一種水中噬菌體分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水中噬菌體分離方法，包括如下步驟：(1)正電荷硅膠顆粒的制備；(2)洗脫液的配制；(3)噬菌體的分離，本發(fā)明的方法能夠高效的分離各種水環(huán)境如自來水、地表水和污水中的噬菌體，分離效率高，對水中極低濃度的噬菌體(100PFU/100L)的分離效率達到了70％。本方法具有操作簡便、快速及價格低廉等優(yōu)點，因此該方法將加速從水環(huán)境中分離新的噬菌體的速度，為噬菌體的應用提供幫助。
【專利說明】一種水中噬菌體分離方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物分離技術，特別是涉及一種水中噬菌體分離方法。

【背景技術】
[0002]噬菌體是感染細菌、放線菌或支原體等原核微生物的細菌病毒的總稱，它是病毒的一種。曬菌體的發(fā)現(xiàn)可追溯至100多年以前，1896年英國細菌學家Ernes Hankin首次報道了印度河水存在一種能通過瓷性濾器，熱不穩(wěn)定性的并具有強抗菌活性的物質，遺憾的是Hankin沒能繼續(xù)該方面的研究。直到1915年，英國微生物學家Frederick Twort首次在涂有金黃色葡萄球的培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)了透明斑，并將該現(xiàn)象進一步闡述為病毒感染的假說。加拿大微生物學家F6lix d’Herelle在1917年正式將該病毒命名為噬菌體。噬菌體結構簡單，僅由外面的衣殼蛋白和內部的核酸組成，其核酸物質可分為dsDNA、ssDNA、dsRNA和ssRNA。噬菌體的一個主要性能就是能夠專一的裂解其宿主菌，人們以此發(fā)現(xiàn)了噬菌體的廣泛用途，主要包括用于治療多重耐藥菌感染的噬菌體治療、滅活食品、水和植物中的致病菌的生物控制與噬菌體檢測等。
[0003]噬菌體在自然界中分布廣泛，幾乎有細菌生存的地方就存在相應的噬菌體，其數(shù)量達到1032，是細菌的10倍左右。由于噬菌體對宿主菌的專一裂解的特點，使得噬菌體的應用受到了限制，人們?yōu)榇硕l(fā)明了雞尾酒療法，這也就需要更多不同的噬菌體。但是，到目前為止，只有6000多株噬菌體被發(fā)現(xiàn)且進行了形態(tài)學的描述，這與自然界中存在的噬菌體實際數(shù)量存在著巨大差距。隨著噬菌體的廣泛應用，人們需要獲得更多的噬菌體，但是，新的噬菌體發(fā)現(xiàn)速度卻遠遠不能滿足這種迫切需求。
[0004]傳統(tǒng)的水中噬菌體分離方法所針對的水樣體積一般只有Ι-lOOOmL，因此很難分離到水中濃度較低的噬菌體。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種使用方便的，能處理大水樣的水中噬菌體分離方法。
[0006]本發(fā)明的技術方案概述如下:
[0007]一種水中噬菌體分離方法，包括如下步驟:
[0008](1)正電荷硅膠顆粒的制備
[0009]①按比例，室溫下稱取6_7g氯化鋁緩慢加入到950mL蒸餾水中使溶解；加入45mL、2M碳酸鈉水溶液，出現(xiàn)乳白色的Al (0H) 3凝膠，調節(jié)pH值至7.0-7.5，加水定容至1000mL ;在室溫下靜置18-24h ；
[0010]②將步驟①獲得的液體以llOOg離心10-30min后棄上清；向沉淀中加入0.14M氯化鈉水溶液至1000mL重懸沉淀，靜置18-24h ；
[0011]③重復步驟②2-4次，于121°C高壓滅菌20min，冷卻至常溫；
[0012]④取1200_1400g粒徑為150-300 μ m硅膠加入到步驟③獲得的液體中，邊加邊攪拌，使之充分混勻，置于50-100°C烤箱中烤干，得到正電荷硅膠顆粒；
[0013](2)洗脫液的配制
[0014]稱取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化鈉、30_40g甘氨酸和20_30g氫氧化鈉加蒸餾水至1L，加熱溶解，調節(jié)pH為10.2-10.5，在121°C下高壓滅菌20min ；
