用油中的地溝油的用途。與當(dāng)前的 檢測技術(shù)相比，本發(fā)明采用RBC Bioscience HF-16經(jīng)過特異修飾包被的磁珠富集核酸抽取 儀結(jié)合相應(yīng)的試劑RBC MagCore試劑盒高效快速的提取核酸模板，并利用特異性引物擴(kuò)增 目的基因。能自動(dòng)化、較大批量檢測、操作簡單、用時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。可以快速簡單鑒定食用油 中是否摻有地溝油。本發(fā)明特異性好、方便、快速，結(jié)合磁珠分離核酸技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)以達(dá)到自動(dòng)化提取和方便檢測的目的。
[0015] 由于地溝油包括各種潲水和劣質(zhì)、過期、腐敗了的動(dòng)物皮、肉、內(nèi)臟經(jīng)過簡單加工 提煉后生成的油脂。地溝油中就含有大量這樣的動(dòng)物性油脂，那么就具有相應(yīng)的核酸成分， 而目前上的合格食用油多為植物性油，不存在動(dòng)物性成分。本發(fā)明利用磁珠富集核酸的儀 器，高效快速地提取地溝油里難分離的核酸模板并進(jìn)行PCR后的電泳。
[0016] 本發(fā)明利用RBC Bioscience HF-16核酸抽取儀結(jié)合相應(yīng)的試劑RBC MagCore試劑 盒高效快速的提取核酸。磁珠法核酸提取，具有傳統(tǒng)DNA提取方法無法比擬的優(yōu)勢，主要體 現(xiàn)在：①能夠進(jìn)行自動(dòng)化、較大批量操作，使得食品或藥檢部門較大批量的檢測提供有力的 支持；②操作簡單、用時(shí)短，整個(gè)提取流程只有幾步，大多可以在lh左右完成；③安全無毒， 不使用傳統(tǒng)方法中的苯、氯仿等有毒試劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的傷害減少到最少，完全符合現(xiàn) 代環(huán)保理念；④磁珠與核酸的特異性結(jié)合使得提取的核酸純度高、濃度大。
【附圖說明】
[0017] 圖1為實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增條件。
[0018] 圖2為應(yīng)用磁珠法提取地溝油中MY0D1基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增曲線。
[0019] 圖3為應(yīng)用普通核酸提取試劑盒提取地溝油中MY0D1基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò) 增曲線。
[0020] 圖4為2%瓊脂凝膠電泳MY0D1PCR產(chǎn)物。第一孔為Marker，以下依次為：陽性對(duì) 照，運(yùn)用磁珠分離的核酸為模板的PCR電泳的6個(gè)樣本（1~6)，空白孔，陽性對(duì)照，運(yùn)用普 通方法分離的核酸為模板的PCR電泳的6個(gè)樣本（9~14)。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下列舉具體實(shí)施例以進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0022] 1)磁珠法提取模擬地溝油中DNA:
[0023] 1.每一份模擬地溝油中添加1ml的Food Lysis
[0024] 2. 6〇度加熱3〇min，lOOOrpm，冷卻至室溫。
[0025] 3. 2500g 離心 5min。
[0026] 4.轉(zhuǎn)移上清液700 y L至含有500 y L的氯仿中。混勻后14000g離心15min。
[0027] 5.取上相600 y L，均分2份，一份用于磁珠分離，另一份用普通提取方法提取核 酸。
[0028] 2)檢測：用普通qPCR進(jìn)行檢測，進(jìn)一步的，通過2%的凝膠電泳。
[0029] 3)檢測結(jié)果：用磁珠分離的模擬地溝油的核酸的方法比用普通核酸提取方法效 率高，快捷。本實(shí)驗(yàn)中用qPCR得到驗(yàn)證。看到在同樣的起始MY0D1模板濃度，經(jīng)過不同的 提取方法，可以看到，圖2中的Ct值比圖3中大，所以用磁珠分離的核酸濃度高。進(jìn)一步， 用電泳跑膠得到驗(yàn)證?？梢钥吹角懊娴?個(gè)樣本（用磁珠分離的）比后面6個(gè)樣本（用普 通核酸提取方法）的PCR產(chǎn)物多。
[0030] 4)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測（參見表1)。
[0031]表1
[0032]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種地溝油的檢測方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 對(duì)待檢測油提取DNA后，以磁珠富集核酸所提取的DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增動(dòng)物特 有基因片段； 2) 利用RBC Bioscience HF-16和相應(yīng)RBC抽取核酸試劑提取全基因組DNA，根據(jù)地溝 油來源的動(dòng)物DNA設(shè)計(jì)特定引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的條帶，然后于2%的瓊脂糖凝膠電泳，定 性判斷是否有地溝油； 3. PCR片段經(jīng)電泳后的條帶定性檢測地溝油檢測限采用對(duì)照品梯度稀釋方法來確定。
2. 如權(quán)利要求1所述一種地溝油的檢測方法，其特征在于在步驟1)中，所述動(dòng)物特有 基因片段采用豬、牛、羊、雞、鴨的MYODl的保守區(qū)域。
3. 如權(quán)利要求1所述一種地溝油的檢測方法，其特征在于在步驟1)中，在篩選獲得動(dòng) 物特有基因片段后，利用primer 5. 0軟件，設(shè)計(jì)特異性引物。
4. 如權(quán)利要求1所述一種地溝油的檢測方法，其特征在于在步驟1)中，所述動(dòng)物特有 基因片段的核苷酸序列為MYODl。
5. 如權(quán)利要求1所述一種地溝油的檢測方法，其特征在于在步驟1)中， PCR時(shí)所用的上游引物為：GTCAACGAGGCCTTCGAGAC(SEQ ID NO: 1)，下游引物為： GATGGCGTTGCGCAGGAT(SEQ ID N0:2)〇
【專利摘要】一種地溝油的檢測方法，涉及地溝油檢測。1)對(duì)待檢測油提取DNA后，以磁珠富集核酸所提取的DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增動(dòng)物特有基因片段；2)利用RBC Bioscience HF-16和相應(yīng)RBC抽取核酸試劑提取全基因組DNA，根據(jù)地溝油來源的動(dòng)物DNA設(shè)計(jì)特定引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的條帶，然后于2％的瓊脂糖凝膠電泳，定性判斷是否有地溝油；3)PCR片段經(jīng)電泳后的條帶定性檢測地溝油檢測限采用對(duì)照品梯度稀釋方法來確定?？煽焖俸唵舞b定食用油中是否摻有地溝油；特異性好、方便、快速，結(jié)合磁珠分離核酸技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以達(dá)到自動(dòng)化提取和方便檢測的目的，操作簡單、用時(shí)短。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104846105
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510288785
【發(fā)明人】曾驥孟, 蔡良良, 林輝暖
【申請(qǐng)人】廈門大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月29日