幽門螺旋桿菌分型與耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測(cè)試劑盒，尤其涉及一種幽門螺旋桿菌分型與耐藥突變基因檢 測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 幽門螺桿菌（Helicobacter Pylori，簡(jiǎn)稱HP)，由年巴里?馬歇爾（Barry J. Marshall)和羅賓?沃倫（J. Robin Warren)于1983年首次從胃炎患者的胃黏膜中分離 得到。研宄顯示由HP引起的炎癥可導(dǎo)致萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生，最終演變?yōu)?胃腺癌。
[0003] HP的全基因序列已經(jīng)測(cè)出，其中尿素酶基因有四個(gè)開放性讀框，分別是UreA、 UreB、UreC和UreD。UreA和UreB編碼的多肽與尿素酶結(jié)構(gòu)的兩個(gè)亞單位結(jié)構(gòu)相當(dāng)。幽門 螺桿菌的尿素酶極為豐富，約含菌體蛋白的15%，活性相當(dāng)于變形桿菌的400倍。尿素酶催 化尿素水解形成"氨云"保護(hù)細(xì)菌在高酸環(huán)境下生存。
[0004] HP含有VacA和CagA兩種基因，分別編碼空泡毒素和細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白，根據(jù)這兩 種基因的表達(dá)情況，又將HP菌株分成兩種主要類型：1型和II型。I型含有CagA和VacA 基因并表達(dá)其中一種或兩種蛋白，即VacA基因中間區(qū)域型M1、M2與信號(hào)序列型S1、S2的組 合（Sl/Ml、S1/M2、S2/M1、S2/M2)需與CagA基因同時(shí)存在，I型與胃疾病密切相關(guān)。II型 不含CagA基因，不表達(dá)兩種蛋白，其毒性較弱，感染后一般無明顯臨床癥狀。
[0005] 根據(jù)第四次全國幽門螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告，檢測(cè)Hp感染的方法有侵入性和 非侵入性兩類。侵入性方法依賴胃鏡活檢，包括快速尿素酶試驗(yàn)（RUT)、胃黏膜直接涂片染 色鏡檢、胃黏膜組織切片染色鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、基因檢測(cè)方法。而非侵入性檢測(cè)方法不依賴 內(nèi)鏡檢查，包括13C或14C-尿素呼氣試驗(yàn)（UBT)、糞便Hp抗原（HpSA)檢測(cè)（依檢測(cè)抗體可 分為單抗和多抗兩類）等。以上的檢測(cè)方法僅限于檢出是否有HP感染，均未對(duì)HP進(jìn)行分 型檢測(cè)。
[0006] 根據(jù)第四次全國幽門螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)篩選出5個(gè)常用于治 療的抗生素（克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林、氟喹諾酮類、四環(huán)素）。根據(jù)查找的文獻(xiàn)資料總 結(jié)出上述抗生素耐藥基因和耐藥位點(diǎn)如表1。
[0007] 表1各治療藥物耐藥突變位點(diǎn)
[0008]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于幽門螺旋桿菌分型與耐藥突變基因檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述試劑 盒包括：用于幽門螺旋桿菌分型與耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條和PCR反應(yīng)液；所述PCR 反應(yīng)液包括：PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液II、PCR反應(yīng)液III和PCR反應(yīng)液IV ; 所述PCR反應(yīng)液I包括分型擴(kuò)增引物： 引物 VacAS-F2 :SEQ ID NO :1 ; 引物 VacAS-R2 :SEQ ID NO :2 ; 引物 VacAM-F2 :SEQ ID NO :3 ; 引物 VacAM-R2 :SEQ ID NO :4 ; 所述PCR反應(yīng)液II包括分型擴(kuò)增引物： 引物 UreA-F2 :SEQ ID NO :5 ; 引物 UreA-R2 :SEQ ID NO :6 ; 引物 CagA-F2 :SEQ ID NO :7 ; 引物 CagA-R2 :SEQ ID NO :8 ; 所述PCR反應(yīng)液III包括耐藥突變擴(kuò)增引物： 引物 16S-F2 :SEQ ID NO :9 ; 引物 16S-R2 :SEQ ID NO :10 ; 引物 rdxA-F2 :SEQ ID NO :11 ; 引物 rdxA-R2 :SEQ ID NO :12 ; 引物 PBP1-F2 :SEQ ID NO :13 ; 引物 PBP1-R2 :SEQ ID NO :14 ; 所述PCR反應(yīng)液IV包括耐藥突變擴(kuò)增引物： 引物 23S-F2 :SEQ ID NO :15 ; 引物 23S-R2 :SEQ ID NO :16 ; 引物 gyra-F2 :SEQ ID NO :17 ; 引物 gyra-R2 :SEQ ID NO :18 ; 所述PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液II、PCR反應(yīng)液III和PCR反應(yīng)液IV還分別含有內(nèi)控引物 1對(duì)： 引物 0 -gl〇bin-F2 :SEQ ID NO :19 ; 引物 0-gl〇bin-R2:SEQ ID N0:20。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于幽門螺旋桿菌分型與耐藥突變基因檢測(cè)的試劑盒，其特 征在于，所述核酸膜條包括用于幽門螺旋桿菌分型檢測(cè)的分型膜條和用于幽門螺旋桿菌耐 藥檢測(cè)的耐藥膜條； 所述分型膜條包括基底和固定于所述基底上的核酸探針，所述核酸探針包括： 用于幽門螺旋桿菌分型檢測(cè)的核酸探針，其堿基序列如：SEQ ID NO :21-26 ; 內(nèi)參照核酸探針，其堿基序列如：SEQ ID NO :50 ; 所述耐藥膜條包括基底和固定于所述基底上的核酸探針，所述核酸探針包括： 用于幽門螺旋桿菌耐藥突變檢測(cè)的核酸探針，其堿基序列如：SEQ ID NO :27-49;內(nèi)參 照核酸探針，其堿基序列如：SEQ ID NO :50。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于幽門螺旋桿菌分型與耐藥突變基因檢測(cè)的試劑盒，其特
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因檢測(cè)試劑盒，尤其涉及一種幽門螺旋桿菌分型與耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：用于幽門螺旋桿菌分型與耐藥突變基因檢測(cè)的核酸膜條和PCR反應(yīng)液；所述PCR反應(yīng)液包括：PCR反應(yīng)液Ⅰ、PCR反應(yīng)液Ⅱ、PCR反應(yīng)液Ⅲ和PCR反應(yīng)液Ⅳ；所述PCR反應(yīng)液還分別含有內(nèi)控引物1對(duì)。本發(fā)明的幽門螺旋桿菌分型與耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒能在一次試驗(yàn)中，區(qū)分HP的2個(gè)分型，并檢測(cè)與5個(gè)治療藥物耐藥相關(guān)的9個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的15種突變類型，用VacA基因和CagA基因進(jìn)行分型，為病情的判斷提供參考依據(jù)；耐藥突變檢測(cè)的突變類型更多更全面，可以快速、全面地評(píng)價(jià)患者感染的HP發(fā)生基因耐藥的情況。
【IPC分類】C12Q1-04, C12Q1-68, C12R1-01
【公開號(hào)】CN104846097
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510263242
【發(fā)明人】裘惠良, 鄭銀娜, 鄒耀東, 田潔
【申請(qǐng)人】杭州千基生物科技有限公司, 杭州美聯(lián)生物科技有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月21日