[0015](3)噬菌體的分離:
[0016]①在層析柱中加入適量滅菌蒸餾水，再加入正電荷硅膠顆粒不斷攪拌去除氣泡，通過蠕動泵以300-700mL/min速度將待測水樣從層析柱的頂部流過層析柱；
[0017]②當待測水樣全部流過層析柱后，用相當于正電荷硅膠顆粒質量3-4倍的洗脫液洗脫，收集洗脫流出液，調節(jié)pH為7.0-7.5 ;加入PEG6000使質量濃度為10% -15%并在攪拌下使PEG6000溶解，在常溫下靜置20-40min，12000-16000g離心20_40min，棄上清液，用0.1MpH = 7.0-7.5的PBS重懸沉淀并定容至lO-lOOmL得液體1，向液體1中加入10 X液體培養(yǎng)基，所述10X液體培養(yǎng)基的加入體積為液體1體積的1/10，得液體2 ；
[0018]③另取lmLlOX液體培養(yǎng)基加滅菌生理鹽水至10mL得IX液體培養(yǎng)基，將噬菌體的宿主菌接種至IX液體培養(yǎng)基中，30-37°C下培養(yǎng)18-24h ；
[0019]④取lmL步驟(3)③獲得的菌液接種至液體2中，30_37°C下培養(yǎng)18_24h，然后3000-4000g離心10-20min，收集上清液，取lmL上清液與100 μ L步驟(3)③獲得的菌液混勻后靜置5min，采用雙層平板法檢測上清液中是否有噬菌斑出現(xiàn)。
[0020]噬菌體的宿主菌為大腸埃希氏菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌0157: H7、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌或小腸結腸炎耶爾森菌。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0022]本發(fā)明的方法能夠高效的分離各種水環(huán)境如自來水、地表水和污水中的噬菌體，分離效率高，對水中極低濃度的噬菌體(10°PFU/100L)的分離效率達到了 70%。本方法具有操作簡便、快速及價格低廉等優(yōu)點，因此該方法將加速從水環(huán)境中分離新的噬菌體的速度，為噬菌體的應用提供幫助。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為顆粒掃描電鏡圖:a為硅膠顆粒，b正電荷硅膠顆粒。
[0024]圖2為硅膠顆粒和正電荷硅膠顆粒粒徑分布圖。

【具體實施方式】
[0025]為了使本領域的技術人員更好的理解本發(fā)明的技術方案，下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明所述技術方案作進一步的詳細說明。
[0026]實施例1
[0027]經檢測無大腸埃希氏菌噬菌體MS2的自來水(在本實施例簡稱為自來水)中加入大腸埃希氏菌曬菌體ms2的分離,包括如下步驟:
[0028](1)正電荷硅膠顆粒的制備
[0029]①室溫下稱取6.675g氯化鋁緩慢加入到950mL蒸餾水中使溶解；加入45mL、2M碳酸鈉水溶液，出現(xiàn)乳白色的Al (0H) 3凝膠，調節(jié)pH值至7.2，加水定容至lOOOmL ;在室溫下靜置24h ；
[0030]②將步驟①獲得的液體以llOOg離心15min后棄上清；向沉淀中加入0.14M氯化鈉水溶液至lOOOmL重懸沉淀，靜置24h ；
[0031]③重復步驟②3次，于121 °C高壓滅菌20min，冷卻至常溫；
[0032]④取1375g粒徑為270 μ m硅膠加入到步驟③獲得的液體中，邊加邊攪拌，使之充分混勻，置于60°C烤箱中烤干，得到正電荷硅膠顆粒；
[0033](2)洗脫液的配制
[0034]稱取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化鈉、37.5g甘氨酸和20g氫氧化鈉加蒸餾水至1L，加熱溶解，用0.lmol/L鹽酸溶液或0.lmol/L氫氧化鈉水溶液調節(jié)pH為10.2，在121°C下高壓滅菌20min ；
[0035](3)噬菌體的分離:
[0036]①在100L自來水中加入硫代硫酸納(每升水中加入0.5mL質量濃度為10%硫代硫酸鈉水溶液)以中和水中的余氯，然后在水樣接種1ml噬菌體MS2(10°PFU/100L)，并充分混勻得待測水樣；
[0037]在內徑為83.5mm、高為400mm的層析柱中加入1.5L滅菌蒸餾水，再加入800g正電荷硅膠顆粒不斷攪拌去除氣泡，通過蠕動泵以500mL/min速度將待測水樣從層析柱的頂部流過層析柱；
[0038]②當待測水樣全部流過層析柱后，用2800g的洗脫液洗脫，收集洗脫流出液，調節(jié)pH為7.2 ;加入PEG6000使質量濃度為13%并在攪拌下使PEG6000溶解，在常溫下靜置30min, 15000g離心30min,棄上清液,用0.1MpH = 7.2的PBS重懸沉淀并定容至50mL得液體1，向液體1中加入5mL10X的LB液體培養(yǎng)基，得液體2
[0039]③另取lmLlO X LB液體培養(yǎng)基加滅菌生理鹽水至10mL得1 X LB液體培養(yǎng)基，將噬菌體的宿主菌大腸埃希氏菌15597接種至1XLB液體培養(yǎng)基中，35°C下培養(yǎng)24h ；
[0040]④取lmL步驟(3)③獲得的菌液接種至液體2中，37°C下培養(yǎng)24h，然后4000g離心lOmin，收集上清液，取lmL上清液與100 μ L步驟(3)③獲得的菌液混勻后靜置5min，采用雙層平板法檢測上清液中有噬菌斑出現(xiàn)。
[0041]實施例2
[0042]河水中大腸埃希氏菌15597噬菌體的分離，包括如下步驟:
[0043](1)正電荷硅膠顆粒的制備
[0044]①室溫下稱取6g氯化鋁緩慢加入到950mL蒸餾水中使溶解；加入45mL、2M碳酸鈉水溶液，出現(xiàn)乳白色的Al (0H)3凝膠，調節(jié)pH值至7.0，加水定容至1000mL ;在室溫下靜置18h ；
[0045]②將步驟①獲得的液體以llOOg離心lOmin后棄上清；向沉淀中加入0.14M氯化鈉水溶液至1000mL重懸沉淀，靜置18h ；
[0046]③重復步驟②2次，于121°C高壓滅菌20min，冷卻至常溫；
[0047]④取1200g粒徑為150 μ m硅膠加入到步驟③獲得的液體中，邊加邊攪拌，使之充分混勻，置于50°C烤箱中烤干，得到正電荷硅膠顆粒；
[0048](2)洗脫液的配制
[0049]稱取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化鈉、30g甘氨酸和30g氫氧化鈉加蒸餾水至1L，加熱溶解，調節(jié)pH為10.5，在121°C下高壓滅菌20min ；
[0050](3)噬菌體的分離
[0051]①在內徑為83.5mm、高為400mm的層析柱中加入1.5L滅菌蒸懼水,再加入800g正電荷硅膠顆粒不斷攪拌去除氣泡，通過蠕動泵以300mL/min速度將100L待測水樣河水從層析柱的頂部流過層析柱；
[0052]②當待測水樣全部流過層析柱后，用2400g的洗脫液洗脫，收集洗脫流出液，調節(jié)pH為7.0 ;加入PEG6000使質量濃度為10%，在攪拌下使PEG6000溶解，在常溫下靜置20min，12000g離心40min，棄上清液，用0.1MpH = 7.0的PBS重懸沉淀并定容至10mL得液體1，向液體1中加入lmLlOXLB液體培養(yǎng)基，得液體2 ；
[0053]③另取lmLlO X LB液體培養(yǎng)基加滅菌生理鹽水至10mL得1 X LB液體培養(yǎng)基，將噬菌體的宿主菌(大腸埃希氏菌15597)接種至1XLB液體培養(yǎng)基中，30°C下培養(yǎng)24h ；
[0054]④取lmL步驟(3)③獲得的菌液接種至液體2中，30°C下培養(yǎng)18h，然后3000g離心20min，收集上清液，取lmL上清液與100 μ L步驟(3)③獲得的菌液混勻后靜置5min，采用雙層平板法檢測上清液中有噬菌斑出現(xiàn)。
[0055]實施例3
[0056]污水中大腸埃希氏菌15597噬菌體的分離，包括如下步驟:
[0057](1)正電荷硅膠顆粒的制備
[0058]①按比例，室溫下稱取7g氯化鋁緩慢加入到950mL蒸餾水中使溶解；加入45mL、2M碳酸鈉水溶液，出現(xiàn)乳白色的Al (OH) 3凝膠，調節(jié)pH值至7.5，加水定容至lOOOmL ;在室溫下靜置20h ；
[0059]②將步驟①獲得的液體以llOOg離心30min后棄上清；向沉淀中加入0.14M氯化鈉水溶液至1000mL重懸沉淀，靜置20h ；
[0060]③重復步驟②4次，于121°C高壓滅菌20min，冷卻至常溫；
[0061]④取1400g粒徑為300 μ m硅膠加入到步驟③獲得的液體中，邊加邊攪拌，使之充分混勻，置于100°c烤箱中烤干，得到正電荷硅膠顆粒；
[0062](2)稱取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化鈉、40g甘氨酸和20g氫氧化鈉加蒸餾水至1L，加熱溶解，調節(jié)pH為10.2，在121 °C下高壓滅菌20min ；
[0063](3)噬菌體的分離:
[0064]①在內徑為83.5mm、高為400mm的層析柱中加入1.5L滅菌蒸懼水,再加入800g正電荷硅膠顆粒不斷攪拌去除氣泡，通過蠕動泵以700mL/min速度將100L污水從層析柱的頂部流過層析柱；
[0065]②當待測水樣全部流過層析柱后，用3200g洗脫液洗脫，收集洗脫流出液，調節(jié)pH為7.5 ;加入PEG6000使質量濃度為15%并在攪拌下使PEG6000溶解，在常溫下靜置40min，16000g離心20min，棄上清液，用0.1MpH = 7.5的PBS重懸沉淀并定容至100mL得液體1，向液體1中加入10mL10XLB液體培養(yǎng)基，所述10XLB液體培養(yǎng)基的加入體積為液體1體積的1/10，得液體2 ;
[0066]③另取lmLlO X LB液體培養(yǎng)基加滅菌生理鹽水至10mL得1 X LB液體培養(yǎng)基，將噬菌體的宿主菌大腸埃希氏菌15597接種至1XLB液體培養(yǎng)基中，37°C下培養(yǎng)18h ；
[0067]④取lmL步驟(3)③獲得的菌液接種至液體2中，30°C下培養(yǎng)20h，然后3000g離心15min，收集上清液，取lmL上清液與100 μ L步驟(3)③獲得的菌液混勻后靜置5min，采用雙層平板法檢測上清液中有噬菌斑出現(xiàn)。
[0068]實施例4
[0069]河水中沙門氏菌50001噬菌體的分離
[0070]將沙門氏菌50001替換實施例2中的大腸埃希氏菌，其它步驟同實施例2，檢測出河水中有沙門氏菌50001噬菌體的噬菌斑出現(xiàn)。
[0071]實施例5
[0072]河水中大腸埃希氏菌0157: H721530噬菌體的分離
[0073]將大腸埃希氏菌0157: H721530替換實施例2中的大腸埃希氏菌，其它步驟同實施例2，檢測出河水中有大腸埃希氏菌0157: H721530噬菌體的噬菌斑出現(xiàn)。
[0074]實施例6
[0075]河水中金黃色葡萄球菌6538噬菌體的分離
[0076]將金黃色葡萄球菌6538替換實施例2中的大腸埃希氏菌，其它步驟同實施例2，檢測出河水中有金黃色葡萄球菌6538噬菌體的噬菌斑出現(xiàn)。
[0077]實施例7
[0078]河水中糞鏈球菌32221噬菌體的分離
[0079]將糞鏈球菌32221替換實施例2中的大腸埃希氏菌，其它步驟同實施例2，檢測出河水中有糞鏈球菌32221噬菌體的噬菌斑出現(xiàn)。
[0080]實施例8
[0081]河水中志賀氏菌51424噬菌體的分離
[0082]將志賀氏菌51424替換實施例2中的大腸埃希氏菌，其它步驟同實施例2，檢測出河水中有有志賀氏菌51424噬菌體的噬菌斑出現(xiàn)。
[0083]實施例9
[0084]河水中副溶血性弧菌20025噬菌體的分離
[0085]將副溶血性弧菌20025替換實施例2中的大腸埃希氏菌，其它步驟同實施例2，檢測出河水中有副溶血性弧菌20025噬菌體的噬菌斑出現(xiàn)。
[0086]實施例10
[0087]河水中小腸結腸炎耶爾森菌52301噬菌體的分離
[0088]將小腸結腸炎耶爾森菌52301替換實施例2中的大腸埃希氏菌，其它步驟同實施例2，檢測出河水中有小腸結腸炎耶爾森菌52301噬菌體的噬菌斑出現(xiàn)。
[0089]實施例11
[0090]河水中多種噬菌體的分離
[0091]將宿主菌大腸埃希氏菌15597、大腸埃希氏菌0157: H721530和沙門氏菌50001各取lmL替代實施例2中的大腸埃希氏菌，其它步驟同實施例2，檢測檢測出河水中有大腸埃希氏菌15597噬菌體的噬菌斑出現(xiàn)、大腸埃希氏菌0157: H721530噬菌體的噬菌斑出現(xiàn)、沙門氏菌50001噬菌體的噬菌斑出現(xiàn)。
[0092]實驗證明，本發(fā)明的方法在其它檢測條件不變的情況下，僅需更換宿主菌，就有可能分離到相應的噬菌體。
[0093]本發(fā)明實施例的描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構思下的變化和修改，應屬本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種水中噬菌體分離方法，其特征包括如下步驟: (1)正電荷硅膠顆粒的制備 ①按比例，室溫下稱取6-7g氯化鋁緩慢加入到950mL蒸餾水中使溶解；加入45mL、2M碳酸鈉水溶液，出現(xiàn)乳白色的Al (OH)3凝膠，調節(jié)pH值至7.0-7.5，加水定容至100mL ;在室溫下靜置18-24h ； ②將步驟①獲得的液體以IlOOg離心10-30min后棄上清；向沉淀中加入0.14M氯化鈉水溶液至100mL重懸沉淀，靜置18-24h ； ③重復步驟②2-4次，于121°C高壓滅菌20min，冷卻至常溫； ④取1200-1400g粒徑為150-300μ m硅膠加入到步驟③獲得的液體中，邊加邊攪拌，使之充分混勻，置于50-100°C烤箱中烤干，得到正電荷硅膠顆粒； (2)洗脫液的配制 稱取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化鈉、30-40g甘氨酸和20_30g氫氧化鈉加蒸餾水至1L，加熱溶解，調節(jié)pH為10.2-10.5，在121°C下高壓滅菌20min ； (3)噬菌體的分離: ①在層析柱中加入適量滅菌蒸餾水，再加入正電荷硅膠顆粒不斷攪拌去除氣泡，通過蠕動泵以300-700mL/min速度將待測水樣從層析柱的頂部流過層析柱； ②當待測水樣全部流過層析柱后，用相當于正電荷硅膠顆粒質量3-4倍的洗脫液洗脫，收集洗脫流出液，調節(jié)PH為7.0-7.5 ;加入PEG6000使質量濃度為10% -15%并在攪拌下使PEG6000溶解，在常溫下靜置20-40min，12000-16000g離心20_40min，棄上清液，用0.1MpH = 7.0-7.5的PBS重懸沉淀并定容至1-1OOmL得液體1，向液體I中加入1X液體培養(yǎng)基，所述1X液體培養(yǎng)基的加入體積為液體I體積的1/10，得液體2 ； ③另取ImLlOX液體培養(yǎng)基加滅菌生理鹽水至1mL得IX液體培養(yǎng)基，將噬菌體的宿主菌接種至IX液體培養(yǎng)基中，30-37°C下培養(yǎng)18-24h ； ④取ImL步驟(3)③獲得的菌液接種至液體2中，30-37°C下培養(yǎng)18_24h，然后3000-4000g離心10-20min，收集上清液，取ImL上清液與100 μ L步驟(3)③獲得的菌液混勻后靜置5min，采用雙層平板法檢測上清液中是否有噬菌斑出現(xiàn)。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種水中噬菌體分離方法,其特征是所述噬菌體的宿主菌為大腸埃希氏菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌0157: H7、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌或小腸結腸炎耶爾森菌。
【文檔編號】C12R1/92GK104312984SQ201410593832
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權日:2014年10月29日
【發(fā)明者】諶志強, 李君文, 王新為, 金敏, 邱志剛, 楊棟 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所